专利名称：用于修复石油污染土壤的微生物的固定化方法
技术领域：
本发明涉及一种用于修复石油污染土壤的微生物的固定化方法，该方法属于微生物固定化技术，具体地说是一种用于修复石油污染土壤的固定化微生物的固定化方法。
背景技术：
石油污染土壤是石油及石化企业的重要污染之一，其中的石油污染物对人体及环境具有很高的毒害作用。国内外石油污染土壤的处理方法主要有焚烧法、填埋法、堆放法以及生物修复法等。微生物修复技术的核心是高效降解菌对石油污染物的降解作用，降解过程使污染物的成分趋向于更复杂，一些次生代谢物和中间降解产物的毒性更大，游离微生物修复作用的不足就逐渐显现出来，如单位体积内有效降解菌浓度低、与土著菌竞争处于弱势、抗毒 性侵害能力差等。而微生物固定化技术可以克服这些缺点和弊端，使修复效果得到大大改
盡
口 ο微生物固定化技术是20世纪80年代兴起的一种新型生物技术，是指将游离的细胞(微生物)或酶定位于限定的空间区域内，并使其保持活性且能反复使用的技术。尽管微生物固定化技术被广泛用于修复受污染的流体介质(如废水)和半流体介质(如泥浆)环境中，但将其应用于修复受石油污染的非流体介质(如土壤)的研究，国内外报道较少。限制固定化微生物在土壤修复中应用的主要原因是土壤非流体介质本身所具有的复杂性和特殊性，给该技术提出了许多不同于在流体介质中应用固定化技术时所面临的科学问题，如固定化技术本身存在着不足，如未开发出适用于非流体介质的固定化技术，未开发出广谱性的固定化技术，尚未解决混合菌的固定化问题，而且缺乏对固定化颗粒的环境安全性评价和对固定化过程中环境因子调控的系统研究；固定化微生物颗粒的载体选择，如何克服在土壤中固定化颗粒的不可回收性和污染物浓度的非均质性对固定化颗粒造成的冲击；如何保证吸附法制备的固定化微生物的菌浓度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提出一种用于修复石油污染土壤的微生物的固定化方法，以解决目前土壤修复过程中的高成本低效率、菌浓不足、引入二次污染这些不足；且天然植物材料可以作为土壤的疏松剂、为微生物修复土壤提供营养物质，为废弃材料的资源化利用提供一条有效的途径。本发明解决其技术问题所采取的技术方案是用秸杆材料做载体，在最佳吸附时间、温度、载体量的条件下，将微生物吸附在秸杆载体上进行固定化，具体按以下步骤实现I.筛选高效石油降解菌从受石油污染的土壤中筛选石油降解菌，得到一株降解率为23%的单菌SM-3，该菌为杆状菌，测定该菌的生长曲线，该菌株的对数生长期为5-16h，稳定期为16_25h ；
2.以胜利原油为反应底物，测定该原油的标准曲线，用以计算降解率；3.选择秸杆材料为固定化载体，将秸杆粉碎，过80目筛。4.取粉碎后的秸杆材料3%-5% (V/V)压实后装入一定体积的反应釜中，用121 V高压水蒸汽灭菌20min，然后将用牛肉膏蛋白胨液体培养基活化16h后的密度为1X1010-5X1010个/mL的菌液SM-3按20% (V/V)接到反应釜中，于30 40°C恒温固定12 24h ；固定化所用到的菌为SM-3，将该菌用牛肉膏蛋白胨液体培养基培养至对数生长期和稳定期交界点(16h)，其游离状态下对原油的降解率为23% ；所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方为NaCl 1% (m/m),蛋白胨1% (m/m),牛肉膏O. 5% (m/m)和一定体积的蒸馏水混合均匀，以pH试纸为指示，用NaOH或盐酸调节调节ρΗ7· 0,121°C水蒸气灭菌20min。
