专利名称：白斑综合征病毒检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测水产养殖中相关病毒的检测试剂盒及检测方法，尤其涉及检测白斑综合征病毒的检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
对虫下白斑综合征病毒(WSSV, white Spot Syndrome Virus)已成为养殖对虫下的主要病原，也是目前发现的基因组最大的动物病毒(基因组约290kD，双链环状)(Yang2001 ；VanHulten 2001a)。该病毒首先在台湾发现，然后迅速蔓延到东南亚其他国家，随后到了北美。它不仅能感染对虾，还能感染其他淡水及海水甲壳类，如螃蟹、螯虾等。养殖对虾被感染后，3 IOd内累积死亡率可达100%，给对虾养殖业造成了巨大的损失(黄健等1995a ；VanHuten 2001a)。WSSV是1993年中国对虾暴发性流行病的主要病毒病原，是国家法定报告的一类动物疫病。目前WSSV的主要检测手段包括:1.电镜检测法；2.TE染色法；3.病理切片法；
4.抗体检测法；5.核酸探针杂交法；以及6.PCR检测法。电镜检测法可以直接观察到病毒的颗粒，但是检测过 程时间长，操作复杂，准确性低；TE染色和病理切片法都是在显微镜下对处理过的组织样本进行观察，灵敏度低，人为主观因素对检测结果有较大影响；抗体检测法直接检测病毒特异蛋白，核酸探针法可以直接检测病毒核酸，但这两种方法灵敏度不够理想，通常无法检测未发生病症的潜在病毒携带虾；PCR检测法是目前使用比较广泛的检测手段，但其需要专业的实验设备和专业的操作人员，无法实现WSSV的相对快速、准确检测，更无法实现病毒的现场快速检测，大大限制了 PCR检测方法在生产中的推广应用。有鉴于此，建立简单、快速、高灵敏的白斑综合征病毒检测方法，开发适于现场应用的白斑综合征病毒检测试剂盒就显得更为重要和紧迫。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明目的是提供一种用于检测白斑综合征病毒的快速检测方法及与其配套的检测试剂盒，以弥补现有技术的不足，使之适用于生产现场快速、准确、高灵敏度的检测白斑综合征病毒。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:白斑综合征病毒检测试剂盒，其包括含有I至2对扩增引物的扩增反应液；扩增引物选自下组:
IFIP:gcaagggctctacatcacatcataaatattcctagacaacacgtcttgSEQ ID NO:3
IBIP:ccgtgcctcaatatatacccctaaatctttctactaagatttccaaccSEQ ID NO:4
2FIP:tgaggggtatatattgaggcacgaaaacacgtcttgtctgtacgSEQ ID NO:7
2BIP:gtagaccttgataatcacggttgcaaattatcctgacttgttccattgSEQ ID NO:8
3FIP:aggggtatatattgaggcacggaaatcttgtctgtacgattagtcgSEQ ID NO:11
3BIP:gtagaccttgataatcacggttgcaaattatcctgacttgttccattgSEQ ID NO:124FIP:tgacttgttccattggttctttctaaaattgataatcacggttgccaSEQ ID NO: 15
4BIP:atacagtataagcttttggggaacaaaatcttgtacttctaatgttagcgSEQ ID NO: 16
5FIP:tgaatgttgttccccaaaagcttataaaggaaatcttagtagaaagaaccaa SEQ ID NO:195BIP:ttgtcatagcgctaacattagaagtaaattgaacaaaatgagctggatSEQ ID NO:20
优选扩增反应液还含有选自下组的增效引物作:
1F3:gttattaggattcagtagttctgtSEQ ID NO:1
1B3:cctgacttgttccattggtSEQ ID NO:2
2F3:tcagtagttctgttattcctagaSEQ ID NO:5
2B3:tccccaaaagcttatactgtaSEQ ID NO:6
3F3:ctgttattcctagacaacacgSEQ ID NO:9
3B3:tccccaaaagcttatactgtaSEQ ID NO:10
4F3:aatatatacccctcagtagaccSEQ ID NO:13
4B3:ggatgcagaatcacctgtSEQ ID NO:14
