专利名称：含有生物标志物样本的高通量分析方法和样本库制备的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域。具体地，本发明涉及一种对于包含生物
标志物的样本进行高通量分析的方法；本发明还涉及一种用于高通量分析的
矩阵化排列样本的样本库的方法；本发明同时涉及根据本发明所述方法所制 备的样本库。
背景技术：
对生物组织来源的具有一定生物学意义的生物标志物以适当形式进行 分析，是生物医学研究中的一项重要命题。这种生物标志物分子是指包括但 不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或cDNA、蛋白、多肽、 脂质、多糖，通常要求以其相应生物医学属性，如分子量、所带电荷来进行 分离组4分化，以进行更有价值和准确的分析。
生物标志物分子的分离或组份化是由相关生物标志物分子所具有的一种 或多种属性而决定的、能够使其与其他成分分子相分离的方法，包括琼脂糖 电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、双向PAGE、等离子聚焦、离子交换 色谱、过滤色谱、疏水色谱、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、 气相色语、原子吸收、亲合色谱、梯度离心。经生物标志物分离组份化的方 法处理，生物标志物分子(群)以其本身属性与其他分子相区分，这些属性 包括分子量大小、电荷、有机相溶解性、亲合性、质量、形状、密度或颜 色。
例如，传统的RNA印迹技术(Northern blot)和蛋白免疫印迹技术 (Western blot)是广泛应用于分析样品中RNA和蛋白生物标志物分子大小 或含量的主要方法。Northern blot (对于RNA分子的分析)和Western blot (对于蛋白分子的分析)由Southern blot (对于DNA分子的分析)演化而 来(Southern， E. M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-517,此处作为文献引用)， 对一部分细胞或者组织而言这两种方法是检测分析生物标志物基因转录、 表达翻译的分子量和表达水平的必备检测方法。
尽管例如差异显示、RT-PCR或RNA保护检测(RPA)也适用于此种检测，但Northern blot分析和Western blot分析是对于特定生物标志物基因和特 定生物标志物蛋白分子量及表达水平的最佳检测方法。其它的检测方法由于 步骤复杂或引入酶的操作等而变得使用不便或者不通用。与其他方法比较， Northern blot分析和Western blot分析是对生物标志物基因和蛋白的实际情 况的最好检测方法，这两种方法在确定备选的生物标志物的断裂基因的大 小、生物标志物蛋白翻i奪后修饰、以及生物标志物基因和蛋白表达水平等方 面都是必不可少的重要手段。
Northern blot和Western blot方法使用多年，其具体操作仍同多年前一 致。在进行Northern blot时，对RNA生物标志物的琼脂糖电泳使用变性剂 诸如曱醛和甲醛胺，因为RNA分子群每分子携带一单位负电子，RNA生物 标志物在琼脂糖中的迁移速度取决于其核酸长度和分子大小。
凝胶上组份化的RNA核酸生物标志物可以一皮点样于尼龙或者硝酸纤维 膜上制成Northern blot。在Northern blot分析中，可以加入带有标记核苦酸 和靶核苷酸互补片段的探针对特定RNA生物标志物片段进行杂交探测。 Northern blot可以同时进行RNA生物标志物定量并测定其分子大小。
Western blot与Northern blot方法的不同是由于蛋白质生物标志物与 RNA生物标志物的根本性质不同。蛋白质依照其不同的氨基酸构成可以携 带负电荷或者正电荷。
为了得到基于分子量的整齐一致的梯度或系列排列的组份化蛋白分子 标志物，在蛋白上样緩冲液和其电泳凝胶中加入了十二烷基硫酸钠(SDS)， 二 疏苏糖醇(DTT)和|3-巯基乙醇。SDS是阴离子去垢剂，以特定的1.4: 1 质量比同蛋白质结合，其所携带的负离子电荷数同蛋白片段的长度成正比。 所有的蛋白分子同SDS结合后，整齐一致地携带负电荷，另外还原剂如二 疏苏糖醇(DTT)和p-mecarptoethanol ((3-巯基乙醇)可以打断蛋白质二硫键， 以避免蛋白质的高级结构影响凝胶电泳。
经过凝胶电泳后，凝胶可以进行染色分析或者进一步将蛋白转移到支持 膜上来进行Western blot分析。为检测Western blot的特定蛋白生物标志物， 针对特定靶生物标志物(抗原)的抗体与杂交膜一起孵育。结合的生物标志 物-抗体复合物进一步进行化学发光、荧光、或》文射测定。如同Northern blot 一样，Western blot可以同时进行蛋白生物标志物分子量大小和表达水平定 量测定。
传统Northern blot和Western blot分析是对于上述目的最主要的实验方法，然而，它们在一张膜上所能提供的样品容量是很有限的， 一般一张膜上
不会超过10个样品，此种缺陷使Northern或Western blot在大规模和高通 量生物标志物分析中具有纟艮大的局限性。
随着人类基因组计划完成而出现的多达30,000个以上的新基因，使得对 于生物标志物的高通量分析变得紧迫，美国专利6,582,969和6,576,478 (Wagner等人)显示一种方法及其微型装置可以对于生物分子进行高通量筛 选。
这类微型装置包含特別的微型机械或者微型操作通路，带有多个内置非 连续反应位点，由固化在单层结构上的生物分子部分通过亲合标记特别分子 从而发生底物反应。这些微型装置可以筛选通道中流过的在功能或结构上相 关的分子成分。美国专利6,537，749(Kuimelis等人)显示可溯源的阵列蛋白， 其中核酸同蛋白融合物由一个接头层偶连在一固体层上，这个接头层一头是 一个空间部分、另一头是另一寡核苷酸序列，同带有阵列分子群的偶连寡核 苷酸序列相互补。
这些阵列技术可以提供对于生物标志物的高通量的筛选方法，但它们都 必须同不可移动的介质和亲合集团相构建，进一步而言，这些技术没有同上 述传统Northern blot和Western blot检测方法相结合的主观意图，因而不能 检测如mRNA或蛋白分子的片段大小等指标。因此，改进这些装置的相关缺 陷，建立一种高通量的篩选系统就变得十分必要，这个系统具备更高的检测 灵敏度并能实现高通量的筛选分析，而在同时却只消耗最少的宝贵样品。
由于以上原因，很明显地，需要特别设计一种方法和相关仪器来高通量 筛选生物标志物，这种仪器和方法可以将分子组份化技术和微阵列技术方法 有效结合，从而创建一种更灵敏、消耗更少宝贵样品的方法来进行高通量筛 选相关生物标志物。
发明内容
除非另外说明，本文中使用的术语"生物标志物"是指对生物组织来源 的具有一定生物学意义的物质，其包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧 核糖核酸(DNA)或cDNA、蛋白、多肽、脂质和/或多糖。
除非另外说明，本文中使用的表述"组份化"是指由相关生物标志物分 子所具有的一种或多种属性而决定的、能够使其于其他成分分子相分离的方 法，其包括但不限于琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、双向PAGE、等离子聚焦、离子交换色谱、过滤色谱、疏水色镨、高效液相色谱(HPLC)、 薄层色谱(TLC)、气相色谱、原子吸收、亲合色谱和/或梯度离心。
除非另外说明，本文中使用的术语"一级设定序列"是指在组份化媒 介中依照参数如时间、距离或者相应排列设定的序列；本文中使用的术语 "次级设定序列，，是指按照组份化样本的来源而设定的序列。
除非另外说明，本文中使用的表述"HT Northern blot，，和"HT Western blot"分别表示"高通量核酸印记法"和"高通量蛋白印记法"，是指来源于 众多不同样本的经过组份化分离的mRNA或蛋白以矩阵形式进行印迹分析 以检测相关mRNA或蛋白生物标志物的表达模式，其原理和应用方式同处 理车交少才羊品的传统Northern blot或Western blot相类近。
本发明的目的在于，提供一种适应于生物标志物的高通量筛选系统的解 决方法，如将上述的Northern blot分析或Western blot分析结合，根据生物 标志物的不同属性及由此而产生的不同组份化方法和途径相结合。具体地， 本发明的一个目的在于，提供一种对包含生物标志物的样本进行高通量分析 的方法。本发明的另一个目的在于，提供一种用于高通量分析的矩阵化排列 样本的样本库的制备方法。本发明的又一个目的在于，提供一种根据本发明 所述的方法所制备的样本库。
针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案
一方面，本发明提供一种对于包含生物标志物的样本进行高通量分析的 方法，所述方法包括如下步骤
(1) 、将所述包含生物标志物的原始样本以能够分离所述包含生物标志物 的方法进行组份化，并依照其进行组份化方法所产生的参数所设定的一级设 定序列和根据所述样本来源所设定的次级设定顺序，使得到的包含生物标志 物的组份化样本在组份化媒介上进行排列或表达，优选地，所述样本来源为 生物组织来源；
(2) 、从所述组份化介质上回收所述组份化样本，使回收得到的每一个組 份化的样本，都确保依照步骤(l)中所设定的一级设定序列和次级设定序 列进行分序和排列；
(3) 、按照步骤(1)中所设定的一级设定序列和次级设定序列，将所回 收到的包含生物标志物的组份化样本在支持材料上进行矩阵排列即矩阵化 上样，所述支持材料优选为硝酸纤维素、尼龙、塑料、玻璃、多孔板和磁珠等；
(4)、进行高通量分析所述矩阵化上样的样本，从而对所述生物标志物进 行检测、分析和/或预测；优选地，所述高通量分析为对矩阵化上样的核酸样 本进行Northern blot分析或对矩阵化上样的蛋白样本进行Western blot分析。
优选地，所述方法为^f全测来源于众多不同组织的生物标志物的表达模式 的高通量4企测方法，所述方法包括对每个不同组织来源的样本重复步骤(l) 和(2),使所有不同组织来源的包含生物标志物的样本都完成组份化过程和回 收过程。
