专利名称：一种双中性蛋白酶分步酶解花生分离蛋白制备花生肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种双中性蛋白酶分步酶解花生分离蛋白制备花生肽的方法。
背景技术：
花生是我国重要的油料作物和食用作物，产量和出口量高居世界首位。目前，中国对花生的利用多在食用油脂的提取方面，对花生蛋白的利用较少。花生的蛋白质含量为25 % 30 %，花生蛋白含有人体必需的八种氨基酸，精氨酸含量高于其它坚果，生物学效价高于大豆。目前国内市场上的花生蛋白产品主要是花生蛋白粉，其一般是作为食品加工中的基础原料。花生蛋白粉存在着不易吸收、生理洁性较差等缺点，所以在花生蛋白粉的基础上，进一步开发和利用这一巨大的潜在蛋白资源生产高附加值产品成了当务之急。多项研究表明，花生蛋白经蛋白酶水解制备成花生肽后具有多种生理活性，包括抗氧化作用、抗菌作用、降血压作用等。因此，研究花生蛋白粉酶解工艺制备花生肽，可以开发和利用花生蛋白粉这一巨大的潜在蛋白资源，生产高附加值蛋白产品。采用生物酶法在温和条件下对蛋白进行水解，生成的多肽具有很高营养价值。现代营养研究表明，分子量小于IOOOu的短肤极易被人体吸收利用，而且具有较强的功能活性，这就要求所选用的酶解工艺在保证短肽得率的前提下尽量提高蛋白的水解度。
目前，蛋白水解制备短肽的工艺中，酶解时间一般在360 960min，短肽得率在60% 65%左右，体系水解度在12% 16%左右，且多存在脱盐等繁琐步骤。因此如何简化工艺并在短时间获得高水解度高得率的短肽成为生产工艺中需要解决的一大难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶解花生分离蛋白制备花生肽的方法。本发明所提供的制备花生肽的方法，包括下述步骤:I)将花生分离蛋白粉用水溶解，得到花生分离蛋白溶液，将所述花生分离蛋白溶液置于80 85°C水浴中保持10 15min，使花生分离蛋白高度压缩、紧密的结构松散开，暴露出分子内部的酶作用位点，以利于蛋白酶的结合；2)将步骤I)处理后的花生分离蛋白溶液取出，待温度降至中性蛋白酶酶解适合的温度后加入中性蛋白酶进行酶解，得到酶解液，记为酶解液I ;3)向所述酶解液I中加入复合蛋白酶，继续进行酶解，得到酶解液2 ；4)使所述酶解液2中的中性蛋白酶和复合蛋白酶失活，离心取上清液，即得花生肽的溶液。其中，步骤I)中所述花生分离蛋白溶液中花生分离蛋白的质量浓度为6 8%，优选质量浓度为8%。所述花生分离蛋白粉中，蛋白含量不低于90 %，脂肪含量不高于I %。步骤2)中所述中性蛋白酶的加入量为5200 6500U/g蛋白。所述酶解的条件为:酶解温度40 50°C，酶解时间1.5 2.0h ;优选酶解的条件为:酶解温度45°C，酶解时间120min。所述酶解在恒温水浴振荡器中进行。步骤3)中所述复合蛋白酶的加入量为216 648U/g蛋白。所述酶解的条件为:酶解温度40 50°C，酶解时间2.0 2.5h ;优选酶解的条件为:酶解温度45°C，酶解时间120min。所述酶解在恒温水浴振荡器中进行。本发明中所述中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于单一酶类，无特异性酶切位点；所述复合蛋白酶由内切酶和外切酶复合而成。本发明对中性蛋白酶酶活定义为:酪蛋白底物在特定条件下经酶水解，每分钟产生I μ g酪氨酸为一个活力单位，以U表示。对复合蛋白酶酶活的定义为:酪蛋白底物在特定条件下经酶水解，每分钟产生
Iμ g酪氨酸为一个活力单位，以U表示。步骤4)中可按照下述方法使所述中性蛋白酶和复合蛋白酶灭活:将酶解液2升温至90 95°C，保持10 20min。步骤4)中所述离心的条件为4000 4500rpm离心20 30min。上述方法还包括对步骤4)得到的花生肽的溶液进行干燥的步骤。所述干燥可采用冷冻干燥或喷雾干燥。本发明提供了一种方法简单、条件温和、制备时间短、花生肽制备成本低，花生肽得率高且纯度高的花生肽的制备方法。所得花生肽的分子量集中分布于IOOODa以下；最终水解度达到38.23 %，短肽得率达到88.52 %，其中分子量小于IOOODa占98.88 %，并具有较强的ACE抑制活性，其IC5tl 值为0.842mg/ml。
