专利名称：：一种多杀菌素半固体发酵生产方法
技术领域：
：本发明涉及一种抗生素的发酵方法，具体地说，涉及一种无公害的生化农药多杀菌素Spinosyn的简便可行的半固体发酵生产方法。
背景技术：
：多杀菌素Spinosyn是美国陶氏公司发现的一种非常优秀的生化农药，由于多杀菌素具有对害虫高活性且对哺乳动物安全，对害虫选择性强，有利于保护害虫天敌，在自然环境中容易降解等等优点而荣获美国总统颁发的绿色化学品挑战奖。多杀菌素自发现以来，一直是以液体深层通气培养进行发酵生产。工艺上釆用二级发酵或三级发酵，发酵原料用葡萄糖、玉米淀粉、胨化牛奶、棉仁粉、酵母浸出物(粉)、玉米浆、油酸甲酯等。发酵周期9天左右。液体深层通气培养法有很多工艺上的优点，如生产规模大，容易控制杂菌污染，产品容易提纯，发酵效价高等等。但其缺点也是明显的，比如设备投资太大。对于多杀菌素这一种产品来说，液体发酵所要求的有些发酵原料要进口，而且价格比较贵，而且对发酵设备的要求也比较苛刻，导致国内许多企业想上多杀菌素但条件无法达到而不敢问津。本申请发明人利用我国传统的酿造技术结合现代发酵工业的方法，创造性地提出了多杀菌素的半固体发酵思路，并经过反复试验和完善而成。经查新检索，未见有半固体发酵生产多杀菌素的公开报道和专利申请。
发明内容本发明的目的是提供一种多杀菌素Spinosyn的简便可行的半固体发酵生产方法。本发明人研究了多杀菌素产生菌刺糖多孢菌(&cc/^ra;o/;^wra)之后，认为可以用一些在我国很容易得到的农副产品如红薯、豆饼(粕)、棉籽饼，麦麸等等代替上述较贵的液体发酵原料，进行多杀菌素发酵。为满足菌种对氧气的需求，选择了珍珠岩、玉米芯颗粒等疏松多孔的物质为载体，通过调整适当的加水量，使发酵料通透性适度，从而解决了菌丝生长发育和代谢过程中的供氧问题。为了解决有关固体发酵容易污染的问题，釆用了中国科学院化学过程工程研究所李佐虎教授发明的固体发酵罐(简称李氏罐)或直接用转锅进行发酵，同时配合大的接种量和早期喷少量纳他霉素加以解决。发酵结束之后，将物料在李氏罐中直接风干或经其它干燥设备如沸腾床干燥之后，用甲醇、乙醇或醋酸乙酯等有机溶剂浸提，即可以收获发酵产生的多杀菌素。浸提过的发酵残渣经粉碎之后，可作为肥料施于田间，或作为杀虫农药直接撒施于菜叶面上，可以在肥田的同时杀死部分土壤害虫和叶面上食叶的害虫。为了实现本发明目的，本发明的一种多杀菌素(Spinosyn)的半固体发酵生产方法，其釆用农副产品作为半固体发酵培养基的主要碳氮源，以珍珠岩、玉米芯颗粒等疏松多孔的物质为载体。本发明所述的农副产品为玉米粉、米粉、魔芋粉、红薯粉、麦麸、棉籽饼粉、菜籽饼粉、豆饼(粕)粉等。其中，本发明的半固体发酵培养基中，碳源分为快速利用的碳源和缓慢利用的碳源两种，快速利用的碳源选择葡萄糖、甘露醇、甘露糖、半乳糖等；缓慢利用的碳源选用玉米粉、米粉、魔芋粉、红薯粉、麦麸等。缓慢利用的碳源物质其细度以过80120目筛为宜。本发明所述载体的颗粒以10~20目大小为宜。用量为发酵培养基的10-70%(W/W)。本发明的半固体发酵培养基中的氮源也分为快速利用和缓慢利用的两种，快速利用的氮源选用玉米浆、谷氨酸钠、蛋白胨；缓慢利用的氮源选用棉籽饼粉、菜籽饼粉、豆饼(粕)粉、酵母粉，棉籽饼粉、菜籽饼和豆饼粉细度以100-120目为宜。