优选地，所述生物标志物的类型包括核酸如核糖核酸(RNA)、脱氧 核糖核酸(DNA)和/或cDNA,蛋白，多肽，脂质和/或多糖。
优选地，所述步骤(1)的组份化处理，是以生物标志物分子的自身属 性优选为生物医学属性来分离为所述一级i殳定序列排列的样本，优选地，所 述属性选自分子量大小、电荷、有机相溶解性、亲合性、质量、形状、密 度和颜色；更优选地，所述分离方法选自以下的一种或几种琼脂糖凝胶电 泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、 二维PAGE、等电聚焦、离子交换色谱、 过滤色i普、疏水色谱、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、气相色谱、 原子吸收、亲合色谱和梯度离心。
优选地，步骤(l)中所设定的一级设定序列所依据的参数包括距离、 时间和/或顺序，所述距离、时间和/或顺序是所述包含生物标志物的组份化 样本在该组份化媒介中的迁移距离、时间和/或顺序，或是所述包含生物标志 物的组份化样本在该组份化:! 某介之外的迁移距离、时间和/或顺序。
优选地，步骤(l)中所i殳定的一级设定序列可以^4居样本的切分点如 由相伴随的分子量标准所指示的组份的分子量的大小作为切分点进行排列； 更优选地，所述系列样本的分界点可与伴随的分子量标准呈线性、对数或指 数关系；和/或所述一级设定序列为自然形成序列或由任一方式重新安排的序 列。
优选地，所述样本的组织来源选自以下的一种或几种血液、胎盘、 膀胱、大脑、脑额叶、脑海马、脑枕叶、脑顶页、脑颞叶、乳房、小脑、结 肠、食道、心脏、肾脏、肝脏、肺脏、肌肉、卵巢、胰腺、直肠、皮肤、小 肠、十二指肠、小肠回肠、小肠空肠、脾脏、胃、睾丸、扁桃腺、子宫宫颈
和子宫宫体。
优选地，步骤(2)中所述回收方法以自动化方式进行，或是使用相关试剂盒或商品化仪器来进行。
优选地，步骤(l)中所述的一级设定序列排列的包含生物标志物的组 份化样本在步骤(3)所述的每个支持材料上进行上样的组份化样本的数目
为2到500,000。
优选地，步骤(3)中对所述的包含生物标志物的组份化样本矩阵化上 样的步骤可以按照任意主观设定的序列或任意次序来进行。
优选地，步骤(3)中的所述矩阵化上样的方法为通过微阵列点样仪器 自动或不借助仪器手工进行。
优选地，对步骤(3)中所述的支持材料进行电荷或化学修饰操作以增 强其分子结合能力，所述才喿作包括聚赖氨酸化、甲硅烷基化、硅烷化。
优选地，所述方法的步骤(4)包括如下操:作
(4.1)选择并设计可以与步骤(3)所述的矩阵排列在支持材料上的生 物标志物相结合并相互作用的探针分子；优选地，所述探针分子选自核糖 核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、蛋白质、抗体和经化学修饰的蛋白；进 一步优选地，所述经化学修饰的蛋白是指经化学标记、萤光标记、放射同位 素标记或质诿分析激光标记的蛋白质探针。
(4.2 )分析步骤(3)中所述的按照步骤(1)所述的相应的一级序列和次级 序列排列的包含生物标志物的组份化样本所呈现的表达状况；和
(4.3 )检测并分析预测步骤(l)中所述生物标志物的属性。 进一步优选地，所述方法包括将步骤(4.1)中所述纟笨针分子与所述支
所述探针分子的孵育或杂交过程可以手动操作或自动化进行。
进一步优选地，步骤(4.2)的分析和/或(4.3)检测包括分析和/或检
其方法选自化学法、化学发光法、荧光法、放射法和质谱分析法。
用的探针分子数量的操作是以手动进行的，例如使用胶片手工曝光；或是使 用仪器进行的，例如使用微点阵扫描仪来进行。
优选地，所述步骤(4)包含生物标志物的组份化样本的表达模式的分析； 优选地，所述分析包括通过数学计算和计算机图像处理和数据分析等高通量 方式处理并生成相应数据库。
优选地，所述数学计算是用于确定步骤(l)中所述的在组份化媒介之中或r厶'
离或
时间,
优选地，所述计算机图像处理及其数据分析是用于确定步骤(l)中所述的 以 一级设定序列和次级设定序列排列生物标志物分子的数量。
优选地，所述的计算机图像处理及其数据分析是用于放大处理包含生物 标志物的组份化样本的微点阵图像。
另 一方面，本发明提供一种用于高通量分析的矩阵化排列样本的样本库 的制备方法，所述方法包括如下步骤
(1) 、将所述包含生物标志物的原始样本以能够分离所述包含生物标志物 的方法进行组份化，并依照其进行组份化方法所产生的参数所设定的 一级设 定序列和根据所述样本来源所设定的次级设定顺序，使得到的包含生物标志 物的组份化样本在组<分化4某介上进行排列或表达，优选地，所述样本来源为 组织来源；
(2) 、从所述组份化介质上回收所述组份化样本，使回收得到的每一个组 份化的样本，都确保依照步骤(1)中所设定的一级设定序列和次级设定序 列进行分序和排列；
(3) 、按照步骤(1)中所设定的一级设定序列和次级设定序列，将所回
持材料优选为硝酸纤维素、尼龙、塑料、玻璃、多孔板和》兹珠。
优选地，所述方法中的原始样本为来源于不同个体的不同组织的含生物 标志物的样本，所述方法包括对每一个体的不同组织来源的样本重复步骤(l) 和(2),使所有不同组织来源的包含生物标志物的样本都完成组份化过程和回 收过程。
优选地，所述生物标志物的类型包括核酸如核糖核酸(RNA)、脱氧 核糖核酸(DNA)和/或cDNA,蛋白，多肽，脂质和/或多糖。
优选地，所述步骤(1)的组份化处理，是以生物标志物分子的自身属 性优选为生物医学属性来分离为所述一级设定序列排列的样本，优选地，所 述属性选自分子量大小、电荷、有机相溶解性、亲合性、质量、形状、密 度和颜色；优选地，所述分离方法选自以下的一种或几种琼脂糖凝胶电泳、 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、 二维PAGE、等电聚焦、离子交换色谱、过滤 色谱、疏水色谱、高效液相色语(HPLC)、薄层色谱(TLC)、气相色谱、原 子吸收、亲合色谱和梯度离心。优选地，步骤(1)中所设定的一级设定序列所依据的参数包括距离、 时间和/或顺序，所述距离、时间和/或顺序是所述包含生物标志物的组份化 样本在该组份化々某介中的迁移距离、时间和/或顺序，或是所述包含生物标志 物的组份化样本在该组份化々某介之外的迁移距离、时间和/或顺序。
优选地，步骤(1)中所设定的一级设定序列可以根据样本的切分点如
由相伴随的分子量标准所指示的组份的分子量的大小作为切分点进行排列； 优选地，所述系列样本的分界点可与伴随的分子量标准呈线性、对数或指数 关系；和/或所述一级设定序列为自然形成序列或由任一方式重新安排的序 列。
优选地，所述样本的组织来源选自以下的一种或几种血液、胎盘、膀 胱、大脑、脑额叶、脑海马、脑枕叶、脑顶页、脑颞叶、乳房、小脑、结肠、 食道、心脏、肾脏、肝脏、肺脏、肌肉、卵巢、胰腺、直肠、皮肤、小肠、 十二指肠、小肠回肠、小肠空肠、脾脏、胃、睾丸、扁桃腺、子宫宫颈和子 宫宫体。
优选地，步骤(2)中所述回收方法以自动化方式进行，或是使用相关 试剂盒或商品化仪器来进行。
优选地，步骤(1)中所述的一级设定序列排列的包含生物标志物的组 份化样本在步骤(3)所述的每个支持材料上进行上样的组份化样本的数目 为2到500,000。
优选地，步骤(3)中对所述的包含生物标志物的组份化样本矩阵化排 列的步骤可以按照任意主观设定的序列或任意次序来进行。
优选地，步骤(3)中的所述矩阵化排列的方法为通过微阵列点样仪器 自动或不借助仪器手工进行。
优选地，对步骤(3)中所述的支持材料进行电荷或化学修饰操作以增 强其分子结合能力，所述操作包括聚赖氨酸化、甲硅烷基化、硅烷化。
另一方面，本发明提供一种根据本发明所述的方法所制备的样本库，所 述样本库包含生物标志物的矩阵化排列的样本和所述样本在其上进行矩阵 化排列的支持材料。
根据本发明的一个优选的实施方案，本发明纟是供一种对于相同组织(群) 或不同组织(群)的包含生物标志物的众多分子(群)而来的多种分子组分 (群)进行高通量分析的方法，包括以下步骤
(l)对于所述的众多分子组份(群)依照其生物标志物的属性以至少一种组份化方法或两种及以上的方法组合对其进行组^除化， <吏之成为 一种谱系排 列或包含生物标志物的组份化分子(群)亚群的一系列分子组份(群)。其 中，所述的包含生物标志物的分子组份谱系或一系列组^分(群)依照其进行 组份化方法所产生的参数，如距离、时间、顺序，所i殳定的一级设定序列，
或表达；
(2) 从该组份化介质上回收经组份化的包含生物标志物的系列分子使所 述的回收得到的每一个组份化的包含生物标志物的分子组份，都确保依照步 骤(1)中所设定的一级设定序列和次级设定序列进行分序和排列；
(3) 按步骤(1)所述指定的一级设定序列和次级设定序列，将所回收到 的包含生物标志物的组份化系列分子群以矩阵排列在支持材料；
(4) 选择并设计可以同步骤(3)所述的矩阵排列在支持材料上的生物标 志物相结合并相互作用的探针分子；
(5) 分析步骤(3)中所述的按照步骤(l)所述的相应的 一级和次级序列排列 的包含生物标志物的组份化分子(群)所呈现的表达状况；
(6) 检测并分析预测步骤(l)中所述的生物标志物的属性。
根据本发明的一个更加优选的实施方案，步骤(4)所述探针分子同支 持材料上矩阵排列的生物标志物分子(群)之间的酵育和杂交步骤。
根据本发明的一个更加优选的实施方案，步骤(4)所述的检测矩阵排
法、化学发光法、荧光法、放射法或质谱分析法。
根据本发明的一个更加优选的实施方案，步骤(1)所述的含有生物标 志物的组份化分子(群)是来源于相同或不同組织(群)的具有相同或不同 属性的，可以依照其属性而经相应组份化方法进行组份化成为一个镨系排列 或者一系列组份(群)的相同或不同的包含生物标志物的組份化分子混合物。
根据本发明的一个进一步优选的实施方案，所述的组4分化方法中，包含 生物标志物的组份化分子包含但并不限于核酸(DNA， cDNA或RNA)、 蛋白质、多肽、脂质或多糖。
根据本发明的一个更加优选的实施方案，步骤(l)中所述的经组份化 处理的包含生物标志物的分子保持其初始或者进一步处理后的状态。.
