专利名称：一种副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基及其制备，属于农业微生物技术领域。
背景技术：
副猪嗜血杆菌病又称猪格拉瑟氏病，纤维素性浆膜炎和关节炎，为革兰氏阴性小杆菌，呈散发性的多发性浆膜炎和关节炎。随着养猪业的发展，规模化饲养技术的应用和饲养高度密集，以及突发新的呼吸道综合症等因素存在，使得该病日趋流行，危害日渐严重。近两年来，我国副嗜血杆菌在养猪场引起猪多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，特别是规模化猪场在受到蓝耳病、圆环病等感染之后免疫功能下降时，副猪嗜血杆菌病伺机暴发，导致较严重的经济损失。目前副猪嗜血杆菌的大规模培养存在诸多亟待改善之处，比如营养需求高、培养困难、培养基成本高等。副猪嗜血杆菌生活力不强，生长依赖外源NAD，在培养过程中生长缓慢；用特殊培养基培养副猪嗜血杆菌的同时，一旦污染杂菌很快杂菌即成为优势菌种，副猪嗜血杆菌培养即告失败；目前所用于培养副猪嗜血杆菌的培养基为TSB培养基,成本高,生长活菌数不稳定，甚至有时由于培养液活菌数过低而倒罐，无法用于疫苗的常规生产。
发明内容
本发明的目的在于针对现有培养基成本较高、效果不好的缺陷，筛选出一种高性能的发酵培养基，该培养基既能保证副猪嗜血杆菌生长旺盛，还能提高生长速度，缩短培养时间，可用于副猪嗜血杆菌 疫苗的大规模生产。本发明制备的培养基是一种成本低廉，活菌数较高，生产周期较短的高密度发酵培养基，活菌数可达25 30亿，生产周期为8 10h。本发明通过下列技术方案实现:
一种副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基，其组分及配比为，按重量/体积计:酵母粉10 30g/L，大豆胨 riOg/L,麦芽糖 riOg/L, NaCl 2 10g/L，K2HPO4I 10g/L ;按体积比计
0.0019Π).010NAD (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和2°/Γ Ο%牛血清，余量是水，灭菌前调培养基的pH至7.0 7.4。作为优选方案，本发明的培养基的组分及配比为:按重量/体积计:酵母粉15 20g/L，大豆胨4 8g/L，麦芽糖4 8g/L，NaCl 5 8g/L，K2HP042 8g/L ；按体积比计
0.0029Π).008NAD和4°/Γ8%牛血清，余量是水，灭菌前调培养基的ρΗ7.0-7.4。作为优选方案，本发明的培养基的组分及配比为:按重量/体积计:酵母粉16g/L，大豆胨5g/L，麦芽糖5g/L，NaCl 5g/L，K2HP045g/L ;按体积比计0.005NAD和5%牛血清，余量是水，灭菌前调培养基的PH7.0-7.4。本发明提供的培养基通过下列方法制备:A.取酵母粉l(T30g/L，大豆胨I 10g/L，NaCl2 10g/L，K2HPO4I 10g/L，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，调培养基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ；
B.取fIOg麦芽糖，加蒸馏水定容至1000ml，配制成麦芽糖溶液，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ；
C.按体积比计，取步骤B的麦芽糖溶液f10%，过滤除菌的牛血清2°/Γ Ο%，NAD0.0019Γ0.01%，余量为灭过菌的步骤A的培养基，得到副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基。本发明的特点是:本发明的培养基以酵母粉作为主要的氮源，还可提供各种微生物所需的维生素、生长素等营养，降低了成本，更有利于被副猪嗜血杆菌吸收和利用。本发明以麦芽糖为主要的碳源，水解速度较慢，在培养一段时间内可提供稳定的代谢碳源，同时还可以维持培养基的渗透压平衡。因此，该培养基比商业培养基TSB更适于副猪嗜血杆菌的生长，可更加经济实惠。
图1:副猪嗜血杆菌在商业培养基TSB中的生长曲线(对照)。图2:副猪嗜血杆菌在本发明的最佳实施例制备的培养基中的生长曲线。注:商业TSB成分组成:胰酪蛋白胨17g/L ;大豆胨3g/L ； NaCl 5g/L;K2HP042.5g/L ;葡萄糖2.5g/L。
具体实施方式
:
实施例1:
培养基的制备:
(O取酵母粉10g/L，大豆胨lg/L，NaCl 2g/L，K2HP04lg/L，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，调培养基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ；
(2)取fIOg麦芽糖，加蒸馏水定容至1000ml，配制成麦芽糖溶液，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ；
(3)按体积比计，取步骤B的麦芽糖溶液1%，过滤除菌的牛血清2%，NAD0.001%，余量为灭过菌的步骤A的培养基，得到副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基。实施例2:优化培养基的制备
(O取酵母粉16g/L，大豆胨5g/L，NaCl 5g/L，K2HP045g/L，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，调培养基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ；
(2)取flOg麦芽糖，加蒸懼水定容至1000ml,配制成麦芽糖 溶液，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ；
(3)按体积比计，取步骤B的麦芽糖溶液5%，过滤除菌的牛血清5%，NAD0.005%，余量为灭过菌的步骤A的培养基，得到副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基。实施例3:优化培养基的制备
(1)取酵母粉30g/L，大豆胨10g/L，NaCl10g/L, K2HPO4 10g/L，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，调培养基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ；
(2)取fIOg麦芽糖，加蒸馏水定容至1000ml，配制成麦芽糖溶液，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ；(3)按体积比计，取步骤B的麦芽糖溶液10%，过滤除菌的牛血清10%，NAD0.01%，余量为灭过菌的步骤A的培养基，得到副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基。实施方案4:优化培养基的制备
