专利名称：一种重组毕赤酵母植酸酶高密度工业发酵方法
技术领域：
本发明涉及发酵领域，具体地涉及一种重组毕赤酵母植酸酶高密度工业发酵方 法。
背景技术：
巴斯德毕赤酵母表达系统是近20几年发展起来的一种真核表达系统，早期被 用来生产单细胞蛋白，直到1987年，Cgata等人首次将毕赤酵母用于外源基因的表达 (JMCregg, et al. 1987)。甲醇营养型毕赤酵母是研究和运用很广泛的外源蛋白表达系统，目前已有超过 400种蛋白得到表达。这种系统的优点包括(1)外源蛋白的高表达；(2)外源蛋白分泌的 高效率；(3)高效转录后修饰，例如糖基化；(4)可以实现高密度培养。醇氧化酶(alcohol oxidase, A0X)是甲醇营养型毕赤酵母系统中的关键酶，也是 甲醇代谢途径中的第一个酶。毕赤酵母中有两种编码醇氧化酶的基因A0X1和A0X2，其中 AOXl是决定细胞中醇氧化酶活力的主要因素。AOX启动子在转录水平调节了醇氧化酶的表 达，这其中包含了双重调控作用当存在抑制性碳源如甘油、葡萄糖时AOX表达受抑制，外 源基因也处于不表达状态，而以甲醇为唯一碳源时，AOX基因才能高表达。因此重组毕赤酵 母表达外源蛋白通常分为三个阶段，甘油分批发酵阶段、甘油补料阶段和外源基因诱导表 达阶段。巴斯德重组毕赤酵母具有如下的生理特征(1)好氧型菌株，培养时需要大量供 氧。(2)存在Crabtree效应，效应的临界值很低，一般在0. Ι-lg/L左右。基质浓度超过该 值，对菌体生长有抑制作用的代谢副产物(如乙醇)便会随之产生，(3)乙醇对菌体生产、 特别是外源蛋白的表达存在很大的抑制作用。所以在表达外源蛋白时受很多因素影响，要 考虑菌体自身的因素，还要顾及培养过程中的外部环境条件，如营养成分、温度、PH、溶氧浓 度DO、特别是基质浓度的影响，如何控制营养物质的流加速率，使得发酵罐中营养物质刚好 满足微生物的需要。在毕赤酵母高密度培养时，目前大多数采用的是irwitrogen公司提供的FM21基 础盐配成含4%甘油的发酵培养基，较少用葡萄糖，因为葡萄糖是AOX启动子的强阻遏性碳 源，其阻遏作用强于甘油。但是葡萄糖是发酵领域常用的一种培养碳源，其价格和甘油相比 具有很强的竞争优势。因此用相对廉价的葡萄糖替代甘油作为生长碳源成为工业生产上的 一种理想选择。因此要实现毕赤酵母细胞在葡萄糖环境下的最优生长，葡萄糖的初始浓度 以及如何控制葡萄糖的补料速率是关键点。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种重组毕赤酵母植酸酶高密度工业发酵方法，从而 可以通过高密度发酵，高效表达生产植酸酶。根据本发明的重组毕赤酵母植酸酶高密度工业发酵方法，包括以下步骤
1)将发酵工作种子液接种于发酵罐；2)葡萄糖补料流加阶段在0-6小时内，以40mL/h的速度流加葡萄糖，6_9小时，以80mL/h流加葡萄糖， 9-12小时，以140mL/h流加葡萄糖，12-14小时，以220mL/h流加葡萄糖，14-16小时，以 320mL/h流加葡萄糖，16-17小时，以500mL/h流加葡萄糖，17小时-补糖结束，以600mL/h 流加，菌体湿重达到180g/L后停止补糖，其中所述葡萄糖的浓度为50%、含PTM1UmL/!；3)饥饿阶段停止补加葡萄糖后，不补加任何碳源，饥饿10-15分钟，观察DO和pH值，当DO开 始上升，PH也开始上升时，进入诱导阶段；4)甲醇诱导表达植酸酶阶段以3. OmL/h速度流加甲醇2小时，3. 4mL/h速度流加甲醇2小时，3. 8mL/h速度流 加甲醇2小时，4. 2mL/h速度流加甲醇2小时，4. 6mL/h速度流加甲醇12小时，5. 6mL/h速度 流加甲醇24小时，6. 6mL/h速度流加甲醇24小时，7. 6mL/h速度流加甲醇24小时，8. 6mL/h 速度流加甲醇24小时，9. OmL/h速度流加甲醇24小时，8. 