在本发明的半固体发酵培养基中，快速利用的碳源(单糖)占1~10%(各单糖重量:培养基干重)，缓慢利用的碳源占2~30%(同上，W/W)。快速利用的氮源占0~5%，缓慢利用的氮源占2~25%。其中氮源物质优选为玉米浆用量为0~3%，蛋白胨、酵母粉用量为0~3%,谷氨酸钠用量为0~3%,棉籽粉用量为0-22%,豆饼粉用量为0~20%。半固体发酵培养基用水量为1:1.0-1.40(干物质重:水，W/V)，该含水量已经将液体种子培养基中的水量包括在内。本发明以摇瓶发酵或液体发酵罐发酵的方式制备半固体发酵的多杀菌素生产菌种子，其种子培养基配方为葡萄糖0~6%,甘露醇2~8%,棉籽粉0~4.2%,黄豆饼粉0~2.2%，浸出物(粉)0~1.0%,鱼蛋白胨0~1%，CaCO30.2~0.5%。对于生产所用菌种，本发明的多杀菌素半固体发酵生产方法适用于所有多杀菌素生产菌种，无论其来源，也无论是其株系，均可以用于本发明生产方法。发酵结束后，将发酵物料风干或经其它干燥设备如沸腾床干燥之后，用甲醇、乙醇或醋酸乙酯等有机溶剂浸提，即可收获发酵产生的多杀菌素。釆用本发明所述半固体发酵法发酵所获得的发酵物料，风干之后经粉碎配以润湿剂、表面活性剂、渗透剂等即生产出多杀菌素粉剂。多杀菌素粉剂中的润湿剂选用JFC、拉开粉、十二烷基苯磺酸钠性剂选用木质素磺酸钠、NNO、Sopa中的一种或两种；渗透剂选用氮酮、噻酮、渗透剂-T中的一种。本发明通过筛选和优化组合，选择几种适合发酵Spinosyn的半固体发酵培养基，以农副产品作为碳氮源，选择珍珠岩、玉米芯颗粒等疏松多孔的物质为载体，在固体发酵罐中或其它密封容器中发酵生产多杀菌素。达到节省Spinosyn原药发酵生产设备投资和回避液体深层通气培养生产法Spinosyn的一些技术难题。在同等施用浓度下，本方法生产的多杀菌素产品与巿售多杀菌素产品防治小菜蛾、棉铃虫的效果差异不显著。图l为本发明所述多杀菌素(Spinosyn)的半固体发酵生产工艺流程图。具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例l液体种子培养基配方葡萄糖2.5%、甘露醇4%、棉籽粉2%、鱼蛋白胨1%、CaCO30.2%，其余为水，消前pH7.5。半固体发酵培养基配方玉米粉5%、魔芋粉12%、葡萄糖5%、甘露醇5%、棉籽粉6%、豆饼粉6%、酵母粉3%,余下部分以珍珠岩补足到100%，pH自然。包括液体种子在内的总用水量1:1.36(培养基干物质重:水，W/V)。本发明所述多杀菌素(Spinosyn)的半固体发酵生产工艺流程如图l所示，具体过程如下在配料罐中按种子培养基配方配制好300L发酵液之后压入500L种子罐，121。C蒸汽湿热灭菌30分钟之后，降温到3(TC接种多杀菌素生产菌种的孢子悬液，接种量为每300L种子培养基中接3个茄式瓶斜面孢子。在温度3(TC，搅拌转速210rpm条件下通气培养。接种后8小时之内通气量1:0.4(V/V)，8小时至24小时之内通气量1:0.8(V/V),24小时后，通气量增加到1:1.2(V/V)，直至移种。种子培养时间为72小时。在配料池中按半固体发酵培养基配方配1吨干料的培养基，将各种干物质充分混合均匀之后加水，加水量为1060公斤，再充分混合均匀。