5F3:tgccaaacaacaacggttSEQ ID NO:17
5B3:cccctgcaaatgaagtggSEQ ID NO:18
扩增反应液还含有选自下组的检测探针:
IBD:BIOTIN-ctcgactaatcgtacagaSEQ ID NO:21
IFD:FITC-ccttgataatcacggttgccSEQ ID NO:22
2&3BD:BIOTIN-ggcaagggctctacatcacaSEQ ID NO:23
2&3FD:FITC-caaacaacaacggttggaaaSEQ ID NO:24
4BD:BIOTIN-gatttccaaccgttgttgttSEQ ID NO:25
4FD:FITC-acattcatttattgtcatagSEQ ID NO:26
5BD:BIOTIN-actgtatattattatcctgaSEQ ID NO:27
5FD:FITC-acaagaacaggtgattctgcSEQ ID NO:28
更优选还含有阳性对照品；阳性对照品的核苷酸序列为:acagttggct gctgctgctg
ctgttccttg attgactcca tttttagaat attgggttat taggattcagtagttctgtt attcctagac
aacacgtctt gtctgtacga ttagtcgaga tgatgtgatg tagagcccttgcccgtgcct caatatatac
ccctcagtag accttgataa tcacggttgc caaacaacaa cggttggaaatcttagtaga aagaaccaat
ggaacaagtc aggataataa tatacagtat aagcttttgg ggaacaacattcatttattg tcatagcgct
aacattagaa gtacaagaac aggtgattct gcatccagct cattttgttcaacccacttc atttgcaggg
gacaacactc ttctttcttg aaaaatatgg atgaagacac ttggaattcttcaataggcc ctggggcgtt
gctggaggag gacgcagaag aagaagaaga acagctgccg ttgaacgagtttatagtttc cagaagacaa
cataatttag ctgtaattgg acgaggagac ttcttgtaat gagagaaccacaaaattctt cttcccgtct
tttctggtat aaaagtagtc ccataatatg ttcctttctg gactaccacattatcttcgt ttaagggaac
atatctgacc gactttctca tcaagggctg atctccattt cttgttgtgcttagagccga tttgtattcc
ccgtcgttea cgttatagtt gcatatagaa cagtgggatg aaaggaacttgtcggttacg tgttcagttt
gtacaagata actggacgca tttgctagtt ctggagggac gtcctggtttttgtttattg ttgaagtagg
ttttatcttt ttcctattta agcacacacc ctttgaatta atgtgtatgcgattcgcatt gatgtatatg cagattgtga gtgctggaga aaatggtatc tcaaaatcgg tagctggttcaataatttct ggttcaacttcctgttgttc ttcttcctca SEQ ID NO:29。
其中，还可含有阴性对照品；阴性对照品为超纯水或鲑鱼精DNA。本发明还相应的提供了白斑综合征病毒检测方法，其包括下列步骤:
核酸抽提步骤:抽提样品的DNA ；
扩增杂交步骤:目标DNA加入含有I对扩增引物、带有FITC标记和带有BIOTIN标记的探针各I条、可能含有I对增效引物的LAMP反应液中，进行恒温扩增，同时扩增得到的产物将与探针结合，形成可供检测的杂交分子；如无目标DNA，则无法进行扩增，也就无法形成可供检测的杂交分子；
检测步骤:将得到的杂交产物滴加在核酸免疫层析试纸条上检测杂交结果；
引物选自下组:
1F3:gttattaggattcagtagttctgtSEQ ID NO:1
1B3:cctgacttgttcca ttggtSEQ ID NO:2
IFIP:gcaagggctctacatcacatcataaatattcctagacaacacgtcttg SEQ ID NO:3
IBIP:ccgtgcctcaatatatacccctaaatctttctactaagatttccaacc SEQ ID NO:4
2F3:tcagtagttctgttattcctagaSEQ ID NO: 5