图1为本发明中测得的中性蛋白酶加酶量与水解关系曲线图。图2为本发明中测得的复配酶种类与水解关系曲线图。图3为本发明中测得的复合蛋白酶加酶量与水解关系曲线图。图4为本发明中测得的酶解温度与水解关系曲线图。图5为本发明中测得的酶解时间与水解关系曲线图。图6为本发明中测得的短肽分子量分布的GPC图谱。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例中所采用的中性蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号:Z8030，酶活为6.0OX 104U/g;所采用的复合蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号:C8800，酶活为1.20X 105U/g;所采用的木瓜蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号:G8430，酶活为5.00X 105U/g ;所采用的风味蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号:F8250，酶活为2.00X 104U/g。下述实施例中所采用的花生分离蛋白粉，其蛋白含量为90%，脂肪含量为1%。
下述实施例中可溶性氮的测定:folin_酚法；短肽得率测定:三氯乙酸可溶性氮法=N1ZXX 100% ；式中，TCA-NS1-三氯乙酸可溶性氮得率，％ ;N「在10% TCA中可溶性氮，mg ；N0原料中总氮，mg。水解度(DH)的测定:邻苯二甲醛(OPA)法。花生肽分子量分布的测定:采用高效液相色谱(HPLC)对酶解物的分子量分布进行分析，条件为:色谱柱:TSKgel2000SWXL300mmX7.8mm ;流动相:45%乙睛+55 %水+0.1 %三氟乙酸；流速:0.5ml/min ;温度:30°C ;检测波长:220nm。ACE抑制活性的测定:采用高效液相色谱(HPLC)对酶解物的ACE抑制活性进行分析，条件为:实验色谱柱SunfireTM-C18 (250mmX4.6mm),流动相乙腈-水-三氟乙酸,体积比 50: 50: 0.05，检测波长 228nm，流速 0.4mL/min，柱温 30°C，进样量 20yL。实施例1、考察不同蛋白酶复配对水解度及短肽得率的影响第一步:取花生分离蛋白粉，加入蒸馏水，使之溶解后，得到质量浓度8%的花生分离蛋白溶液；将其加入80°C恒温水浴中保持lOmin，使花生分离蛋白高度压缩、紧密的结构松散开，暴露出分子内部的酶作用位点，以利于蛋白酶的结合；第二步:第一步完成后取出花生分离蛋白溶液，恢复温度到中性蛋白酶适合温度(450C )后加入中性蛋白酶(5200U/g底物)，在45°C的恒温水浴振荡器中反应120min ；第三步:第二步反应结束后，加入复合蛋白酶(432U/g底物)混合均匀，继续在45 C的恒温水浴振汤器中反应120min ；第四步:第三步反应结束后取出，放入90°C恒温水浴中保持lOmin，使中性蛋白酶失活，4500转离心20min后喷雾干燥得到花生肽。第五步:采用高效液相色谱(HPLC)对第四步所得花生肽的分子量分布进行分析，测得的短肽分子量分布如图6所不，分子量小于IOOODa占98.88%。第六步:采用高效液相色谱(HPLC)对酶解物的ACE抑制活性进行分析，ACE抑制活性的 IC5tl 值为 0.842mg/ml。采用上述方法制备花生肽，最终水解度达到38.23%，短肽得率达到88.52% (以蛋白含量计)，分子量小于IOOODa占98.88%, ACE抑制活性的IC50值为0.842mg/ml。上述第二步中不同中性蛋白酶的用量所对应的花生分离蛋白的水解度和短肽得率的结果，见图1。由图1中可以看出:酶用量在2600 3900U/g浓度范围内，酶解液的DH和TCA-NSI上升缓慢，当酶用量在3900 6500U/g浓度范围内时，酶解液的DH和TCA-NSI随酶用量的升高上升迅速，当酶用量达到5200U/g时，TCA-NSI达到43.93 ±0.40%，之后上升均趋于平缓，所以选择中性蛋白酶加酶量为5200U/g底物。将上述第三步中的复合蛋白酶分别替换成木瓜蛋白酶(3000U/g底物)、风味蛋白酶(3000U/g底物)，考察不同蛋白酶与中性蛋白酶复配，水解花生分离蛋白的水解度和短肽得率。结果见图2。由图2中可以看出:在各种蛋白酶的推荐使用条件下(木瓜蛋白酶、风味蛋白酶的酶解条件为:温度50°C，加酶量3000U/g底物，酶解时间120min)，复合蛋白酶与中性蛋白酶复配水解花生分离蛋白的水解度和短肽得率显著高于其他两种蛋白酶，所以选择复合蛋白酶作 为中性蛋白酶的复配酶。实施例2、考察复合蛋白酶用量对水解度及短肽得率的影响