6mL/h速度流加甲醇24小时，其 中，所述甲醇含PTM1UmL/!^因此，根据本发明的方法，包括三个阶段葡萄糖补料流加阶段、饥饿阶段和外源 基因诱导表达阶段。葡萄糖补料流加阶段，菌体从接种开始按照一定速率向培养基流加 50%含PTM1UmVL的葡萄糖补料液，菌体利用碳源生长，随着菌体生长，根据菌体生长速度 调整葡萄糖的流加速度，控制培养基中糖的浓度始终在0.5%以下，当菌体湿重达到180g/ L左右后停止补糖。停止补糖后，因残留的葡萄糖或者代谢中间产物乙醇会影响下一步的诱 导表达，维持饥饿状态15-30分钟，观测DO(溶氧)值上升至接近100%，pH值有上升的趋 势时，开始补加含12ml/L PTM的甲醇进行诱导，菌体以甲醇为碳源诱导表达植酸酶，甲醇浓 度必须得到控制，甲醇浓度过高会对毕赤酵母产生毒害作用，浓度过低，则起不到有效的诱 导效果，在诱导开始后，由于菌体不能马上适应环境的改变，甲醇无法得到充分利用，所以 前期甲醇流量不能太高，以3. OmL/h速度流加甲醇(含PTM1UmLA^小时，随着菌体逐步 适应甲醇环境，再慢慢增加甲醇流量。本发明的优点是根据菌体生长规律，结合DO-stat和底物浓度反馈补料方法，不 需要使用昂贵的葡萄糖电极，从接种后就根据菌体生长速度和浓度，调整50 %的葡萄糖溶 液补料速度，从而实现高密度发酵，再通过调整甲醇的补料速度，实现植酸酶的高效表达。
具体实施例方式以下为本发明的实施例，实施例中的重组毕赤酵母，基因型为Mut+。以上实验所用的各种培养基配方参见表权利要求
1. 一种重组毕赤酵母植酸酶高密度工业发酵方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1)将发酵工作种子液接种于发酵罐；2)葡萄糖补料流加阶段在0-6小时内，以40mL/h的速度流加葡萄糖，6-9小时，以80mL/h流加葡萄糖，9_12小 时，以140mL/h流加葡萄糖，12-14小时，以220mL/h流加葡萄糖，14-16小时，以320mL/h流 加葡萄糖，16-17小时，以500mL/h流加葡萄糖，17小时-补糖结束，以600mL/h流加，菌体 湿重达到180g/L，其中所述葡萄糖的浓度为50%、含PTM1UmL/!；3)饥饿阶段停止补加葡萄糖后，不补加任何碳源，饥饿10-15分钟，观察DO和pH值，当DO开始上 升，PH也开始上升时，进入诱导阶段；4)甲醇诱导表达植酸酶阶段以3. OmL/h速度流加甲醇2小时，3. 4mL/h速度流加甲醇2小时，3. 8mL/h速度流加甲 醇2小时，4. 2mL/h速度流加甲醇2小时，4. 6mL/h速度流加甲醇12小时，5. 6mL/h速度流加 甲醇24小时，6. 6mL/h速度流加甲醇24小时，7. 6mL/h速度流加甲醇24小时，8. 6mL/h速度 流加甲醇24小时，9. OmL/h速度流加甲醇24小时，8. 6mL/h速度流加甲醇24小时，其中，所 述甲醇含PTM1^mIVLtj
全文摘要
本发明涉及发酵领域，具体地涉及一种重组毕赤酵母植酸酶高密度工业发酵方法。根据本发明的重组毕赤酵母植酸酶高密度工业发酵方法，包括以下步骤1)将发酵工作种子液接种于发酵罐；2)葡萄糖补料流加阶段；3)饥饿阶段；4)甲醇诱导表达植酸酶阶段。本发明的优点是根据菌体生长规律，结合DO-stat和底物浓度反馈补料方法，不需要使用昂贵的葡萄糖电极，从接种后就根据菌体生长速度和浓度，调整50％的葡萄糖溶液补料速度，从而实现高密度发酵，再通过调整甲醇的补料速度，实现植酸酶的高效表达。
文档编号C12N9/16GK102115735SQ20101054406
公开日2011年7月6日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者刘金山, 史宝军, 胡爱红 申请人:广东溢多利生物科技股份有限公司