一种两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法
【专利摘要】本发明是一种两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，在刺糖多孢菌发酵液制备阶段，当刺糖多孢菌发酵一开始时，通过调节通气量和搅拌转速调控氧体积传质系数kLa，使初始氧体积传质系数kLa控制在100-130h-1，促进刺糖多孢菌生物量积累；当发酵进入到菌体生长对数生长末期时，再通过调节通气量和搅拌转速调控氧体积传质系数kLa，使初始氧体积传质系数kLa控制在60-92h-1，促进多杀菌素合成与积累。本发明通过两阶段溶氧控制，多杀菌素发酵产量显著提高，且缩短了发酵周期。本发明的两阶段溶氧控制发酵方法易于实现，具有重要应用价值。
【专利说明】一种两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及发酵工程和生物制药领域，尤其是溶氧控制技术在发酵过程优化中的应用，具体为一种两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法。
【背景技术】
[0002]多杀菌素(spinosad),又名多杀霉素或剌糖菌素，是由土壤放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵后产生的胞内次级代谢产物,其主要活性成分是多杀菌素组分A(spinosyn A)组分D(spinosyn D)。多杀菌素是天然生成的抗生素,对鳞翅目及双翅目等害虫均有良好的防治效果，多杀菌素对昆虫存在快速触杀和摄食毒性，通过刺激昆虫神经系统，导致非功能性的肌肉收缩、衰竭，并伴随颤抖和麻痹。与一般杀虫剂相比，多杀菌素兼具生物农药的安全性和化学合成农药的快速性效果，具有低毒、低残留、对昆虫天敌安全、自然分解快等诸多优点。在日益重视环保和安全的今天，多杀菌素作为高效无污染的绿色杀虫剂受到越来越多的关注。
[0003]刺糖多孢菌是一种好氧型革兰氏阳性放线菌。溶氧是影响多杀菌素发酵的重要因素之一，罗玉双等将透明颤菌血红蛋白基因转入刺糖多孢菌中，以解决高密度深层培养过程中的供氧不足问题，提高了多杀菌素的产量(罗玉双，中国科学，2012:2:148-157)，证明了溶氧对多杀菌素的生产有着重要的意义。刺糖多孢菌发酵动力学属于生长部分相关型，即菌体生长一段时间后出现多杀菌素大量合成，多杀菌素产量与菌体量积累呈正相关，发酵过程中若溶氧太低将会使糖代谢缓慢，菌体生长不良，产物合成就会受到影响；而溶氧太高则会使菌体生长过于旺盛，底物完全氧化的比例过高，也不利于多杀菌素的合成。有报道，刺糖多孢菌在发酵过程中需将溶氧控制在50%或50%以上(拉维恩.德韦恩.博克招衡等，中国专利文献CN1035391C)，虽然给出了溶氧控制的初步结果，但并没有针对菌体生长和产物合成的需氧量分别进行深入研究。目前，尚未见针对刺糖多孢菌发酵过程中溶氧分阶段控制的研究报道。`
【发明内容】
[0004]基于以上问题，本发明的目的是提供一种两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，该方法可以提高多杀菌素产量，缩短发酵周期。
[0005]本发明提供的一种两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，在刺糖多孢菌发酵液制备阶段，当刺糖多孢菌发酵一开始时，调控初始氧体积传质系数k#至100-130/小时OT1)，促进刺糖多孢菌生物量积累；当发酵进入到菌体生长对数生长末期时，再调控初始氧体积传质系数kp至60-921^，促进多杀菌素合成与积累。
[0006]作为上述技术方案的一个改进，所述调控是指调节通气量和搅拌转速。
[0007]作为上述技术方案的另一个改进，在刺糖多孢菌发酵液制备阶段之前，该方法还依次包括以下阶段:刺糖多孢菌的孢子制备阶段；刺糖多孢菌的一级种子液制备阶段；以及刺糖多孢菌的二级种子液制备阶段。[0008]作为上述技术方案的进一步改进，所述刺糖多孢菌的孢子制备阶段具体包括下述过程:将刺糖多孢菌冻干管中的冻干粉转接进入斜面培养基中，活化后经过NTG(N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍)化学诱变、紫外线物理诱变和原生质体融合，得到改良菌株；所述斜面培养基中含有葡萄糖:10.0-15.0 ;酪蛋白:2.0-3.0 ;酵母粉:1.0-2.0 ;琼脂；
15.0-20.0，单位:克 / 升。
