一种多杀菌素的发酵方法
【专利摘要】本发明公开了一种多杀菌素的发酵方法，包括如下步骤：（1）将能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104经斜面培养、种子培养，得到种子液；（2）将种子液接种到发酵培养基中，发酵；在发酵0-12h时添加硬脂酸，在40-56h时添加异丁醇，在90-105h时添加甘氨酸，丙氨酸和缬氨酸，共发酵192-216h。本发明的方法可使多杀菌素产量最高达到531.7mg/L。另外，这种培养方法所添加的物质成分单一，针对性更强，对于研究多杀菌素发酵过程的调控过程具有一定的指导意义。
【专利说明】一种多杀菌素的发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种多杀菌素的发酵方法，属于微生物发酵领域。
【背景技术】
[0002]多杀菌素是由刺糖多孢菌生产的一种大环内酯类农用抗生素，兼具出色的杀虫效果和环保特性。作为一种广谱的生物农药，多杀菌素对昆虫的毒害有高度的选择性，其对非靶标生物基本无毒或低毒，对哺乳动物无致癌、致畸、致突变或神经毒性。目前，制约多杀菌素实现产业化和广泛推广应用的主要问题在于生产成本高，发酵工艺复杂，发酵效能低。培养基优化和菌株改造是目前国内多杀菌素研究的重点，李能威等通过单因素、多因素试验和2次正交试验获得最优发酵培养基，使多杀菌素产量达395.4mg/L，较对照提高62.5%。梁艳等通过紫外线诱变筛选得到一株具有鼠李糖和丙酸钠抗性的突变株，添加前体正丙醇后产量达到125.3mg/L,比初始菌株提高了 285.5% ;但继续提高产量效果都不明显。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种多杀菌素的发酵方法。
[0004]本发明的技术方案概述如下:
[0005]一种多杀菌素的发酵方法，包括如下步骤:
[0006](I)将能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104经斜面培养、种子培养，得到种子液；
[0007](2)将种子液以接种量10% - 15%的比例接种到发酵培养基中，于30°C、200 - 250rpm发酵；在发酵O - 12h时添加硬脂酸，使浓度为1.0 - 2g/L，在40 - 56h时添加异丁醇，使浓度为1.8 - 2.5g/L，在90 - 105h时添加甘氨酸使浓度为0.3 - lg/L，添加丙氨酸使浓度为0.2 - 0.8g/L和添加缬氨酸使浓度为0.1 - 0.5g/L，共发酵192 - 216h。
[0008]发酵培养基组份按g/L计:葡萄糖50-70、麦芽糖10-20、棉籽蛋白20_30、豆粉10-15、酵母膏 10-25，K2HPO40.5-2，NaCl0.5-2，MgS042_3，CaC035_7，余量为水，ρΗ=7.2-8.0。
[0009]步骤(2)优选为:将种子液以接种量10%的比例接种到发酵培养基中，于30°C、220rpm发酵；在发酵Oh时添加硬脂酸，使浓度为1.0g/L,在48h时添加异丁醇，使浓度为
2.2g/L，在96h时添加甘氨酸使浓度为0.5g/L，添加丙氨酸使浓度为0.5g/L和添加缬氨酸使浓度为0.25g/L，共发酵192h。
[0010]本发明的方法可使多杀菌素产量最高达到531.7mg/L。另外，这种培养方法所添加的物质成分单一，针对性更强，对于研究多杀菌素发酵过程的调控过程具有一定的指导意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为重组质粒构建过程图。
[0012]图2是重组质粒pLUlOl的质粒图谱。[0013]图3是重组质粒pLU102的质粒图谱。
[0014]图4是重组质粒pLU104的质粒图谱。
[0015]图5是多杀菌素野生菌株与多杀菌素基因工程菌发酵结果。
[0016]图6是重组质粒pLUlOl验证电泳图。
[0017]图7是重组质粒pLU102验证电泳图。
[0018]图8是重组质粒pLU104验证电泳图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例对本发明作进一步说明。但本发明的保护范围不能认为仅局限于下述【具体实施方式】，在不脱离本发明基本构思的前提下，所属领域的技术人员据此作出的简单推演或同等替换方案，均属于本发明的保护范围。