根据本发明的一个更加优选的实施方案，步骤(1)所述的包含生物标 志物的组份化分子(群)的属性，是指包含^f旦不限于分子量大小、所带电荷、溶解性、质量、密度、亲合力、体积或颜色。
根据本发明的一个更加优选的实施方案，步骤(1)中所述的组份化方
法，是指由以下分离方法所选取的，包含但不限于琼脂糖凝胶电泳，聚丙 烯酰胺凝胶电泳(PAGE)， 二维PAGE，等电聚焦，离子交换色谱，过滤色谱， 疏水色谱，高效液相色谱(HPLC),薄层色镨(TLC)，气相色谱，原子吸收， 亲合色谱和梯度离心。
根据本发明的一个进一步更加优选的实施方案，所述组份化方法可以是 其中两个方法的组合或两个以上分离方法的组合。
根据本发明的一个更加优选的实施方案，步骤(l)中所述的距离、时 间，可以是包含生物标志物的组份化分子(群)在该组份化媒介中的迁移距 离、时间，也可以是包含生物标志物的组份化分子(群)在该组份化媒介之 外的迁移距离、时间。
根据本发明的一个更加优选的实施方案，步骤(l)中所述的组份化方 法，可以根据系列的切分点进行.例如由相伴随的分子量标准所指示的组份 的分子量的大小作为切分点进行。
根据本发明的一个更加优选的实施方案，所述的主观确定的系列组份分 界点可与伴随的分子量标准呈线性,对数，或指数关系。
根据本发明的一个更加优选的实施方案，步骤(l)中所述的一级设定 序列可以是所述的包含生物标志物的组份化分子(群)的自然形成序列，或 由任一方式重新安排的序列。
根据本发明的一个更加优选的实施方案，步骤(2)中所述的回收方法
进行分离的方法。
根据本发明的一个更加优选的实施方案，步骤(2)中所述的回收方法 可以自动化方式进4亍。
根据本发明的一个更加优选的实施方案，步骤(2)中所述的回收方法 可以使用相关试剂盒或者市场提供的商品化仪器来进行。
根据本发明的一个更加优选的实施方案，步骤(3)中所述的包含生物
点样仪器自动或不借助仪器手工进行。
根据本发明的一个更加优选的实施方案，步骤(l)中所述的一级设定 序列排列的包含生物标志物的组份化分子上样于步骤(3)所述的每个支持材料上的组份数量可以在2到500,000之间变化。
根据本发明的一个更加优选的实施方案，步骤(3)中所述的包含生物 标志物的组份化分子(群)矩阵化上样的步骤可以按照任意主观序列或任意 次序进行。
根据本发明的一个更加优选的实施方案，步骤(3)中的支持材料可以 从以下材料中挑选，包括但不限于硝酸纤维素、尼龙、塑料、玻璃、多孔 板及珠。
根据本发明的一个进一步优选的实施方案，所述的支持材料可以进行电 荷或化学修饰操作以增强分子结合能力，这些操作包含但不限于聚赖氨酸 化、甲硅烷基化、硅烷化。
根据本发明的一个进一步优选的实施方案，步骤(4)中所述的探针分 子包括RNA(核糖核酸)，DNA(脱氧核糖核酸)，蛋白质，抗体，或经化学 修饰的蛋白，这种化学修饰的蛋白是指经化学标记、萤光标记、放射同位素 标记或者质谱分析的激光标记的蛋白质探针。
根据本发明的一个进一步优选的实施方案，所述的探针分子的孵育或杂 交过程可以手动操作或自动化进行。
根据本发明的一个进一步优选的实施方案，所述的支持材料上与生物标 志物相互作用的探针分子数量的检测步骤可以手动执行，例如在组份化分 子(群)数量较少时在实验室条件下使用胶片手工曝光，或者也可以使用仪 器进行，例如在支持材料上有较多组份化分子(群)可使用仪器如微点阵扫 描仪进行。
根据本发明的一个进一步优选的实施方案，所述的包含生物标志物的组 份化分子(群)表达模式分析可以通过数学计算、计算机图像处理和数据分 析等高通量方式处理并生成相应数据库。
根据本发明的一个进一步优选的实施方案，所述的数学计算可以准确确
;列的包:生物标志物的组份化分子(群)的迁移-巨离或时:司t
根据本发明的一个进一步优选的实施方案，所述的计算机图像处理及其
数据分析确定权利要求1步骤(l)中所述的以一级设定序列和次级设定序列
排列生物标志物分子的数量。
根据本发明的一个进一步优选的实施方案，所述的计算机图像处理及其
数据分析可以放大处理包含生物标志物的组份化分子(群)的微点阵图像。根据本发明的一个进一步优选的实施方案，所述的计算机图像处理及其
数据分析所需的组份化分子的样品数量比传统的Western blot (免疫印迹)分 析或Northern Blot(RNA印迹)分析所需的样品数量要少几十甚至几百倍以 上。
根据本发明的一个进一步优选的实施方案，所述的包含生物标志物的组 份化分子(群)直接矩阵化上样于支持材料将比传统的Western blot (免疫印 迹)分析或Northern Blot(RNA印迹)分析会产生更强的信号和更高的检测灵 敏度。
根据本发明的一个进一步优选的实施方案，所述的计算机图^f象处理及其 数据分析的方法，可直接包含生物标志物的从组份化分子(群)中采集、分 析和转换成相应的婆史据库，而Western blot (免疫印迹)分析或Northern Blot(RNA印迹)分析无法做到。
根据本发明的另 一个优选的实施方案，本发明提供一种从相同组织(群) 或不同组织(群)的众多分子(群)生成的包含生物标志物的分子组份的高 通量处理方法，其步骤包括
(1) 以可组份化的方式提供所述组织来源的包含生物标志物的众多分子 组份(群)；
(2) 对于所述的包含生物标志物的众多分子组份(群)依照其属性以至 少 一种组份化方法对其进行组份化，使之成为 一个谱系排列或包含组份化分 子亚群的一系列包含生物标志物的分子组份，在其中，所述的分子组份谱系 或所述的一系列组份群依照其组份化方法的参数，如距离、时间、顺序，以 特定的一级设定序列同时以相关来源组织(群)的次级设定序列在可以进行 组份化的媒介上进行组份化排列或表达；
(3) 从该组份化媒介中回收得到的经组份化的包含生物标志物的系列 组份化分子(群)使所述回收到的每一个组份化的包含生物标志物的分子 组份(群)，都确保依照步骤(2)指定的一级设定序列和次级设定序列进行 分序和排列；
(4) 按步骤(2)所述特定的一级设定序列和次级设定序列，将相应的 回收得到的包含生物标志物的系列组份化分子(群)以矩阵方式上样于支持 材料上，使其可以以一种高通量方式被进一步操作。
根据本发明的另 一个优选的实施方案，本发明提供从众多不同组织(群) 或相同组织(群)而来的生物标志物的一种高通量的表达模式检测方法，所述方法包含以下步骤
(1) 以可被组份化的方式提供从上述大量不同组织(群)或相同组织(群)
而来的众多包含生物标志物的分子组份；
(2) 对于所述的包含生物标志物的众多分子群依照其属性以至少一种组 份化方法或组合对其进行组份化，4吏之成为 一种谱系排列或包含组份化分子
(群)亚群的一系列包含生物标志物的分子组份，在其中，所述的分子组份 谱系或包含生物标志物的一系列组份(群)依照其进行组份化方法的参数， 如距离、时间、顺序，以特定的一级设定序列同时以相关来源组织样品的次
(3) 从该组份化介质上回收经组份化的包含生物标志物的系列分(群) 使所述回收到的每一个包含生物标志物的组份化的分子组份，都确保依照步 骤(2)指定的一级设定序列和次级设定序列进行分序和排列；
(4) 对每个所述的不同组织或相同组织重复步骤(2)和(3),使所有不同组 织或相同组织来源的包含生物标志物的分子组份都完成组份化过程和回收 过程；
(5) 根据步骤(2)所述特定的一级设定序列和次级序列将所述的从众多
材料上，以进行步骤(6)的操作或进行后续操作；
(6) 选择并设计适当的探针分子，这种探针分子可以同矩阵化排列于步 骤(5)所述的支持材料上的生物标志物相互作用，以使前述众多不同组织或相 同组织而来的生物标志物产生理想的表达模式；
(7) 分析并且对比从所述的众多不同组织或相同组织而来的依照步骤(2) 所述的特定一级设定序列和次级设定序列排列的包含生物标志物的矩阵組 份化分子(群)的表达特点；
(8) 检测和分析步骤(2)所述的生物标志物的属性。 根据本发明的一个进一步优选的实施方案，所述众多不同组织样品，包
括但不限于由人体或动物组织而来的血液、胎盘、膀胱、大脑、脑额叶、 脑海马、脑枕叶、脑顶页、脑颞叶、乳房、小脑、结肠、食道、心脏、肾脏、 肝脏、肺脏、肌肉、卯巢、胰腺、直肠、皮肤、小肠、十二指肠、小肠回肠、 小肠空肠、脾脏、胃、睾丸、扁桃腺、子宫宫颈和子宫宫体。
本发明是关于釆用微点阵矩阵化方式的高通量(HT)生物标志物分析 技术。包含生物标志物的分子依据其属性被组份化处理并生成相应的一级设定序列，并以相应分子(群)的组织来源生成其次级设定序列，使每个组份 化的包含生物标志物的分子(群)可以实现寻址和溯源。依照一级设定序列 和次级设定序列以高通量方式对所述的包含生物标志物的组份化分子(群) 进行回收、矩阵点样、分析检测。生物标志物属性可以被4全测和分析。本发 明同现有生物标志物分析方法相比，提供以下创新点高敏感性、包含生物 标志物的材料的低消耗、高通量的处理平台、可以直接生成相应数据库进行 分析。
本发明涉及生物标志物高通量矩阵分析技术。本发明的高通量分析技术
在传统生物标志物分析4支术例如Northern blot、 Western blot、 Southern blot 和protein 2-D blot的基础上引入采用矩阵模式从而建立起一种高通量分析 技术。
生物标志物，无论是DNA、 RNA、蛋白、脂类或多糖分子，都是以其 分子量大小和电荷而分离组份化。从多种样品而来的被分离组份化的分子 (群)，同时标记以一级设计序列和次级设计序列，也依照同样的一级设计 序列和次级设计序列排列进行组份的回收，然后再点样到支持材料上，依旧 以相同的一级设计序列和次级设计序列进行相关组份的排列。