[0009]作为上述技术方案的再进一步改进，所述刺糖多孢菌的一级种子液制备阶段具体包括下述过程:将所述刺糖多孢菌的孢子制备阶段制得的活化后刺糖多孢菌孢子接入刺糖多孢菌的一级种子培养基中，培养制得刺糖多孢菌一级种子液；所述每升一级种子培养基含有葡萄糖:10.0-15.0 ;酵母粉:2.0-2.5 ;酪蛋白:2.0-2.5 ；K2HPO4:0.2-0.4 ；MgS04:
0.3-0.4，单位:克/升。
[0010]作为上述技术方案的又一更进一步改进，所述刺糖多孢菌的二级种子液制备阶段具体包括下述过程:将所述刺糖多孢菌的一级种子液制备阶段制得的一级种子液以10% (v/v)接种量接入二级种子培养基中，培养制得刺糖多孢菌的二级种子液；所述每升二级种子液培养基中含有葡萄糖:10.0-15.0 ;酵母粉:2.0-2.5 ;大豆蛋白胨:8.0-10.0 ；K2HPO4:0.2-0.4 ；MgS04:0.3-0.4，单位:克 / 升。
[0011]作为上述技术方案的另一更进一步改进，在所述刺糖多孢菌发酵液制备阶段中，在发酵开始前，是将所述刺糖多孢菌的二级种子液制备阶段制得的二级种子液以10% (v/v)接种量接入发酵培养基中，进行培养，所述每升发酵培养基中含有葡萄糖:60.0-70.0 ；麦芽糖:10.0-20.0 ;棉籽粉:20.0-25.0 ;大豆蛋白胨:8.0-10.0 ;酵母粉:20.0-25.0 ；CaCO3:1.0-1.5 ；K2HPO4:0.2-0.4 ;豆油:10.0-15.0，单位:克 / 升。
`[0012]本发明方法是根据刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的特性提出的。刺糖多孢菌发酵动力学属于生长部分相关型，即在刺糖多孢菌菌体的快速生长阶段有少量的多杀菌素合成，此阶段若溶氧太低将会使糖代谢缓慢，菌体生长不良，从而影响后期的多杀菌素合成；若溶氧太高则会使菌体生长过于旺盛，底物完全氧化的比例过高，也不利于后期的多杀菌素的合成，因而刺糖多孢菌菌体生长阶段溶氧条件的控制很重要。而刺糖多孢菌菌体生长进入稳定期后，是多杀菌素大量合成的阶段，此阶段溶氧的高低也会制约多杀菌素的产量。本发明的一种两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，遵循了刺糖多孢菌菌体生长和多杀菌素合成两个阶段的不同溶氧需求而实施的两阶段溶氧控制的策略，提高了多杀菌素产量，缩短了发酵周期，具有重要的工业应用价值。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实例对本发明的【具体实施方式】作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0014]大规模生产多杀菌素的过程通常包括下述四个阶段:(I)刺糖多孢菌的孢子制备；(2)刺糖多孢菌的一级种子液制备；(3)刺糖多孢菌的二级种子液制备；(4)刺糖多孢菌发酵液制备，本发明是在刺糖多孢菌发酵液制备过程中进行的分阶段溶氧控制，具体过程为:
[0015]在刺糖多孢菌发酵一开始，将初始ha控制在lOO-UOtT1 ;在发酵进行到菌体生长对数生长末期(通常为发酵90-100小时内)时，将初始I^a控制在60-921^，以实现两阶段
溶氧控制，使多杀菌素产量达到最大。
[0016]本发明提供的一种两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，其实施可优选如下步骤:
[0017](I)刺糖多孢菌的孢子制备
[0018]将刺糖多孢菌冻干管中的冻干粉转接进入斜面培养基中，28°C活化10天。所述刺糖多孢菌菌株(Saccharopolyspora spinosa)购自美国典型培养物保藏中心(Americantype culture collection),其保藏号为ATCC 49460,经过NTG化学诱变、紫外线物理诱变和原生质体融合，得到的一株改良菌株，Saccharopolyspora spinosa_RBB207。
[0019]所述斜面培养基(单位:克/升)中含有葡萄糖:10.0-15.0 ;酪蛋白:2.0-3.0 ;酵母粉:1.0-2.0 ;琼脂；15.0-20.0。
[0020](2)刺糖多孢菌的一级种子液制备
[0021]将(I)制得的活化后刺糖多孢菌孢子接入刺糖多孢菌的一级种子培养基中，在30°C下培养72小时，制得刺糖多孢菌一级种子液。
[0022]所述每升一 级种子培养基(单位:克/升)含有葡萄糖:10.0-15.0;酵母粉:2.0-2.5 ;酪蛋白:2.0-2.5 ；K2HPO4:0.2-0.4 ；MgS04:0.3-0.4。