[0020]各实施例的斜面培养基组分按g/L计为酪蛋白胨2.5，葡萄糖5，牛肉膏3，琼脂20，硫酸镁2，余量为水，pH=7.5，115°C高压蒸汽灭菌20min。
[0021]种子培养基(g/L):葡萄糖10，N-Z-Amine A (酸水解酪蛋白)30，酵母膏1.0，牛肉膏1.0，MgS042.0，余量为水，灭菌前pH=7.3。
[0022]实施例1
[0023]1.基因元件克隆和含有对应基因原件的质粒构建
[0024]将包含ermE*启动子(SEQ ID N0.23)的pIB139质粒用HindIII和XbaI酶切消化，所用酶为Fermentas Fast Taq限制性内切酶,酶切体系如下:目的DNA片段30ng,加入2 μ LlOXbuffer，限制性内切酶Hin`dIII和XbaI各I μ L(内切酶最后加入)，补充蒸馏水至20 μ L0将酶切体系置于37°C 30min，得到0.3kb的包含ermE*启动子的HindIII/Xbal片段。将该HindIII/Xbal片段插入质粒p0J260，得到p0J261质粒。
[0025]用引物对spnK-F-Ndel (SEQ ID N0.1)和 spnK-R-Xbal (SEQ ID N0.2)从刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa) ATCC49460 (以下简称刺糖多胞菌 ATCC49460)染色体中获取spnK基因序列并扩增，再用Ndel和Xbal酶切消化spnK的PCR产物。随后将处理过的片段插入到同样被Ndel和Xbal酶切消化的p0J261质粒中，得到重组pLUlOl质粒，质粒验证见图6。
[0026]本发明所用per酶为北京全式金生物技术有限公司的pfu聚合酶，PCR扩增体系如下:依照下述在冰上配制PCR反应体系，先加水，最后加pfu聚合酶；
[0027]
DNI 模機1.P L
Forward primer(10 P i)4 P L
Reverse primer(10 μ Μ)4P L
d^TP(2.ami)5 P 1.10 X Buffer10 μ L
Pfu 聚介_I μ L
dcIH2025 μ L
总体积SOpL[0028]在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、退火10秒、72°C延伸I分钟(32个循环)；72°C延伸8分钟(I个循环)。
[0029]本发明中涉及到的寡核苷酸引物列于表1。
[0030]表1引物序列
[0031]
【权利要求】
1.一种多杀菌素的发酵方法，其特征是包括如下步骤: (1)将能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104经斜面培养、种子培养，得到种子液； (2)将种子液以接种量10%- 15%的比例接种到发酵培养基中，于300C>200 - 250rpm发酵；在发酵O - 12h时添加硬脂酸，使浓度为1.0 - 2g/L，在40 - 56h时添加异丁醇，使浓度为1.8 - 2.5g/L，在90 - 105h时添加甘氨酸使浓度为0.3 - lg/L，添加丙氨酸使浓度为0.2 - 0.8g/L和添加缬氨酸使浓度为0.1 - 0.5g/L，共发酵192 - 216h。
2.根据权利要求1所述的一种多杀菌素的发酵方法，其特征是所述发酵培养基组份按g/L计:葡萄糖50-70、麦芽糖10-20、棉籽蛋白20-30、豆粉10-15、酵母膏10-25，K2HPO40.5-2，NaCl0.5-2, MgS042_3，CaC035_7，余量为水，pH=7.2-8.0。
3.根据权利要求1所述的一种多杀菌素的发酵方法，其特征是所述步骤(2)为:将种子液以接种量10%的比例接种到发酵培养基中，于30°C、220rpm发酵；在发酵Oh时添加硬脂酸，使浓度为1.0g/L,在48h时添加异丁醇，使浓度为2.2g/L，在96h时添加甘氨酸使浓度为0.5g/L，添加丙氨酸使浓度为0.5g/L和添加缬氨酸使浓度为0.25g/L，共发酵192h。
【文档编号】C12R1/01GK103725733SQ201310756416
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】卢文玉, 王美玲, 赵方龙, 尹静 申请人:天津大学