5.把固定了菌的3% -5% (V/V)载体连带未被固定的菌液一起转移到离心杯中，在1000r/min下离心IOmin,倒掉上层菌液,将下层载体无菌操作完全转移至事先准备好的原油培养基中，30°C恒温降解7d，降解率可达到60%，比游离菌提高近40% ；所述原油培养基的配制方法是先在一定体积的反应釜中称取O. 4% (m/m)左右的原油，记录准确质量，再量取20% (V/V)基础无机盐培养基至称好原油的反应釜中，本底油浓度约为10000mg/L ;基础无机盐培养基的配方为NaCl 0. 5% (m/m),MgSO4 ·7Η20 0. 025%(m/m), (NH4)2SO4O. 1% (m/m),NaNO3O. 2% (m/m)，K2HPO4 ·3Η20 1% (m/m),KH2PO4O. 4% (m/m)和一定体积的蒸馏水混合均匀，以pH试纸为指示，用NaOH或盐酸调节pH至7-7. 5，121 °C水蒸气灭菌20min。6.对固定化前的树叶进行BET表征，对固定化前和固定微生物后降解前后的树叶进行电镜扫描，得到该载体的内部结构性能，评价其固定化效果。本发明的有益效果是由于本发明应用吸附法制备固定化微生物，直接向灭完菌的秸杆材料载体中加入菌液吸附固定，因此，不需要繁琐的制备工艺，将固定有微生物的秸杆材料直接投加到被石油污染的土壤，不会引入二次污染，不需要回收，不涉及到重复利用的问题，对原油的降解率较游离菌提高近40%，降低了成本、提高修复效率。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
来进一步描述本发明。本发明所述的微生物的固定化方法是用秸杆材料做载体，在最佳吸附时间、温度、载体量的条件下，将微生物吸附在秸杆载体上进行固定化，具体步骤如下I.筛选高效石油降解菌，测定细菌生长曲线。2.测定原油标准曲线，用以计算降解率。3.对秸杆材料进行成分分析，测得其有效磷、总氮和有机质的含量分别为0. 508%。(508. 38mg · kg-1)、5. 58% (wt)和 5· 24% (wt)。4.以秸杆材料为固定化载体，用平板计数法分别考察吸附时间、温度、摇床转速和载体量对吸菌量的影响，计算固定率，结合实验条件下制备的树叶固定化微生物对原油的降解率，确定出在一定体积的反应釜中，当吸附时间为12-24h，温度为30-40°C，载体量为3% -5% (V/V)，菌液为20% (V/V)时，其固定率和原油降解率较好；在固定化时间为15h，固定化温度为30°C，载体量为4% (V/V)时，固定化效果最好。5.制备最佳条件下的树叶固定化菌，即在一定体积的反应釜中，载体量4% (V/V)，接菌量20%，固定化时间15h，固定化温度30°C。将固定微生物后的4% (V/V)载体去掉上层菌液后，无菌操作完全转移至准备好的原油培养基中，30°C恒温降解7d，降解率可达到60%，比游离菌提高近40%。所述的原油培养基的配制方法是先在一定体积的反应釜中称取O. 4% (m/m)左右的原油，记录准确质量，再量取20% (V/V)基础无机盐培养基至称好原油的反应釜中，本底油浓度约为10000mg/L ;基础无机盐培养基的配方为NaClO. 5%(m/m)，MgSO4 ·7Η20 O. 025% (m/m), (NH4)2SO4O. 1% (m/m), NaNO3O. 2% (m/m)，K2HPO4 ·3H20I % (m/m), KH2PO4O. 4% (m/m)和一定体积的蒸懼水混合均勻，以pH试纸为指不,用NaOH或盐酸调节PH至7-7. 5，121°C水蒸气灭菌20min。对固定化前的树叶进行BET表征，测得其比表面积为2. 0988m2 · g—1，孔容O. 0030cm3 · g'孔径6. 585nm,表明稻杆材料只有简单的介孔结构,材料主要通过表面吸附来实现对细菌的固定；对固定化前和固定微生物后降解前后的树叶进行电镜扫描，结果表 明孔结构主要为柱状孔，细菌主要吸附在树叶的表面，降解之后的材料结构会变的疏松，菌易脱落，不能重复利用，但是由于其无污染、不需回收，可以满足土壤修复的应用。本发明在确定适宜的载体材料和固定化工艺的基础上，提出了一种能保证微生物菌浓度、不用回收的用于修复石油污染土壤的固定化微生物的制备方法。