为对本发明进行说明的方便，分子量或分子大小在此例中作为mRNA 和蛋白生物标志物的主要参数，据此特性分离相应分子。对于不同的靶生物 标志物可以使用多种不同方法以使分子量或分子大小不易区分的mRNA和 蛋白生物标志物得到相对应的区别和分析。生物标志物的分子量或者分子大 小在基因转录和翻译表达过程中是很关键的参数，在本发明中，众多组织样 品中以特别设定的 一级设定序列、次级设定序列来标记相关生物标志物用以 进行高通量分析相应分子的表达模式及基因和蛋白表达水平。
本发明的适用领域包括但不限于升级替代传统的Northern blot或 Western blot分析才支术，本发明还适用于由生物标志物不同属性所决定的采 用多种不同组份化方法的生物标志物的多种不同的分才斤检测。
本发明所涉及的生物标志物类型包括，但不限于核酸，(例如核糖 核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA))或cDNA 、蛋白、多肽、类脂、多糖。
本发明中所涉及的生物标志物分离组份化方法是指依照生物标志物的 一种或多种属性而使其于其他分子相分离并产生一个谱系分子组份或一系 列分子组份的方法，这些方法包括但不限于琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶 电泳(PAGE)、双向PAGE、等电聚焦、离子交换色谱、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、气相色谱、原子吸收、亲合色谱、梯度离心。利用以上 组份化方法，生物标志物由以下属性而分离组份化分子量大小、电荷、有 机溶解性、亲合力、质量、形状、密度及颜色等。本发明适用的分离组份化 方法包含全部使生物标志物与其他分子相区分并产生分子谱系或一系列分 子组^盼的方法。
本发明的 一个具体应用是提供一种从相同或不同组织来源的生物标志 物分子(群)而来的生物标志物高通量分析方法。
第一步骤为组份化，是对于所述的多种生物标志物分子组份(群)依照其 相应的分子属性组份化而使之成为包含生物标志物的 一个i普系或一 系列组 份(群)的一个或多个组份化样本。在进行组份化才乘作的同时或之前，包含 生物标志物的谱系排列或者系列都被设计为一级:没定序列和次级设计序列。 一级设定序列可以依照相关分子以某一组份化方法在组份化媒介中所安排 或表现出来的顺序，例如距离、时间或顺序等相关参数来设定。用于设定基 本设定序列的距离或时间可以是包含生物标志物的组份化分子(群)在组份 化媒介的迁移泳动距离和时间或者是包含生物标志物的组份化分子(群)从 媒介中所迁移出的距离或时间。基本设定序列是指以相应系列组份在组份化 媒介(如凝胶)中任一自然发生的顺序，或者是主观重新设定的顺序。
在本发明中，所指的包含生物标志物的组份化分子(群)可以是由各种 分子所具备的相似或不同属性而采取的相似或不同分离组份化的方法处理 得到的由相似或不同的生物分子所组成的单 一体或混合物。
所述包含生物标志物的组份化分子(群)可以包括，但不限于以相应 初始形态(如顺序)或者后续操作方便而变更的形态并经组份化处理及其回 收处理而得到的核酸(DNA, cDNAor RNA)、蛋白、多肽、类脂、多糖。组 份化分子(群)的属性是指常被用于获得理想的分子组份化形态的属性，包 括但不限于分子量、电荷、溶解性、重量、密度、亲合性、质量、颜色。 适用于本发明的组份化方法可以是指由以下众多的方法中所挑选出来的多 种分离方法，包括但不限于琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、双 向PAGE、等电聚焦、离子交换色谱、过滤色谱、疏水色谱、高效液相色谱 (HPLC)、薄层色谱法(TLC)、气相色谱、原子吸收、亲合色谱、梯度离心。 需要特别说明的是，本发明适用的组份化方法是能够分离组份化生物标志物 相关分子组份(群)方法中的一种或者两种以上及其组合。确切地说，当分 子组份(群)需要确定其区分位置时，可以主观选择使用如分子量等作为参置，包括使用分子量标准品的 线性、对数或者指数关系来确定分子组份的切分位置。
第二步骤为回收，分离组份化过程一经完成，即可回收在组份化媒介上 的包含生物标志物的组份化系列分子组份(群)。
为了清楚地显示和回溯所回收的包含生物标志物的组份化分子的特性及来 源，同时也为使高通量操作成为可能，每一系列包含生物标志物的组份化分 子的排列顺序严格遵守该系列组份化分子(群)在回收时所设定的一级设定 序列和相应的次级i殳定序列进行排列。
因此，含有生物标志物的系列组份化分子(群)拥有与组份化媒介上排 列或表现相同的"设计地址"。就此意义而言，本发明区别与其他技术的一 个独特特点，即建立一种"可寻址，，机制，根据其相关性来追踪、归类相关 组份组群。之后，适用于高通量分析的支持材料上系列组份化分子的排列和 矩阵方式也依同理进行。在此需要说明的是，以上所述的回收步骤也可以主 观进行。具体而言，回收步骤可以釆用全自动方式或者借助市场提供的商品 化工具或材料进行。
第三步骤为矩阵化排列，是对于包含生物标志物的系列组份化分子在支 持材料上按照一级设定序列和次级设定序列进行矩阵化排列的过程，以使系 列矩阵化的组份化分子可以依照序号而追溯其样品组织来源及群组归属。对 于在支持材料上矩阵布置的包含生物标志物的组^P分化分子(群)的上样过程 可以使用自动微型点样仪器自动完成，也可以手工方式完成。本发明中每个 支持材料上以一级^L定序列和次级设定序列上样的分子组份(群)的数目可
以为2个到500,000。
另外，上样步骤可以按主观序列进行。支持材料可以包括本行业众多的 材料选择。在本发明应用中，本发明的支持材料包括但不限于硝酸纤维素、 尼龙、塑料、玻璃、多孔板或磁珠。本发明中，支持材料还可以进一步被电 荷处理或者化学处理使之具有结合增强分子，例如多聚赖氨酸或者曱硅烷基 化和硅烷化等支持材料。
第四步骤为设计和选撙，探针，是设计和选择同吸附于支持材料上的包含
生物标志物的系列组份化分子(群)相互作用的揮:针分子。这个步骤进一步 包含对探针分子和吸附于支持材料上的包含生物标志物的组份化分子矩阵 进行孵育和杂交的过程。这种孵育和杂交的处理过程一经结束，与支持材料上生物标志物相互作用的相关探针分子数量由其检测方法确定，这种方法包
括化学法、化学发光法、荧光法或者放射活性方法。
在本发明中，探针分子可以是进行化学标记、荧光标记、放射同位素标 记的RNA、 DNA、蛋白、抗体或者修饰蛋白。这个才企测过程可以是手工进 行，例如在包含生物标志物组份化分子(群)的数目较少时在实验室条件下 釆用胶片曝光法，也可以采用相应仪器来进行，例如当支持材料上具有较多 含有生物标志物的组份化分子点阵时使用微点阵阅读仪。
第五步骤为分析回归处理，本发明提供一个附加的应用是一种依照其一 级设定序列与次级设定序列对于含有生物标志物的组份化分子(群)的表达 模式进行分析和回归的步骤。这种对于含有生物标志物的系列组份化分子表 达模式的优选应用是借助于计算机化图像和数学分析计算以高通量形式生 成所需数据库。这种数学计算分析可以精确测算一级设定序列和次级设定序 列的含有生物标志物系列组份化分子(群)在组份化媒介之中或之外的迁移 距离和时间，这种计算机图像和数字化分析可以精确测算基本和次级设定序 列的含有生物标志物的系列组份化分子数量。进一步地，这种计算机图像和 数据分析可以放大含有生物标志物的系列组份化分子(群)的微阵列点的图 像。因此，由于计算机化图像和数据处理的应用，本发明中所需的组份化分 子数量将远少于传统Northern blot分析或Western blot分析。同时，与传 统的Northern blot分析或Western blot分析方法相比，本发明中含有生物 标志物的系列组份化分子上样于支持材料可以提供更强信号从而显著加强 检测灵敏度。
由于计算机化的图像处理和数据采集可以直接采集、分析并实现生物标 志物组份化分子(群)信息向数据库的转换。由于本发明可以从大量组织样 品而来，例如多种不同或相同组织样品而来的生物标志物系列组^f分化分子 (群)高通量分析处理平台，本发明优于传统Northern blot分析或Western blot分析，具有它们不具备的优势。
本发明的一个具体应用是提供一种从相同或不同的组织样品的含有生物 标志物的众多分子(群)的高通量操作方法。这种方法包括如下步骤
(1 )提供来源于相同或不同组织样品适用于组份化方法的含有生物标 志物的大量分子(群)；
(2)使用至少一种组4分化方法将众多含有生物标志物的分子(群)组 份化为一个谱系或者包含系列组份化分子亚群的系列组份(群)，所述的含有生物标志物的系列分子组份(群)设定以相应一级设定序列和次级设定序 列，其中一级设定序列依照相应的组份化方法、根据组份化4某介的组份化参
数，如距离、时间、或者组^阶顺序而i殳定；
(3 )以相同的一级设定序列和次级设定序列从该组4分化々某介上回收所 述的含有生物标志物的系列分子组份；以及
(4)为下一步操作方便，以步骤(2)中相同的一级设定序列和次级设 定序列将组份化分子群矩阵排列在支持材料上。
本发明的另 一个具体应用是提供一种高通量地评估众多不同组织起源 不同含有生物标志物的分子组份群的表达模式的方法。确切而言，这种方法 可以比较不同组织来源的分子组份(群)，这种组织来源可以是从不同的细 胞系或不同的组织。因为使用相同的处理方法处理所有的分子组份(群)， 所以本发明是高通量地评估众多不同组织来源的含有生物标志物的相应分 子(群)的特异表达模式和特异生物活性的一种优异方法。