(O取酵母粉15g/L，大豆胨4g/L，NaCl 5g/L，K2HPO4 2g/L，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，调培养基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ；
(2)取fIOg麦芽糖，加蒸馏水定容至IOOOml，配制成麦芽糖溶液，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ；
(3)按体积比计，取步骤B的麦芽糖溶液4%，过滤除菌的牛血清4%，NAD0.002%，余量为灭过菌的步骤A的培养基，得到副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基。实施例5:优化培养基的制备
(1)取酵母粉20g/L，大豆胨8g/L，NaCl8 g/L，K2HPO4 8g/L，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，调培养基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ；
(2)取fIOg麦芽糖，加蒸馏水定容至1000ml，配制成麦芽糖溶液，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ；
(3)按体积比计，取步骤B的麦芽糖溶液8%，过滤除菌的牛血清8%，NAD0.008%,余量为灭过菌的步骤A的培养基，得到副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基。实施例6:优化培养基的制备
(1)取酵母粉16g/L，大豆胨5g/L，NaCl5 g/L，K2HPO4 5g/L，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，调培养基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ；
(2)取fIOg麦芽糖，加蒸馏水定容至1000ml，配制成麦芽糖溶液，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ；
(3)按体积比计，取步骤B的麦芽糖溶液5%，过滤除菌的牛血清5%，NAD0.005%，余量为灭过菌的步骤A的培养基，得到副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基。实施例7:优化培养基的制备
(1)取酵母粉18g/L，大豆胨7g/L，NaCl7 g/L，K2HPO4 2.5g/L，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，调培养基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ；
(2)取flOg麦芽糖，加蒸懼水定容至1000ml,配制成麦芽糖 溶液，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ；
(3)按体积比计，取步骤B的麦芽糖溶液7%，过滤除菌的牛血清6%，NAD0.006%，余量为灭过菌的步骤A的培养基，得到副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基。表1:副猪嗜血杆菌5L发酵罐试验
权利要求
1.一种副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基，其特征在于:培养基组分及配比，按照重量/体积计，酵母粉l(T30g/L，大豆胨I 10g/L，麦芽糖I 10g/L，NaCl 2 10g/L，K2HPO4riOg/L ;按体积比计0.0019Γ0.0lONAD和2°/Γ Ο%牛血清，余量是水，灭菌前调培养基的ρΗ7.0-7.4。
2.权利要求1所述的培养基，其特征在于所述的培养基的组分及配比为:按重量/体积计:酵母粉15 20g/L，大豆胨4 8g/L，麦芽糖4 8g/L，NaCl 5 8g/L，K2HPO4 2 8g/L ;按体积比计0.0029Γ0.008NAD和4°/Γ8%牛血清，余量是水，灭菌前调培养基的ρΗ7.0-7.4。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于所述的培养基的组分及配比为:按重量/体积计:酵母粉16g/L，大豆胨5g/L，麦芽糖5g/L，NaCl 5g/L，K2HP045g/L ;按体积比计0.005NAD和5%牛血清，余量是水，灭菌前调培养基的pH7.0-7.4。
4.一种副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基的制备方法，其特征包括下列步骤: A.取酵母粉l(T30g/L，大豆胨I 10g/L，NaCl2 10g/L，K2HPO4 I 10g/L，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，调培养基的pH7.0 7.4，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ； B.取fIOg麦芽糖，加蒸馏水定容至1000ml，配制成麦芽糖溶液，在115 121 °C的高压蒸汽下灭菌2(T30min ； C.按体积比计，取步骤B的麦芽糖溶液f10%，过滤除菌的牛血清29TlO%，NAD0.001°Γθ.01%，余量为灭过菌的步骤A的培养基，得到副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基。
5.权利要求1-3任一项所述`的培养基在副猪嗜血杆菌的高密度发酵中应用。
全文摘要
本发明属于农业微生物技术领域，提供了一种副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基及其制备方法。该培养基包括以下组分按照重量/体积计，酵母粉10~30g/L，大豆胨1~10g/L，麦芽糖1~10g/L，NaCl2~10g/L，K2HPO41~10g/L；按体积比计0.001%~0.010NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和2%~10%牛血清，余量是水，pH7.0-7.4。本发明有利于副猪嗜血杆菌的高密度发酵，在短时间内获得较大菌量，成本低廉，可用于疫苗的大规模生产。
文档编号C12R1/21GK103232962SQ20131016718
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月8日 优先权日2013年5月8日
发明者单虎, 段笑笑, 韩先杰, 张传美, 秦志华, 蔡秀磊 申请人:青岛农业大学