将配好的湿培养基装入5立方的灭菌转锅(巿售)。通入蒸汽，按转锅的操作规定进行半固体发酵培养基的湿热灭菌。灭菌温度121°C，保温时间45分钟。灭菌结東后尽快将料温降至3(TC，然后通过无菌管道将上述培养好的种子液接入灭过菌的无菌固体发酵培养基中，边接种边转动转锅。接种完毕即直接在转锅中通气发酵。在发酵过程中，转锅保持缓慢转动，转速每分钟20转。发酵过程中控制料温在28。C-3(TC,通气量0.4MV分(接种24小时之内)至0.6MV分(接种24小时之后)。发酵3天之后，视发酵情况，采取喷雾的方法补充无菌水，防止发酵料过干，为防止霉菌生长，可在补充的无菌水中加300ppm的钠他霉素，达到补水同时防治霉菌污染的目的。半固体发酵周期为288小时。此例发酵效价每克干料中含多杀菌素2591)Lig。实施例2液体种子培养基配方葡萄糖1%、甘露醇6%、棉籽粉2.2%、鱼蛋白胨0.5%、CaCO30.3%,消前pH7.5。半固体发酵培养基配方米粉5%、麦麸5%、魔芋粉8%、甘露醇8%、棉籽粉7%、豆饼粉5%，谷氨酸钠2%、玉米浆1%,用少许生石灰将pH调到7.0。余下部分以玉米芯颗粒补足到100%。包括种子液在内的总用水量为1:1.32(培养基干物质重:水，W/V)。液体种子发酵培养办法与过程同实施例1。半固体发酵培养基的配制办法同实施例1，但是在干料中加水的量为1020公斤。半固体发酵培养基的灭菌办法和接种办法均与实施例1相同。接种完毕之后，将转锅的出料口朝下对准底下一专用无菌室的进料口，对正之后在设备外面喷70%的酒精消毒并用无菌帆布将接缝处包扎严密。用李氏固体发酵罐专用不锈钢盘接在无菌室的进料口下，进行发酵料装盘。每盘中装料厚度为3cm左右，每盘上平铺无菌湿纱布(双层)一块。通过无菌室专用的出口将料盘装入已灭过菌的李氏固体发酵罐中，关闭罐盖，通入无菌空气进行发酵。半固体发酵周期为240小时。此例发酵效价每克干料中含多杀菌素3386yg。实施例3液体种子培养基配方甘露醇7.8%、棉籽粉4.2%、鱼蛋白胨0.8%、CaCO30.4%，消前pH7.2。半固体发酵培养基配方红薯粉5%、麦麸10%、魔芋粉5%、葡萄糖6.8%、棉籽粉10%、磷酸二氢钾0.3%、菜籽饼粉5%，余下部分以珍珠岩补足到100%。包括种子液在内的总用水量为1:1.25(培养基干物质重:水，W/V)。液体种子发酵培养办法与过程同实施例1。半固体发酵培养基的配制办法同实施例1,但是在干料中加水的量为950公斤。半固体发酵培养基的灭菌办法和接种办法均与实施例2相同。此例在李氏半固体发酵罐中发酵，发酵周期为264小时。此例发酵效价每克干料中含多杀菌素3148jag。实施例4液体种子培养基配方葡萄糖6%、甘露醇2%、棉籽粉4.2%、酵母浸出物(粉)0.5%、CaCO30.2%，消前pH7.2。半固体发酵培养基配方葡萄糖6%、红薯粉6%、麦麸5%、魔芋粉5%、甘露糖4%、棉籽粉10%、酵母粉1.5%、豆饼粉4%、蛋白胨1.5%、CaC030.5%，余下部分以玉米芯颗粒补足到100%,pH自然。包括种子液在内的总用水量为1:1.26(培养基干物质重:水，W/V)。液体种子发酵培养办法与过程同实施例1。半固体发酵培养基的配制办法同实施例1，但是在干料中加水的量本实施例为960公斤。