在实践中，本方法提供多种不同来源适宜组份化方法的含有生物标志物 的分子组份群；对于所述的组织如一个组织而来的含有生物标志物的不同分 子组份(群)进行组份化，依照其相应属性，并使用所述的至少一种组份化 方法，使所述的分子组份(群)组份化成为一个谱系或一系列包含亚群的系 列分子组份(群)。此处所述含有生物标志物的每一谱系或者系列组份(群) 是指以一级设定序列和次级设定序列而设定标记的，此一级i殳定序列是指在 组份化媒介中依照参数如距离、时间或者相应排列设定的序列，次级设定序 列是指按照该组^f分样本的组织来源而设定的序列(例如血液样品l、血液 样品2、血液样品3等)；重复组份化操作以使上述不同来源的含有生物标志 物的分子组份(群)全部被分离组份化；从所述组份化媒介上回收一个组织 来源的含有生物标志物的一系列组份(群)，并且确保每个分子组份都以相 应的一级设定序列和次级设定序列都被全部回收；重复回收步骤，将所述的 不同组织来源的含有生物标志物的系列组份化分子进行回收操作；为进行下 一步操作，必须将所述的不同组织起源的含有生物标志物的系列组份化分子 (群)以相应的一级设定序列和次级设定序列矩阵化上样于支持材料；设计 和选择于支持材料上的不同组织来源的含有生物标志物的系列组份化分子 (群)相作用的适宜探针分子，以获得不同样品来源的矩阵化排列的生物标 志物的的理想4全测表达模式；同时可以对所述众多不同样品来源的以一级设呈现的特征模式进行相应的分析和比较。
下面，结合本发明的i殳计构思，进一步地详细"i兑明本发明
本发明为生物标志物高通量(HT)分析提供一种解决方法，例如生物 样品中核酸生物标志物或蛋白生物标志物的矩阵化分析。在本发明的优选 具体应用中，对信使RNA(mRNA)生物标志物或者蛋白生物标志物进行表达 和分析，用以说明本发明的内涵。
矩阵化HT Northern blot和矩阵化HT Western blot，作为本发明的两种 具体应用，对信使RNA(mRNA)生物标志物和蛋白生物标志物进行高通量 (HT)分析。然而，在本发明的具体应用中，含有生物标志物的组份化分 子(群)的转移过程同当前传统的Northern blot或Western blot方法有才艮本 不同。
本发明的概念由图1所示，此流程图显示HT Northern/Western blot分析 中的主要步骤
1、组4分化分离
多种组织来源的含有生物标志物的蛋白或mRNA以凝胶电泳的方式组 份化分离，以图中描述的方式将含有生物标志物的凝胶中所包括的各组份 (群)分离成为适宜形态的许多个组份。
例如，在图l所示的具体应用中，从血液组织而来的含有生物标志物的 蛋白或mRNA不同组份被组份化分离为20个组份。由在凝胶中所表现的初 始距离和顺序(参数)来对应生成凝胶中各组份的序号。因而，以一级设定 序列标记相应每一组^分，则每一标记序号(一级i殳定序列)所对应的组份都 可以用序号来追溯其起源，因而凝胶中的各组份群以初始泳动迁移距离和前 后条带序列顺序生成其记录序号并可以实现寻址回溯的功能。
在对每一组份标记设定一级设定序列的同时，在凝胶中每一组份也生成 次级设定序列(可以是数字、符号、缩写或者字母)，用于特指此組份(或 者组份化分子)的组织或者细胞起源。如果出现了较多标本数量或者较多相 异组织标本起源，例如，样品可以分别来自不同组织捐献者的血液样品，次 级设定序列在本发明的高通量分析中必不可少。
本发明用来描述的具体应用可以包括，但并不限于将上述的组份化过 程重复地应用于不同样本，以产生进一步分析处理所需的不同的含有生物标 志物的组份化分子(群)组。在本发明的具体应用中，以图l所示，对含有 生物标志物的血液蛋白质样品，来源于31个不同的组织捐献者以相同方式进4亍31次处理。
为了对所述的众多不同组织的大量组织标本进行准确和高通量的处理P 归的都至关重要。
基于图1膜上所示的组份(群)或组份化分子(群)的空间安排和布置，
相应地，所有的组份或者组份化分子可以由公式Fxyi得到标示和追溯，这里 F就是所指定的组份，x指代次级设定序列，相关于组份的来源，yi指一级 设定序列，相对于初始在凝胶中的泳动距离、顺序或组《分时间，y;中的i 可以是l ， 2， 3, ....n;由凝胶中分离的组份数目所决定。
由此，整个高通量的处理过程中每一组份都标记以 一级设定序列和次级 设定序列，这种标记将确保对不同组织的大量样本的处理在整个过程是有条 理和准确的。
2、 组份化样本回收
在凝胶组份中的含有生物标志物的组份化分子(群)可使用胶回收或溶 解回收等方式回收。
3、 矩阵化点样
从某一组织标本如一个血液捐献者而来的一组系列组份化分子(群)以 上述在凝胶中所表现的序列及其组织起源或类型的序列(即一级设定序列和 次级设定序列)矩阵化点样于显微镜载玻片所支持的杂交膜上。
如图1所示，在本发明的优选的具体应用中，多种不同的组织标本的多 组系列组份化分子可以被集成在一张膜上。
同集成于杂交膜的来源于多种不同样品的含有生物标志物的组份化 RNA或蛋白相互作用的探针分子可揭示出在杂交膜上的生物标志物表达模 式。生物标志物的关键参数如分子量和片段大小，在这种检测中可以检测和 预计。
为进一步应用、比较和分析的便利，不同样品而来的含有生物标志物的 组份分子(群)以完全一致的方式重复进行上述的分离、回收、点样过程，. 如图1，这31个从不同组织捐献者而来的组织样品以相同方式进行31次处 理，以进行HT Western blot和进一 步分析。
以上所述，本发明的具体应用中的一个关键环节是含有生物标志物的各 组份的安排、格式和点样，从凝胶条上所回收到的系列组份依照其一级设定 序列和次级设定序列完成在支持材料上的矩阵制备。在此强调，如需制备更多的血液样品，在制备高通量Western blot时， 使用高密度点阵设备时可以在膜上集成更多的样品，然而，为了对本发明的 技术要旨进行明白易懂的解说，此处只用了有限的人血液样品量来阐述本发 明的内涵。人血液捐献样品而来的生物标志物高能量检测可以使用各种探查 方法，如抗体或者大规模质语法。
如上所述，本发明可以直接应用于Northern blot分析Western blot分析 等方法中。尽管不同生物标志物之间，不同组份化方法之间，不同分子的组 份化属性之间存在诸多根本不同，但Northern blot和Western blot分析的共 同点是含有生物标志物的分子(群)可以被组份化为一个i普系或系列组份 (群)。
本发明的核心技术要旨是将含有生物标志物的组份化i普系或系列组份 (群)转化为矩阵格式，以进行高通量分析处理，因而众多的含有生物标志 物的相关分子(群)只要能满足被相应的组份化方法进行组份化处理为一个 i普系或系列组份(群)，就是本发明的适合的应用范围。 与现有技术相比，本发明具有如下的明显优点
本发明将分子组份化技术优势和微阵列、巨阵列大规模分析的高通量优 势相结合。在传统的分子组份化技术基础上，本发明提供更经济和灵敏的对 宝贵样品进行^r测的 一个方法。
本发明最重要的一个特征是可以高通量分析处理来源于大量样品的含 有生物标志物的分子组〗分(群)，例如在一个微阵列或者大规^莫阵列上分析 某一特定生物标志物在上百种不同组织中的剪切选择表达模式及分子量大 小。
进一步地，本发明可以实现含有生物标志物的分子组份(群)相关信息 的数字化采集处理，由矩阵阅读仪器直接记录并转换生成相关生物标志物数 据库，数据分析可以结合微阵列检测技术平台同步进行。
具体地，例如 -使用计算机图像处理及其数据分析所需的组份化分子的
所需数量要少很多；所述的包含生物标志i的组份化分子(群)直接矩阵化 上样于支持材料将比传统的Western blot (免疫印迹)或Northern Blot(RNA印 迹)分析会产生更强的信号和更高的检测灵敏度；所述的计算机图像处理及 其数据分析的方法，可直接包含生物标志物的从组份化分子(群)中采集、 分析和转换成相应的数据库，而Western blot (免疫印迹)或Northern Blot(RNA印迹)分析无法做到。
为使本发明的内涵以及各种特征可以被更好地理解，我们将结合附图来 详细说明本发明的实施例，从而便于本发明优先选用的具体运用作详细描
述。其中
图1为本发明的高通量生物标志物的印记分析方法的流程示意图；图中 示出了 HTS Western/Northern blot分析中的主要步骤，具体地，不同组织来 源的蛋白或mRNA在凝胶电泳中被组份化分离区隔为多个含有生物标志物 的组份群(在本应用例中数目是20)，进而使用胶回收或者溶解技术回收含 有生物标志物的各组份化分子(群)； 一种组织，如肌肉组织而来的组份化 的一组系列分子可以以矩阵方式并按照回收前其在凝胶中所呈现顺序矩阵 化上样于显微镜载玻片所支撑的杂交膜上，同样方式由多种不同组织，例如 供体l、供体2、供体3等可以矩阵化方式上样排列在一张杂交膜上。
图2显示使用凝胶电泳法将包含生物标志物的蛋白和包含有生物标志物 的mRNA进4亍组化分离，同时^使用蛋白分子量标准和RNA分子量标准和测 量尺作为分子量大小的指示；具体地，在聚丙烯酰胺凝胶上的含有生物标志 物的蛋白电泳和在琼脂糖凝胶上的含在生物标志物的mRNA电泳，其中8mg 人血液蛋白在10%聚丙烯酰胺凝胶进行分离组份化，mRNA在1%曱醛琼脂 糖上进行分离组伤M匕；mRNA的分布在凝胶中部最多，RNA分子量标准和 测量尺用来测量RNA组份(群)的分子量。
图3为甲醛1%琼脂糖凝胶电泳的分子迁移泳动距离与mRNA分子量的 相互关系曲线；该图显示mRNA电泳中的mRNA迁移泳动距离(厘米计) 与分子量大小(核酸数目)存在一个指数关系，此两种系数曲线配合系数为 R2=0.9917;