[0023](3)刺糖多孢菌的二级种子液制备
[0024]将(2)制得的一级种子液以10% (v/v)接种量接入10L发酵罐的二级种子培养基中，在30°C下培养72小时，制得刺糖多孢菌的二级种子液。
[0025]所述每升二级种子液培养基(单位:克/升)中含有葡萄糖:10.0-15.0 ;酵母粉:
2.0-2.5 ;大豆蛋白胨:8.0-10.0 ；K2HPO4:0.2-0.4 ；MgS04:0.3-0.4。
[0026](4)刺糖多孢菌发酵液制备及发酵过程溶氧控制
[0027]将(3)制得的二级种子液以10% (v/v)接种量接入100L发酵罐的发酵培养基中，在30°C下进行培养，并且在发酵一开始，通过调节通气量和搅拌转速调控，将初始k#控制在lOO-UOtT1 ;在发酵进行到菌体生长对数生长末期(通常为发酵90-100小时内)时，通过调节通气量和搅拌转速，将初始kp控制在60-921^，以实现两阶段溶氧控制，使多杀菌素产量达到最大，制得刺糖多孢菌发酵液。
[0028]所述每升发酵培养基(单位:克/升)中含有葡萄糖:60.0-70.0 ;麦芽糖:
10.0-20.0 ;棉籽粉:20.0-25.0 ;大豆蛋白胨:8.0-10.0 ;酵母粉:20.0-25.0 ；CaCO3:
1.0-1.5 ；K2HPO4:0.2-0.4 ;豆油:10.0-15.0。本发明中k#值采用排气法测定。
[0029]对于100L发酵罐，在发酵一开始时，通常是将通气量调节为0.3-0.7vvm,搅拌转速调节为100-200rpm，在发酵进行到菌体生长对数生长末期，通常是将通气量调节为
0.3-0.5vvm，搅拌转速调节为 100-150rpm。
[0030]实施例1
[0031]本发明提供的一种两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，其具体步骤如下:
[0032]1.刺糖多孢菌的孢子制备
[0033]将刺糖多孢菌冻干管中的冻干粉转接进入斜面培养基中，28°C活化10天，制得刺糖多孢菌孢子。
[0034]所述每升斜面培养基(单位:克/升)中含有葡萄糖:10.0 ;酪蛋白:2.0 ;酵母粉:1.0 ;琼脂；15.0。
[0035]2.刺糖多孢菌的一级种子液制备
[0036]将步骤I中制得刺糖多孢菌孢子接入刺糖多孢菌一级种子培养基中，在30°C下培养72小时，制得刺糖多孢菌一级种子液。
[0037]所述每升一级种子培养基(单位:克/升)含有葡萄糖:10.0 ;酵母粉:2.0 ;酪蛋白:2.0 ；K2HPO4:0.2 ；MgSO4:0.3。
[0038]3.刺糖多孢菌的二级种子液制备
[0039]将步骤2中制得的一级种子液以10% (v/v)接种量接入IOL发酵罐的二级种子培养基中，在30°C下培养72小时，制得刺糖多孢菌二级种子液。
[0040]所述每升二级种子培养基(单位:克/升)中含有葡萄糖:10.0 ;酵母粉:2.0 ;大豆蛋白胨:8.0 ；K2HPO4:0.2 ；MgS04:0.3。
[0041]4.刺糖多孢菌发酵液的制备及发酵过程溶氧控制
[0042]将步骤3中制得的二级种子液以10% (v/v)接种量接入装液量为70% (V/V)的100L发酵罐的发酵培养基中，在30°C下培养至达到最大多杀菌素产量，制得刺糖多孢菌发酵液。
[0043]所述每升发酵培养基(单位:克/升)中含有葡萄糖:60.0 ;麦芽糖:10.0 ;棉籽粉:20.0 ;大豆蛋白胨:8.0 ;酵母粉:20.0 ；CaCO3:1.0 ；K2HPO4:0.2 ;豆油:10.0。
[0044]发酵过程的溶氧控制条件:在发酵初始将通气量控制在0.5vvm、转速控制在150rpm,使得初始I^a达到100.3h-1 ;发酵100小时菌体生长进入对数生长末期，从100小时开始至发酵结束将通气量控制在0.3vvm、转速控制在150rpm，使得100小时的初始k#达到91.4h-1。此两阶段溶氧控制使得多杀菌素产量在218小时达到60.9mg/L,生物量干重(DCff)达到 18.7g/L。
[0045]实施例2
[0046]斜面培养基、一级种子培养基、二级种子培养基、发酵培养基的组成及接种量与实施例I相同。
[0047]发酵过程的控制条件:在发酵一开始将通气量控制在0.5vvm、转速控制在200rpm,使得初始k#达到115.5h-1 ;发酵96小时菌体生长进入对数生长末期，从96小时开始至发酵结束将通气量控制在0.3vvm、转速控制在150rpm,使得96小时的初始k^a达到91.4h-1，此两阶段溶氧控制使得多杀菌素产量在196小时达到160.9mg/L，DCW达到24.1g/L0