加水并充分混合均匀之后，半固体发酵培养基的灭菌办法和接种办法均与实施例1相同。接种后直接在转锅中发酵，具体办法同实施例l。半固体发酵周期为252小时。此例发酵效价每克干料中含多杀菌素2673jag。实施例5多杀菌素粉剂直接生产方法收取实施例3中的半固体发酵料进行风干，风的温度为40°C,经24小时物料干透。用锤片式粉碎机将物料粉碎至120目，加进3%木素磺酸钠和5%JFC(江苏宜兴助剂厂生产)，充分混匀后用120目振动筛筛去不易粉碎的麸皮等粗渣。经检测，120目细粉的效价为3277|ig/g,即成为多杀菌素含量为0.3%的粉剂半成品，经塑料袋包装即成为0.3%的多杀菌素成品。此种产品用细土、细砂、炉灰等粉末稀释10倍-50倍后可以直接在田间撒施。实施例6半固体发酵料中多杀菌素的提取收取实施例4中的半固体发酵物料，在45r条件下风干，经8小时物料基本干后。用95%工业酒精，按1:3.5(干料:酒精,W/V)浸泡过夜，浸提罐的温度控制为50°C-52°C。滤出酒精溶液之后，再按l:3比例加酒精浸泡一次，50°C-52°C，24小时。收集两次浸泡所得之酒精溶液，在真空浓缩锅中用45°C，进行脱溶，回收酒精。将下来的水相(含大量油状物，主要是多杀菌素)，调pH至9.0,用醋酸乙酯(用量1:1,V/V)进行萃取，重复萃取2次。合并醋酸乙酯萃取液。同上，在45'C的真空浓缩锅脱溶回收醋酸乙酯至醋酸乙酯萃取液体积减少3/4,再加0.2mol/L的酒石酸溶液按1:1(V/V)体积进行反萃取。反萃取2次，收集水相。5(TC下减压至蒸去水相中的醋酸乙酯后调水相的pH至10.5，再用醋酸乙酯从水相中萃取出多杀菌素，方法同上，重复2次。合并醋酸乙酯萃取液，按上述方法脱溶至体积为原来的10%左右，趁热加入多杀菌素晶种，然后缓慢降温，结晶多杀菌素。按本实施例从2公斤发酵干料中提取得到多杀菌素晶体3.27克，纯度93.5%，总收得率58.3%。实验例1本实验例在于研究多杀菌素粉剂田间杀虫试验。用实施例5所试制的0.3%的多杀菌素粉剂3公斤加细砂57公斤，充分混匀，趁早上露水未干前撒施在花椰菜田间，注意尽量不要撒在空行和田沟里。共撒施约两亩田，以细砂为空白对照。按对角线取样法，两天后调查田间害虫死亡结果。各处理均调査30棵花椰菜。田间菜粉蝶防治效果97.5%，小菜蛾84.3%。实验例2本实验例在于研究本发明提取得到的多杀菌素晶体的室内毒力测定。将提取得的多杀菌素晶体配制成水悬剂，在实验室内按浸叶法进行昆虫生物活性测定。制剂中多杀菌素含量2.5%，试虫为从荷塘中釆到的斜紋夜蛾2龄幼虫和武汉天惠公司研究所养虫室飼养的3龄小菜蛾幼虫。以1.8%阿维菌素乳油剂和巿售的多杀菌素产品(菜喜悬浮剂，其多杀菌素含量为2.5%)为标准药剂对照，用清水做空白对照，观察48小时试虫死亡率，并分别计算其LCso，结果如下表l半固体发酵法所得多杀菌素对斜紋夜蛾毒力测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*试虫为从荷塘中荷叶上釆集的2龄幼虫。表1结果说明，半固体发酵的多杀菌素产品与巿售多杀菌素产品在室内对所试斜紋夜蛾幼虫毒力无明显差异。两种多杀菌素产品对斜紋夜蛾的毒力均比阿维菌素高，其结果与已有资料相符。