图4为从系列凝胶薄片回收得到的组份化mRNA的回收量曲线；该图 显示20个组份分别经紫外分光光度计所测定的回收量，组份8到20与组份 1到7相比含有更多的mRNA，这与图2中所示的mRNA在不同区段的分布 相一致。
图5为人胎盘组织的组份化mRNA各组份的琼脂糖凝胶电泳图；该图 显示人胎盘mRNA各组份的相对含量和组份分子量的大小，其中组份8到 20含有比其它组《分更多的mRNA数量，这与图2所示的mRNA在凝胶中的不同区段的分布相一致。
图6为32个组织的Northern blot高通量分析图；该图显示利用高通量 Northern blot分析从31个不同组织中所制备的mRNA样品所显示的相对基 因表达比较，杂交膜的大小与显微镜载玻片相同，杂交信号强弱不同指示 GAPDH基因在这些组织的表达水平的高低；
其中，图6.A,是高通量Northern blot的实际尺寸大小(lx2英寸)，而 图6.B.为棵眼观察而准备的9倍放大点样的组织从左到右分别是l.胎盘；2.阴性对照；3.膀胱；4大脑； 5脑额叶；6.脑海马；7.脑4先叶；8.脑顶叶；9.脑颞叶；IO.乳腺；ll.小脑； 12.结肠；13.食道；14.心脏；15.肾脏；16.肝脏；17.肺；18.肌肉；19.卵 巢；20』夷力泉；21.胎盘；22.直肠；23.皮肤；24.小肠十二指肠；25.小肠回 肠；26.小肠空肠；27.脾脏；28.胃；29.睾丸；30.扁桃腺；31.子宫宫颈； 32.子宫宫体。
图7显示从血液样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳组份化方法获得含有生物标 志物的组份化蛋白分子的方法，在聚丙烯酰胺凝胶小分子量蛋白质分子及多 肽分子被良好地分离，并被浓缩，来源于血液的蛋白质生物标志物是多肽及 小分子蛋白质。
图8为32个组织的Western blot高通量分^f图；该图显示30种不同人 类组织的高通量Western blot的GAPDH蛋白的表达模式；人类30种不同组 织所得到的总蛋白被组份化分离后进行回收操作，以相应的一级设定序列和 次级设定序列将回收到的组份化蛋白上样于相应杂交膜上，高通量Western blot分析中的GAPDH信号以其相应分子大小出现在预定的组份；
其中，图8.A是采用化学发光底物进行的高通量Western blot筛选，图 8.B是采用荧光染料方法的高通量Western blot筛选；
图8中，所述组织从左到右依此为l.分子量标准；2.胎盘；3.阴性对 照；4.脂肪；5.膀胱；6大脑；7.乳腺；8.小脑；9.子宫颈；10.结肠；11. 横隔膜；12.十二指肠；13.食道；14.胆嚢；15.心脏；16.回肠；17.空肠； 18.肾脏；19.肝脏；20.肺;21.卵巢；22.胰腺;23.直肠;24.骨骼肌；25, 皮肤；26.脾脏；27.胃；28.睾丸；29.胸腺；30.曱状腺；31.扁桃腺；32. 子宫。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。必需指出，这些实施例仅限 于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条 件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例中所涉及的设备、材料举例如下1)微点阵相关设备A32针 载玻片点样机(VP478A)及其附件， 一个索引单元(VP470)和手持式微芯片 点样系统(VP472A)，美国V&P Scientific (SanDiego,CA)购买；2)全凝胶 洗胶仪(165-1251):美国伯乐公司(Hercules, CA); 3) RNaid:从Qbiogene (Carlsbad，CA)购买，用于/人凝月交上回收mRNA; 4)杂交膜Hybond N+(正 电荷尼龙膜)Amersham Biotech; 5)PCR试剂盒、DNA聚合酶和PCR緩沖 液Promega公司(Madison, WI); 6)杂交液配方来源于Church and Gilbert (Church, 1984)，包含以下1% BSA, 0.5M磷酸钠缓冲液pH 8.0，和7%十 二烷基硫酸钠(SDS); 7)检测试剂盒CDP-starAP底物和抗荧光素AP耦 合抗体(Cat. No. 1064285)从Amersham Biotech购买；8) 0.24-9.5 Kb RNA ladder (Cat No. 15620-016)从Life Technologies购买；9)荧光素-12-dUTP (Cat. No. 1373242) A人Roche Molecular Biochemicals购买。
实施例1
本实施例提供一种高通量核酸印记法(HT Northern blotting),其制备与 分析过程包含以下步骤
1) mRNA的分离与纯化；
2) 有RNA分子量标准的mRNA琼脂糖凝胶电泳；
3 )基于RNA分子量标准电泳迁移的mRNA分子量计算；
4 )带有mRNA的琼脂糖凝胶被切分为凝胶组份胶条；
5)依据每个凝胶切片在琼脂糖凝胶中的距离与顺序等标记组份的一级 设定序列，依据mRNA来源组织标记组份的次级设定序列； 6 )从相应的凝胶条中抽提回收组份化的mRNA;
7) 依据相应的凝胶条组份生成的一级设定序列和相关组织来源生成的 次级设定序列在相应支持组织上点样组份化mRNA;和
8) 依照相应的组份凝胶条的一级设定序列及其组织来源而定的次级设 定序列进行HT Northern blotting的数据分析。
具体地，由以下提供的本应用实施例l及其相应数据将进一步说明上述操作步骤
步骤l)、首先，将来自31种不同人体组织的mRNA分离并应用于带有 RNA分子量标准的琼脂糖凝胶电泳。
步骤2)、图2显示一个蛋白样本或mRNA样本同蛋白分子量标准或 RNA分子量标准一起上样于聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶，设置一个标尺作为 蛋白或RNA分子量标准与蛋白或mRNA样品迁移的定量依据。
步骤3)、图3所示mRNA分子量与mRNA迁移距离的可以量化并建立 相应数学模型。
步骤4 )和5 )、含mRNA的琼脂糖凝胶被组份化为20个组份，从第一 个凝胶条带到最后一个凝胶条带依照其距离关系标记为一级设定序列。
步骤6)、每一胶条带进行回收操作得到相应mRNA组份样品，从凝胶 中mRNA胶回收^f到的组^分化mRNA样品的平均回收率为43%。图4和图 5显示每个组份mRNA具有与预计相符的分子量和^:量。
步骤7 )、 mRNA组份的样本制备完成后可以进行上样操作
在本发明优选的具体应用中，此应用例中同时使用了 VP Scientific的设 备来制备低密度的点阵，每一针吸取5到lOnl溶液点样于支持材料，如图 1所示，按照其在分离组份化的凝胶条的过程中所生成和记录的一级设定序 列和次级设定序列，从第一个组织捐献者而来的含有生物标志物样品的全部 20个蛋白组份上样于第一列。依照此法，从第二个组织捐献者而来的含有生 物标志物20个组也依照其一级设定序列和次级设定序列被点样。其余的29 个不同人类组织捐献者而来的组织样品按照以上方式重复处理并点样。从31 个不同人类组织捐献者的样品和一个阴性对照而来的含有生物标志物的各 蛋白质组份，以一级设定序列和次级设定序列设计和排列在支持材料上。如 图1所示，每个组织来源的含有生物标志物的蛋白组份群都包含20个组份， 这些組份按照其顺序在相应的膜上点样为20个点，排成一列。重复相同的 以上步骤32次使31种不同样品来源的含有生物标志物的蛋白组份和一个阴 性对照排列成32列。含有生物标志物的蛋白质组份来源于31个不同的人体 組织捐献者以及一个阴性对照^皮依次标记为次级设定序列，在膜上完成各组 份的点样和固化后即制备完成。
步骤8)、在本发明的具体应用中， 一个GAPDH探针应用于制备完成 的HT Nothern Blot，如图6所示，次级设定序列所示的31种不同人体组织 中的第13个组份呈现出各种强弱不同的信号，依照组份凝胶条所记录的一级设定序列及其所代表的不同凝胶条的样品迁移距离，mRNA组份13的分 子量约为1.5 x 1000个核香酸，这与GAPDH的mRNA大小相符，依照mRNA 分子量可以完成相关分子的分离组份化，而在此过程中相关分子的分子量属 性则可以被探测和确认。在本发明的具体应用中，依照一级设定序列和次级 设定序列在一致的实验背景下所制备的高通量Northern Blot可以高通量地 同时分析多种基因的大小及其表达模式。HT Northern Blot分析的图像数据 可以直接从微点阵扫描器中读取并转换成数字信号存入相应数据库。
见图6B所示，计算机处理图像所示的各个组织的微阵列可以被放大， 以便像传统Northern Blot —样进行肉眼观察。
实施例2
本实施例提供一种高通量蛋白印记法(HT Western Blot)。制备高通量 Western Blot的原则与高通量Northern Blot原则是一样的，虽然组4分化分离 蛋白分子的方法不同。本实施例提供一种高通量核酸印记法(HT Northern blotting),其制备与分析过程包含以下步骤
1) 蛋白的提取和组份化分离；
2) 有蛋白分子量标准的蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳；
3) 基于蛋白分子量标准电泳迁移的蛋白分子量计算；
4) 带有蛋白的聚丙烯酰胺凝胶被切分为凝胶组份胶条；
5) 依据每个凝胶切片在聚丙烯酰胺凝胶中的距离与顺序等标记组份的 一级设定序列，依据蛋白来源组织标记组份的次级设定序列；