权利要求
1.一种用于修复石油污染土壤的微生物的固定化方法，该方法是采用秸杆材料载体，在控制吸附时间、温度、转速、载体量的条件下，将微生物吸附在秸杆材料载体上进行固定化，其特征在于实施该法的具体骤如下 1)从受石油污染的土壤中筛选石油降解菌，得到一株降解率为23%的单菌SM-3，该菌为杆状菌，测定该菌的生长曲线，该菌株的对数生长期为5-16h，稳定期为16-25h ； 2)以胜利原油为反应底物，测定该原油的标准曲线，用以计算降解率； 3)选择稻杆材料为固定化载体，将稻杆材料粉碎，过80目筛； 4)取粉碎后的秸杆材料按3%-5%(V/V)压实后装入一定体积的反应釜中，用121°C高压水蒸汽灭菌20min，然后将用牛肉膏蛋白胨液体培养基活化16h后的密度为1X1010-5X1010个/mL的菌液SM-3按20% (V/V)接到反应釜中，于30 40°C恒温固定.12 24h ； 固定化所用到的菌为SM-3，将该菌用牛肉膏蛋白胨液体培养基培养至对数生长期和稳定期交界点(16h)，其游离状态下对原油的降解率为23% ； 所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方为NaCl 1% (m/m),蛋白胨1% (m/m),牛肉膏O.5% (m/m)和一定体积的蒸懼水混合均勻，以pH试纸为指示,用NaOH或盐酸调节调节pH7. 0,121 °C水蒸气灭菌 20min ； 5)把固定了菌液的3%-5%(V/V)载体连带未被固定的菌液一起转移到离心杯中，在1000r/min下离心IOmin,倒掉上层菌液,将下层载体无菌操作完全转移至事先准备好的原油培养基中，30°C恒温降解7d，降解率可达到60%，比游离菌提高近40% ； 所述原油培养基的配制方法是先在一定体积的反应爸中称取O. 4%(m/m)左右的原油，记录准确质量，再量取20% (V/V)基础无机盐培养基至称好原油的反应釜中，本底油浓度约为10000mg/L ;基础无机盐培养基的配方为NaCl 0. 5 (m/m), MgSO4 · 7H20 O. 025% (m/m), (NH4) 2S040. I % (m/m), NaNO3O. 2% (m/m), K2HPO4 · 3H201% (m/m), KH2PO4O. 4% (m/m)和一定体积的蒸馏水混合均匀，以pH试纸为指示，用NaOH或盐酸调节pH至7-7. 5，121 °C水蒸气灭菌20min。
全文摘要
本发明公开了一种用于修复石油污染土壤的微生物的固定化方法，它是选择秸秆为载体，在固定化时间为15h、固定化温度为30℃、转速为160r/min和载体量:菌量=1:4-7的最佳吸附条件下，将微生物吸附在秸秆材料载体上进行固定化，将固定有微生物的秸秆材料直接投加到被石油污染的土壤，不会引入二次污染，不需要回收，不涉及到重复利用的问题，对原油的降解率较游离菌提高近40％。本发明为废弃农作物的资源化利用提供一条有效的途径。
文档编号C12N11/14GK102876655SQ20121033136
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者张秀霞, 耿春香, 赵朝成, 秦丽姣 申请人:中国石油天然气股份有限公司, 中国石油大学(华东)