[0048]实施例3
[0049]斜面培养基、一级种子培养基、二级种子培养基、发酵培养基的组成及接种量与实施例I相同。
[0050]发酵过程的控制条件:在发酵一开始将通气量控制在0.7vvm、转速控制在150rpm,使得初始I^a达到110.1tT1 ;发酵98小时菌体生长进入对数生长末期，从98小时开始至发酵结束将通气量控制在0.3vvm、转速控制在150rpm,使得98小时的初始k#达到91.4h-1，此两阶段溶氧控制使得多杀菌素产量在215小时达到70.lmg/L, DCW达到21.9g/L0
[0051]实施例4[0052]斜面培养基、一级种子培养基、二级种子培养基、发酵培养基的组成及接种量与实施例I相同。
[0053]发酵过程的控制条件:在发酵一开始将通气量控制在0.3vvm、转速控制在180rpm,使得初始Ka达到ΙΟδΙ1 ;发酵99小时菌体生长进入对数生长末期，从99小时开始至发酵结束将通气量控制在0.3vvm、转速控制在150rpm,使得99小时的初始k^a达到91.411，此两阶段溶氧控制使得多杀菌素产量在217小时达到79.7mg/L, DCW达到21.5g/L0
[0054]实施例5
[0055]斜面培养基、一级种子培养基、二级种子培养基、发酵培养基的组成及接种量与实施例I相同。
[0056]发酵过程的控制条件:在发酵一开始将通气量控制在0.7vvm>转速控制在200rpm,使得初始I^a达到129.811 ;发酵90小时菌体生长进入对数生长末期，从90小时开始至发酵结束将通气量控制在0.3vvm、转速控制在150rpm,使得90小时的初始k#达到91.411，此两阶段溶氧控制使得多杀菌素产量在194小时达到90.3mg/L, DCW达到25.1g/L0
[0057]实施例6
[0058]斜面培养基、一级种子培养基、二级种子培养基、发酵培养基的组成及接种量与实施例2相同。
[0059]发酵过程的控制条件:在发酵一开始将通气量控制在0.5vvm>转速控制在200rpm,使得初始k#达到115.511 ;发酵96小时菌体生长进入对数生长末期，从96小时开始至发酵结束将通气量控制在0.3vvm、转速控制IOOrpm,使得96小时的初始k^a达到60.611，此两阶段溶氧控制使得多杀菌素产量在201小时达到110.6mg/L，DCW达到22.2g/L0
[0060]实施例7
[0061]斜面培养基、一级种子培养基、二级种子培养基、发酵培养基的组成及接种量与实施例3相同。
[0062]发酵过程的控制条件:在发酵一开始将通气量控制在0.5vvm、转速控制在200rpm,使得初始k#达到115.511 ;发酵96小时菌体生长进入对数生长末期，从96小时开始至发酵结束将通气量控制在0.5vvm、转速控制在130rpm,使得96小时的初始k^a达到7111，此两阶段溶氧控制使得多杀菌素产量在199小时达到150.lmg/L，DCW达到24.4g/L。
[0063]实施例8
[0064]斜面培养基、一级种子培养基、二级种子培养基、发酵培养基的组成及接种量与实施例3相同。
[0065]发酵过程的控制条件:在发酵一开始将通气量控制在0.5vvm>转速控制在200rpm,使得初始k#达到115.511 ;发酵96小时菌体生长进入对数生长末期，从96小时开始至发酵结束将通气量控制在0.4vvm、转速控制在130rpm,使得96小时的初始k^a达到661Λ此两阶段溶氧控制使得多杀菌素产量在200小时达到145.7mg/L，DCW达到23.9g/L。
[0066]实施例9-14
[0067]表一中列出了实施例9-14的分阶段控制条件，产量及发酵时间和培养基成分，旨在指出与其它实施例中不同条件及所得的结果。
[0068]表一
[0069]
【权利要求】
1.一种两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，在刺糖多孢菌发酵液制备阶段，当刺糖多孢菌发酵一开始时，调控初始氧体积传质系数ha至100 /小时-130 /小时，促进刺糖多孢菌生物量积累；当发酵进入到菌体生长对数生长末期时，再调控初始氧体积传质系数kp至60 /小时-92 /小时，促进多杀菌素合成与积累。
2.根据权利要求1所述的两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，其特征在于，所述调控是指调节通气量和搅拌转速。
3.根据权利要求1所述的两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，其特征在于，在刺糖多孢菌发酵液制备阶段之前，该方法还依次包括以下阶段:刺糖多孢菌的孢子制备阶段；刺糖多孢菌的一级种子液制备阶段；以及刺糖多孢菌的二级种子液制备阶段。