6) 从相应的凝胶条中抽提回收组份化的蛋白；
7) 依据相应的凝胶条组份生成的一级设定序列和相关组织来源生成的 次级设定序列在相应支持组织上点样组份化蛋白；和
8) 依照相应的组份凝胶条的一级设定序列及其组织来源而定的次级设 定序列进行HT Western Blot的lt据分析。 <
具体地，由以下提供的本应用实施例2及其相应数据将进一步说明上述 操作步骤
步骤1 )、从水冻的人体组织中使用包含清洁剂和蛋白酶抑制剂混合物的 匀浆緩冲器来提取总蛋白。
步骤2)、如图1所示1.25mg组织总蛋白上样于20 %的Tris-glycine SDS-PAGE凝胶中(Bio-Rad Laboratories)进行蛋白组份化分离。步骤3)、凝胶中的蛋白组份可以通过不同方法进行回收，比如像在HT Northern Blot那样从凝胶条中萃取,或者通过专用仪器从凝胶中电转移出来。 在本发明的一个优选的具体应用中，使用全凝胶洗脱仪(Bio-Rad Laboratories) 来洗脱凝胶中的组份化蛋白。洗脱缓冲液中包含25mMTris-HCl、 192mM甘 氨酸、0.1%SDS。洗脱的蛋白组份通过真空吸引来收集，此步J^中，30种不 同的人体组织的组份使用 一级设定序列和次级设定序列来标记。蛋白组份液 体使用Amicon (Millipore)试管浓缩达到相同体积。为写全证分离的蛋白组份， 回收的蛋白组份在同样条件的凝胶中进行相同条件的电泳，
步骤4 )、使用同样的微点阵设备按照一级设定序列将蛋白组份连续地点 样于杂交膜。根据设计并记录的一级设定序列和次级设定序列，不同人体组 织来源的蛋白组伤"故回收和矩阵化点样于膜上。
步骤5)、在HT Western Blot分析的应用例中，管家基因甘油醛-3-磷 酸盐脱氢酶(GAPDH)被作为目标蛋白检测。使用含5 %脱脂牛奶的TBST( 0.1 %Tween20inTBS)封闭液封闭杂交膜抗原结合表位，小鼠抗GAPDH单克 隆抗体(MAB374， Chemicon International)被加入TBST溶液中4摄氏度过 夜孵育。在三轮TBST清洗后，加入二抗HRP (辣根过氧化物酶)偶连的抗 鼠IgG (NA931, Amersham Biotech )或CY3偶连的抗鼠IgG,图8A是使 用ECL-Plus试剂(Amersham Biotech)的显色结果，图8B是使用微点阵 阅读仪所显示的结果。
图8显示32道HT Western Blot —个应用实例，使用从30种不同组织 中所回收到的蛋白组份。这些组织从左到右分别是1,分子量标准。2,胎 盘。3，阴性对照。4,脂肪。5,膀胱。6，脑。7,胸部。8,小脑。9，子 宫颈。10,结肠。11，横隔膜。12,十二指肠。13，食道。14，胆。15,心 脏。16,回肠。17,空肠。18,肾。19，肝脏。20,肺。21,卵巢。22，胰 腺。23,直肠。24,骨骼肌。25，表皮。26,脾。27,胃。28,睾丸。29, 胸腺。30,曱状腺。31,扁桃腺。32，子宫。
同预期的GAPDH蛋白38 kDa的分子量相一致，依照一级设定序列， 在24个组份中的第16组份中GAPDH蛋白被检测出来。依照分子量完成相 关分子的分离组份化，而在此过程中相关分子的分子量属性则可以被探测和 确认。如图所示，依据次级设定序列，不同强度的一系列信号变化显示了 30 种不同人体组织中表达的GAPDH蛋白的不同高低水平。综合上述两个实施例可以看出，由于采用微点阵矩阵模式，显而易见本 发明的具体应用具有高通量的处理能力。
图6和图8分别显示了本发明的高通量Northern Blot和高通量Western Blot的两个具体实施例。传统的方法通常10个样品集成在一张2x4英寸的 杂交膜上，与传统方法相比较，本发明具体实施例中的32个样品的组份化 分子点样于一张lx2英寸的杂交膜。
但是，此处应该特别强调的是，依照本发明的技术要旨，样品的实际应 用数量不受以上实施例的限制。例如， 一个高密度的微点阵可以在每张膜上 集成超过500，000点。因此，本发明的具体应用中，参照样品可^t处理的组 份数量，本发明的具体应用在更高密度的微点阵中可以提供更高通量的分析 处理能力，例如，每一样本被组份化为50个组份，来自10,000样本的分子 组份可以被集成在一张杂交膜上。
因此，本发明的具体应用HT Northern Blot和HT Western Blot可以提供 更高通量的处理、分析能力，比如，10,000个组织样品而来的分子组份可 以集成于一张膜上.进一步而言，在本发明的具体应用中，高通量分析产生 的大量数据可直接通过微点阵扫描仪阅读并转换生成相应数据库，这些特点 对于传统Northern Blot或Western Blot分析而言，是本发明的一个创新点。
通过以上对于本发明的具体应用及具体实施例的描述，本发明的技术要 旨可以概括为，4吏用纟敖阵列或超级阵列等方式对相关生物标志物进行高通量 的分析处理。本发明将分子分离组份技术的优势和微阵列和超级阵列的优势 相结合，所产生新的优势超越了传统分子组份技术的局限。另一方面，在传 统分子组份化技术的基础上，本发明还创造出一种更敏感和更节省宝贵原材 料的方法。进一步而言，在本发明的具体应用中，组份分子群可以通过多种 方法探测，包括但不限于核酸杂交，抗体结合，质谱测定等。本发明的一 个最重要的优势是可以对百计或千计以上的样本进行高通量处理和分析，如
择剪切模式。而且，关于包含生物标志物的分子组份的信息可以数字化直接 从微阵列扫描仪阅读并转换存入数据库，并使数据处理在一个微阵列技术平 台上高通量进行。目前，没有已知的其他技术方法可以达到这种技术要求。 因此本发明对于分子组份分析，特别是针对Northern /Western blot分析技术 是一种创新性变革。
本发明以上述优选具体实施方式
详细地描述了本发明的技术要旨。但是，对于所属技术领域的一般技术人员而言，本发明上述优选的具体实时方 式可以被进一步改编或^务改以用于新的应用目的，并不与本发明的基本精神
实施方式。进一步地，本发明的应用范围还包括了各种基于相同操作原则的 对于本发明的修改及相似的安排。因而，对于本发明的权利要求书所要求的 保护范围应给予最广泛的解释，以涵盖所有这些对本发明的修改或相类似的 应用范围。
权利要求
1.一种对于包含生物标志物的样本进行高通量分析的方法，所述方法包括如下步骤(1)、将包含生物标志物的原始样本以能够分离所述生物标志物的方法进行组份化，并依照其进行组份化方法所产生的参数所设定的一级设定序列和根据所述样本来源所设定的次级设定顺序，使得到的包含生物标志物的组份化样本在组份化介质上进行排列或表达，优选地，所述样本来源为组织来源；(2)、从所述组份化介质上回收所述组份化样本，使回收得到的每一个组份化的样本，都确保依照步骤(1)中所设定的一级设定序列和次级设定序列进行分序和排列；(3)、按照步骤(1)中所设定的一级设定序列和次级设定序列，将所回收到的包含生物标志物的组份化样本在支持材料上进行矩阵排列即矩阵化上样，所述支持材料优选选自硝酸纤维素、尼龙、塑料、玻璃、多孔板和珠；(4)、对所述矩阵化上样的样本进行高通量分析，从而对所述生物标志物进行检测、分析和/或预测；优选地，所述高通量分析为对所述矩阵化上样的核酸样本进行Northern blot分析或对所述矩阵化上样的蛋白样本进行Western blot分析。
2. 权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法为检测来源于众多 不同或相同组织的生物标志物的表达模式的高通量检测方法，所述方法包括 对每个不同或相同组织来源的样本重复步骤(1)和(2), ^使所有不同或相同组 织来源的包含生物标志物的样本都完成组份化过程和回收过程。
3. 权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述生物标志物的类型 包括核酸如核4唐核酸(RNA )、脱氧核糖核酸(DNA)和/或cDNA,蛋白， 多肽，脂质和/或多糖。
4. 权利要求l-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(l)的组 份化处理，是以生物标志物分子的自身属性优选为生物医学属性来分离为以 所述一级^L定序列排列的样本，优选地，所述属性选自分子量、电荷、有 机相溶解性、亲合性、质量、形状、密度和颜色；优选地，所述分离方法选 自以下的一种或几种琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、 二维 PAGE、等电聚焦、离子交换色谱、过滤色谱、疏水色谱、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、气相色谱、原子吸收、亲合色镨和梯度离心。
5. 权利要求l-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(l)中所设定 的一级设定序列所依据的参数包括距离、时间和/或顺序，所述距离、时间和时间和/或顺序，或是所述包含生物标志物的组份化样本在该组份化i某介之外 的迁移迁移距离、时间和/或顺序。
6. 权利要求l-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(l)中所设定 的一级设定序列是根据样本的切分点如由相伴随的分子量标准所指示的组 份的分子量的大小作为切分点来进行排列的；优选地，所述系列样本的分界 点与伴随的分子量标准呈线性、对数或指数关系；和/或所述一级设定序列为 自然形成序列或由任一方式重新安排的序列。