第一步:取花生分离蛋白粉，加入蒸馏水，使之溶解后，得到质量浓度8%的花生分离蛋白溶液；将其加入80°C恒温水浴中保持lOmin，使花生分离蛋白高度压缩、紧密的结构松散开，暴露出分子内部的酶作用位点，以利于蛋白酶的结合；第二步:第一步完成后取出花生分离蛋白溶液，恢复温度到中性蛋白酶适合温度(450C )后加入中性蛋白酶(5200U/g底物)，在45°C的恒温水浴振荡器中反应120min ；第三步:第二步反应结束后，加入不同量的复合蛋白酶(216U/g底物_8640U/g底物)混合均匀，继续在45°C的恒温水浴振荡器中反应120min ；第四步:第三步反应结束后取出，放入90°C恒温水浴中保持lOmin，使中性蛋白酶失活，4500转离心20min后喷雾干燥得到花生肽。不同复合蛋白酶的用量所对应的花生分离蛋白的水解度和短肽得率的结果，见图
3。由图3中可以看出:水解液中水解度和短肽得率呈先上升后下降的趋势。随着加酶量增大，酶的水解作用加强，反应后水解度和短肽得率上升，但当加酶量继续增加，酶的抑制作用导致水解度和短肽得率均不同程度下降。所以选择复合蛋白酶加酶量为216 648U/g底物，最优选432U/g底物。
实施例3、考察不同酶解温度对水解度及短肽得率的影响第一步:取花生分离蛋白粉，加入蒸馏水，使之溶解后，得到质量浓度8%的花生分离蛋白溶液；将其加入80°C恒温水浴中保持lOmin，使花生分离蛋白高度压缩、紧密的结构松散开，暴露出分子内部的酶作用位点，以利于蛋白酶的结合；第二步:第一步完成后取出花生分离蛋白溶液，恢复温度到中性蛋白酶适合温度(450C )后加入中性蛋白酶(5200U/g底物)，在45°C的恒温水浴振荡器中反应120min ；第三步:第二步反应结束后，加入复合蛋白酶(432U/g底物)混合均匀，继续在45 C的恒温水浴振汤器中反应120min ；第四步:第三步反应结束后取出，放入90°C恒温水浴中保持lOmin，使中性蛋白酶失活，4500转离心20min后喷雾干燥得到花生肽。不同酶解温度所对应的花生分离蛋白的水解度和短肽得率的结果，见图4。由图4可以看出:酶的作用效果受到温度影响较大。一般情况下，在酶的适用温度范围内，增加反应体系的温度，则酶解的速度加快，酶解产物增多。如图4所示，在35 45°C温度范围内，水解度和短肽得率随着温度升高而增加。45°C后水解度和短肽得率随着温度的升高逐渐降低。因此，选择40 50°C作为酶解温度，45°C作为酶解最佳温度。实施例4、考察不同酶解时间对水解度及短肽得率的影响第一步:取花生分离蛋白粉，加入蒸馏水，使之溶解后，得到质量浓度8%的花生分离蛋白溶液；将其加入80°C恒温水浴中保持lOmin，使花生分离蛋白高度压缩、紧密的结构松散开，暴露出分子内部的酶作用位点，以利于蛋白酶的结合；第二步:第一步完成后取出花生分离蛋白溶液，恢复温度到中性蛋白酶适合温度后加入中性蛋白酶(5200U/g底物)，在45°C的恒温水浴振荡器中反应若干时间(1.0h\l.5h\2.0h\2.5h\)；第三步:第二步反应结束后，加入复合蛋白酶(432U/g底物)混合均匀，继续在45°C的恒温水浴振荡器中反应若干时间(3.0h\2.5h\2.0h\l.5h\)；第四步:第三步反应结束后取出，放入90°C恒温水浴中保持lOmin，使中性蛋白酶失活，4500转离心20min后喷雾干燥得到花生肽。不同酶解时间所对应的花生分离蛋白的水解度和短肽得率的结果，见图5。由图5可以看出:当加酶量、底物浓度和酶解温度一定时,调整复合蛋白酶加入时间，酶解效果不同。由图5可知，水解度在中性蛋白酶反应90min后加入复合蛋白酶继续反应150min时达到最大，短肽得率在中性蛋白酶反应120min后再加入复合蛋白酶反应120min时达到最大值，而后上述两指标均有不同程度下降，考虑短肽的得率因素，因此酶解最佳时间为中性蛋白酶反应120min后加入复合蛋白酶继续反应120min。