表2半固体发酵法所得多杀菌素对小菜蛾毒力测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表2数据表明，半固体发酵法生产所得多杀菌素与巿售多杀菌素产品对小菜蛾幼虫的毒力测定结果无显著差异。而两种多杀菌素处理均明显优于阿维菌素处理的结果。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。权利要求1.一种多杀菌素的半固体发酵生产方法，其特征在于，其采用农副产品作为半固体发酵培养基的主要碳、氮源，以珍珠岩、玉米芯颗粒疏松多孔的物质为载体。2.根据权利要求l所述的多杀菌素的半固体发酵生产方法，其特征在于，所述的农副产品为玉米粉、米粉、魔芋粉、红薯粉、麦麸、棉籽饼粉、菜籽饼粉、豆饼(粕)粉。3.根据权利要求1或2所述的多杀菌素的半固体发酵生产方法，其特征在于，所述半固体发酵培养基中碳源分为快速利用的碳源和缓慢利用的碳源两种，快速利用的碳源选择葡萄糖、甘露醇、甘露糖、半乳糖；缓慢利用的碳源选用玉米粉、米粉、魔芋粉、红薯粉、麦麸。4.根据权利要求3所述的多杀菌素的半固体发酵生产方法，其特征在于，所述快速利用的碳源占1~10%(各单糖重量培养基干重)，所述缓慢利用的碳源占2~30%(同上，W/W)。5.根据权利要求l-4任意一项所述多杀菌素的半固体发酵生产方法，其特征在于，所述半固体发酵培养基的氮源分为快速利用和缓慢利用的两种，快速利用的氮源选用玉米浆、谷氨酸钠、蛋白胨；缓慢利用的氣源选用棉籽饼粉、菜籽饼粉、豆饼(粕)粉、酵母粉。6.根据权利要求5所述多杀菌素的半固体发酵生产方法，其特征在于，所述快速利用的氮源占0~5%，所述缓慢利用的氮源占2~25%。7.根据权利要求5或6所述多杀菌素的半固体发酵生产方法，其特征在于，所述氮源为玉米浆用量为0~3%,蛋白胨、酵母粉用量为0~3%,谷氨酸钠用量为0~3%，棉籽粉用量为0~22%,豆饼粉用量为0~20%。8.根据权利要求l-7任意一项所述的多杀菌素的半固体发酵生产方法，其特征在于，所述载体的用量为发酵培养基的10~70%(W/W)。9.根据权利要求1-8任意一项所述的多杀菌素的半固体发酵生产方法，其特征在于，所述半固体发酵培养基用水量为1:1.0-1.40(干物质重:水，W/V)。全文摘要本发明提供了一种多杀菌素(Spinosyn)的半固体发酵生产方法，其采用农副产品作为半固体发酵培养基的主要碳氮源，以珍珠岩、玉米芯颗粒等疏松多孔的物质为载体。本发明通过筛选和优化组合，选择几种适合发酵Spinosyn的半固体发酵培养基，以农副产品作为碳氮源，选择珍珠岩、玉米芯颗粒等疏松多孔的物质为载体，在固体发酵罐中或其它密封容器中发酵生产多杀菌素。达到节省Spinosyn原药发酵生产设备投资和回避液体深层通气培养生产法Spinosyn的一些技术难题。在同等施用浓度下，本方法生产的多杀菌素产品与市售多杀菌素产品防治小菜蛾、棉铃虫的效果差异不显著。文档编号C12P19/00GK101555510SQ20081010373公开日2009年10月14日申请日期2008年4月10日优先权日2008年4月10日发明者夏海洋,杨国军,林开春,肖凤平,贺玉平,黄昌华申请人:武汉天惠生物工程有限公司;武汉绿世纪生物工程有限责任公司