7. 权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述样本的组织来 源选自以下的一种或几种血液、从胎盘、膀胱、大脑、脑额叶、脑海马、 脑枕叶、脑顶页、脑颞叶、乳房、小脑、结肠、食道、心脏、肾脏、肝脏、 肺脏、肌肉、卵巢、胰腺、直肠、皮肤、小肠、十二指肠、小肠回肠、小肠 空肠、脾脏、胃、睾丸、扁桃腺、子宫宫颈和子宫宫体。
8. 权利要求l-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述回 收方法以自动化方式进行，或是使用相关试剂盒或商品化仪器来进行。
9. 权利要求l-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤(l)中所述的 以一级设定序列排列的在步骤(3)所述的每个支持材料上进行上样的系列 组份化样本的^:目为2到500,000。
10. 权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中对所定的序列或任意次序来进行。
11. 权利要求l-10任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的所 述矩阵化上样的方法为通过仪器如微阵列点样仪器自动进行或通过手工进 行。
12. 权利要求l-ll任一项所述的方法，其特征在于，对步骤(3)中所 述的支持材料进行电荷或化学修饰操作以增强其分子结合能力，所述操作包 括聚赖氨酸化、曱硅烷基化、硅烷化。
13. 权利要求l-12任一项所述的方法，其特征在于，所述方法的步骤(4) 包括如下操作(4.1)选择并设计可以与步骤(3)所述的矩阵化排列在支持材料上的生物标志物相结合并相互作用的探针分子；优选地，所述探针分子选自核 糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、蛋白质、抗体和经化学》务饰的蛋白； 进一步优选地，所述经化学修饰的蛋白是指经化学标记、萤光标记、放射同 位素标记或质语分析激光标记的蛋白质探针。(4.2) 分析步骤(3)中所述的按照步骤(1)所述的相应的一级序列和次级(4.3) 检测、分析和/或预测步骤(l)中所述生物标志物的属性。
14. 权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法包括将步骤(4.1)行孵育和杂交的步骤，优选地，所述纟笨针分子的孵育或杂交过程可以手动操 作或自动化进行。
15. 权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤(4.2)的分析和/或(4.3)的探针分子；优选地，该分析和/或^r测方法选自化学法、化学发光法、荧光 法、放射法和质谱分析法。
16. 权利要求15所述的方法，其特征在于，所述分析和/或检测所述支 持材料上与生物标志物相互作用的探针分子数量的操作是以手动或自动进 行的，例如使用胶片手工曝光；或是使用仪器进行的，例如使用微点阵扫描 仪来进行。
17. 权利要求1-16任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)包含 对含有生物标志物的组份化样本的表达模式的分析；优选地，所述分析包括 通过数学计算、计算机图像处理和/或数据分析等高通量方式处理并生成相应 的数据库。
18. 权利要求17所述的方法，其特征在于，所述数学计算是用于确定物标志物的组份化样本的迁移距离i^时间。、、 、
19. 权利要求17所述的方法，其特征在于，所述计算机图像处理及其 数据分析是用于确定步骤(l)中所述的以一级设定序列和次级设定序列排列 生物标志物分子的数量。
20. 权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的计算机图像处理及 其数据分析是用于放大处理包含生物标志物的系列组份化样本的微点阵图 像。
21. —种制备用于高通量分析的矩阵化排列样本的样本库的方法，其特 征在于，所述方法包括如下步骤(1) 、将所述包含生物标志物的原始样本以能够分离所述包含生物标志物 的方法进行组份化，并依照其进行组份化方法所产生的参数所设定的 一级设 定序列和根据所述样本来源所设定的次级设定顺序，使得到的包含生物标志 物的组份化样本在组份化介质上进行排列或表达，优选地，所述样本来源为 组织来源；(2) 、从所述组份化介质上回收所述组份化样本，使回收得到的每一个组 份化的样本，都确保依照步骤(l)中所设定的一级设定序列和次级设定序 列进行分序和排列；(3) 、按照步骤(1)中所设定的一级设定序列和次级设定序列，将所回 收到的包含生物标志物的系列组份化样本在支持材料上进行矩阵化排列，所 述支持材^H尤选选自硝酸纤维素、尼龙、塑料、玻璃、多孔板和珠。
22. 权利要求21所述的方法，其特征在于，所述方法中的原始样本为 来源于不同个体的不同或相同组织的生物标志物的样本，所述方法包括对每 一个体的不同或相同组织来源的样本重复步骤(1)和(2),从而使所有不同或
23. 权利要求21或22所述的方法，其特征在于，所述生物标志物的类 型包括核酸如核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)和/或cDNA,蛋 白，多肽，脂质和/或多糖。
24. 权利要求21-23任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(l) 的组份化处理，是根据生物标志物分子的自身属性优选为生物医学属性来分 离为以所述一级"i殳定序列排列的系列样本，优选地，所述属性选自以下的一 种或几种分子量、电荷、有机相溶解性、亲合性、质量、形状、密度和颜 色；和/或优选地，所述分离方法选自以下的一种或几种琼脂糖凝胶电泳、 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、 二维PAGE、等电聚焦、离子交换色谱、过滤 色谱、疏水色谱、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、气相色谱、原 子吸收、亲合色谱和梯度离心。
25. 权利要求21-24任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所 设定的一级设定序列所依据的参数包括距离、时间和/或顺序，所述距离、时 间和/或顺序是所述包含生物标志物的组份化样本在该组份化媒介中的迁移 距离、时间和/或顺序，或是所述包含生物标志物的组份化样本在该组份化々某介之外的迁移距离、时间和/或顺序。
26. 权利要求21-25任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所 设定的一级设定序列是根据样本的切分点如由相伴随的分子量标准所指示 的组份的分子量的大小作为切分点来进行排列的；优选地，所述系列样本的 分界点可与伴随的分子量标准呈线性、对数或指数关系；和/或所述一级设定 序列为自然形成序列或由任一方式重新安排的序列。
27. 权利要求21-26任一项所述的方法，其特征在于，所述样本的组织 来源选自以下的一种或几种血液、从胎盘、膀胱、大脑、脑额叶、脑海马、 脑枕叶、脑顶页、脑颞叶、乳房、小脑、结肠、食道、心脏、肾脏、肝脏、 肺脏、肌肉、卵巢、胰腺、直肠、皮肤、小肠、十二指肠、小肠回肠、小肠 空肠、脾脏、胃、睾丸、扁桃腺、子宫宫颈和子宫宫体。
28. 权利要求21-27任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所 述回收方法以自动化方式进行，或是使用相关试剂盒或商品化仪器来进行。
29. 权利要求21-28任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所 述的一级设定序列排列的在步骤(3)所述的每个支持材料上进行上样的系 列组份化样本的数目为2到500,000。
30. 权利要求21-29任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中对设定的序列或任意次序来进行。
31. 权利要求21-30任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的 所述矩阵化排列的方法为通过仪器如微阵列点样仪器自动进行或通过手工 进行。
32. 权利要求21-31任一项所述的方法，其特征在于，对步骤(3)中 所述的支持材料进行电荷或化学修饰操作以增强其分子结合能力，所述操作 包括聚赖氨酸化、曱硅烷基化、硅烷化。
33. 根据权利要求21-32任一项所述的方法所制备的样本库，所述样本 库包含在支持材料上矩阵化排列的生物标志物的样本。
全文摘要
本发明涉及一种对于包含生物标志物的样本进行高通量分析的方法；本发明还涉及一种制备用于高通量分析的矩阵化排列样本的样本库的方法；本发明同时涉及根据本发明所述的方法所制备的样本库。本发明将分子组份化技术优势和微阵列、巨阵列大规模分析的高通量优势相结合。在传统的分子组份化技术基础上，本发明提供更为经济和灵敏地对宝贵样品进行检测的方法。
文档编号C12Q1/68GK101550441SQ20081010319
公开日2009年10月7日 申请日期2008年4月1日 优先权日2008年4月1日
发明者王建铭, 范盘生, 红 赵, 韩晓亮 申请人:博尔诚(北京)科技有限公司