采用上述方法制备花生肽具有以下有益效果:制备方法简单，制备条件温和，制备时间短，花生肽制备成本低，花生肽得率高，纯度高，分子量集中分布于IOOODa以下；最终水解度达到38.23%，短肽得率达到88.52%，分子量小于IOOODa占98.99%, ACE(血管紧张素转化酶)抑制活性的IC5tl值为0.842mg/ml。本文具体说明了本发明示例性实施实例和目前的优选实施方式，应当理解，本发明的构思可以按其他种种 形式实施运用，它们同样落在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种制备花生肽的方法，包括下述步骤: 1)将花生分离蛋白粉用水溶解，得到花生分离蛋白溶液，将所述花生分离蛋白溶液置于80 85°C水浴中保持10 15min ； 2)将步骤I)处理后的花生分离蛋白溶液取出，待温度降至中性蛋白酶酶解适合的温度后加入中性蛋白酶进行酶解，得到酶解液，记为酶解液I ; 3)向所述酶解液I中加入复合蛋白酶，继续进行酶解，得到酶解液2; 4)使所述酶解液2中的中性蛋白酶和复合蛋白酶失活，离心取上清液，即得花生肽的溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤I)中所述花生分离蛋白粉中，蛋白含量不低于90%，脂肪含量不高于1%。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤I)中所述花生分离蛋白溶液中花生分离蛋白的质 量浓度为6 8%，优选质量浓度为8%。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于:步骤2)中所述中性蛋白酶的加入量为5200 6500U/g蛋白，优选5200U/g蛋白；所述酶解条件为:酶解温度40 50°C，酶解时间1.5 2.0h ;优选的酶解条件为:酶解温度45°C，酶解时间120min。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于:步骤3)中所述复合蛋白酶的加入量为216 648U/g蛋白，优选432U/g蛋白；所述酶解条件为:酶解温度40 50°C，酶解时间2.0 2.5h ;优选的酶解条件为:酶解温度45°C，酶解时间120min。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于:步骤4)中使所述中性蛋白酶和复合蛋白酶灭活的方法如下:将所述酶解液2升温至90 95°C,保持10 20min ； 步骤4)中所述离心的条件为4000 4500rpm离心20 30min。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于:所述方法还包括对步骤4)得到的花生肽的溶液进行干燥的步骤；所述干燥的方式为冷冻干燥或喷雾干燥。
8.权利要求1-7中任一所述的方法制备得到的花生肽。
9.根据权利要求8所述的花生肽，其特征在于:所述花生肽中分子量小于IOOODa的肽的含量彡98.88%。
全文摘要
本发明公开了一种双中性蛋白酶酶解花生分离蛋白制备花生肽的方法。该方法包括下述步骤1)将花生分离蛋白粉用水溶解，得到花生分离蛋白溶液，将花生分离蛋白溶液置于80～85℃水浴中保持10～15min；2)将步骤1)处理后的花生分离蛋白溶液取出，待温度降至中性蛋白酶酶解适合的温度后加入中性蛋白酶进行酶解，得到酶解液，记为酶解液1；3)向酶解液1中加入复合蛋白酶，继续进行酶解，得到酶解液2；4)使酶解液2中的中性蛋白酶和复合蛋白酶失活，离心取上清液，喷雾干燥得到花生肽。本发明的方法具有花生肽得率高，纯度高，分子量集中分布于1000Da以下，具有较强的ACE抑制活性，且具有制备成本低，制备时间短，制备方法简单、制备条件温和等优点。
文档编号A23J3/34GK103222537SQ20131016700
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月8日 优先权日2013年5月8日
发明者王强, 刘芳友, 刘红芝, 张文镨, 刘丽, 李宁, 胡晖 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所, 华隆(乳山)食品工业有限公司