4.根据权利要求1、2或3所述的两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，其特征在于，所述刺糖多孢菌的孢子制备阶段具体包括下述过程: 将刺糖多孢菌冻干管中的冻干粉转接进入斜面培养基中，活化后经过N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍化学诱变、紫外线物理诱变和原生质体融合，得到改良菌株； 所述斜面培养基中含有葡萄糖:10.0-15.0 ;酪蛋白:2.0-3.0 ;酵母粉:1.0-2.0 ;琼脂；15.0-20.0，单位均为克/升。
5.根据权利要求1、2或3所述的两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，其特征在于，所述刺糖多孢菌的一级种子液制备阶段具体包括下述过程: 将所述刺糖多孢菌的孢子制备阶段制得的活化后刺糖多孢菌孢子接入刺糖多孢菌的一级种子培养基中，培养制得刺糖多孢菌一级种子液； 所述每升一级种子培养基含有葡萄糖:10.0-15.0 ;酵母粉:2.0-2.5;酪蛋白:.2.0-2.5 ；K2HP04:0.2-0.4 ；MgS04:0.3-0.4，单位均为克 / 升。
6.根据权利要求1、2或3所述的两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，其特征在于，所述刺糖多孢菌的二级种子液制备阶段具体包括下述过程: 将所述刺糖多孢菌的一级种子液制备阶段制得的一级种子液以10% (v/v)接种量接入二级种子培养基中，培养制得刺糖多孢菌的二级种子液； 所述每升二级种子液培养基中含有葡萄糖:10.0-15.0 ;酵母粉:2.0-2.5 ;大豆蛋白胨:8.0-10.0 ；K2HPO4:0.2-0.4 ；MgS04:0.3-0.4，单位均为克 / 升。
7.根据权利要求1、2或3中任一所述的两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，其特征在于，在所述刺糖多孢菌发酵液制备阶段中，在发酵开始前，是将所述刺糖多孢菌的二级种子液制备阶段制得的二级种子液以10% (v/v)接种量接入发酵培养基中，进行培养，所述每升发酵培养基中含有葡萄糖:60.0-70.0 ;麦芽糖:10.0-20.0 ;棉籽粉:20.0-25.0 ；大豆蛋白胨:8.0-10.0 ;酵母粉:20.0-25.0 ；CaCO3:1.0-1.5 ；K2HPO4:0.2-0.4 ;豆油:.10.0-15.0，单位均为克/升。
8.根据权利要求5中所述的两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，其特征在于，在所述刺糖多孢菌发酵液制备阶段中，在发酵开始前，是将所述刺糖多孢菌的二级种子液制备阶段制得的二级种子液以10% (v/v)接种量接入发酵罐的发酵培养基中，进行培养，所述每升发酵培养基中含有葡萄糖:60.0-70.0 ;麦芽糖:10.0-20.0 ;棉籽粉:20.0-25.0 ；大豆蛋白胨:8.0-10.0 ;酵母粉:20.0-25.0 ；CaCO3:1.0-1.5 ；K2HPO4:0.2-0.4 ;豆油:.10.0-15.0，单位均为克/升。
9.根据权利要求1、2或3所述的两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，其特征在于，所述刺糖多孢菌菌株(Saccharopolyspora spinosa)购自美国典型培养物保藏中心(American type culture collection),其保藏号为 ATCC 49460,经过 NTG 化学诱变、紫外线物理诱变和原生质体融合，得到的一株改良菌株，Saccharopolyspora spinosa_RBB207。
10.根据权利要求1、2或3中任一所述的所述的两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，其特征在于，所述初始 氧体积传质系数kLa值采用排气法测定。
【文档编号】C12R1/01GK103667404SQ201210336241
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月12日 优先权日:2012年9月12日
【发明者】余龙江, 白云, 周蓬蓬 申请人:华中科技大学