2B3:tccccaaaagcttatactgtaSEQ ID NO:6
2FIP:tgaggggtatatattgaggcacgaaaacacgtcttgtctgtacg SEQ ID NO:7
2BIP:gtagaccttgataatcacggttgcaaattatcctgacttgttccattg SEQ ID NO:8
3F3:ctgttattcctagacaacacgSEQ ID NO:9
3B3:tccccaaaagcttatactgtaSEQ ID NO: 10
3FIP:aggggtatatattgaggcacggaaatcttgtctgtacgattagtcg SEQ ID NO:113BIP:gtagaccttgataatcacggttgcaaattatcctgacttgttccattg SEQ ID NO:124F3:aatatatacccctcagtagacc SEQ ID NO:134B3:ggatgcagaatcacctgtSEQ ID NO: 14
4FIP:tgacttgttccattggttctttctaaaattgataatcacggttgccaSEQ ID NO:15
4BIP:atacagtataagcttttggggaacaaaatcttgtacttctaatgttagcg SEQ ID NO:165F3:tgccaaacaacaacggtt SEQ ID NO: 175B3:cccctgcaaatgaagtgg SEQ ID NO: 18
5FIP:tgaatgttgttccccaaaagcttataaaggaaatcttagtagaaagaaccaa SEQ ID NO:195BIP:ttgtcatagcgctaacattagaagtaaattgaacaaaatgagctggat SEQ ID NO:20检测探针选自下组:
IBD:BIOTIN-ctcgactaatcgtacagaSEQ ID NO:21
IFD:FITC-ccttgataatcacggttgccSEQ ID NO:22
2&3BD:BIOTIN-ggcaagggctctacatcacaSEQ ID NO:23
2&3FD:FITC-caaacaacaacggttggaaaSEQ ID NO:24
4BD:BIOTIN-gatttccaaccgttgttgttSEQ ID NO:25
4FD:FITC-acattcatttattgtcatagSEQ ID NO:26
5BD:BIOTIN-actgtatattattatcctgaSEQ ID NO:275FD:FI TC_acaagaacaggtga11ctgcSEQ ID NO:28
其中，作为优化方案，检测步骤优选如下，
Ca)取样品0.02、.2g置于采样管中，用研磨棒磨碎样品或用其他方法使样品变至浆
状；
(b)取上述体积为N的浆状的样品中加入f2N体积的裂解液和0.0lN体积的蛋白酶K溶液，60°C水浴5 30分钟；
(c)将上述样品液转移至样品富集柱中，600(Tl2000RPM离心I飞分钟，弃滤液；
Cd)加入0.2^2毫升样品清洗液至样品富集柱中，600(Tl2000RPM离心I飞分钟，弃滤
液；
(e)加入0.05^1毫升核酸洗脱液至样品富集柱中，静置I飞分钟，600(Tl2000RPM离心Γ5分钟，收集滤液；` Cf)取3飞微升滤液加入到含有LAMP恒温扩增反应液的0.2毫升离心管内，将离心管置于55 65°C条件下保温4(T70min ；
(g)取3飞微升反应产物加到检测用的核酸免疫层析检测试纸条的样品垫上，滴加2 4滴缓冲液，室温静置I飞分钟后观察结果。(h)在试纸条上出现两条红色的带为阳性，说明样品中含有白斑综合征病毒核酸；在试纸条上只出现一条红色的条带为阴性，说明样品中不含有白斑综合征病毒核酸；在试纸条上无任何明显条带，说明反应无效，请重做反应。进一步的，可以采用增加上述阳性对照品和阴性品对照增加检测的准确性。本发明的试剂盒可以整合包括白斑综合征病毒快速检测所需的核酸快速提取、恒温扩增反应液、核酸检测试纸条等试剂和器材，使白斑综合征病毒检测能够快速有序进行，实现了检测过程的程序化和标准化。依据白斑综合征病毒保守区序列所设计的扩增引物能有效检测白斑综合征病毒的所有毒株，而与其他病毒的又无同源性，多对引物的相互作用使检测特异性高。反应结束以后可以通过使用核酸检测试纸条进行快速检测，检测结果直观明了，有利于结果的判读，有利于保证检测结果的可靠性。本发明在恒温扩增反应液中将目的核酸的扩增与探针杂交结合起来同步进行，节省了时间，仅需1.5^2小时就可完成白斑综合征病毒的检测；并且检测过程无需昂贵的仪器设备如PCR仪和凝胶成像系统，仅需水浴锅或金属浴甚至更简单的保温装置即可；而且检测结果非常容易判别。与白斑综合征病毒已有检测技术相比，本发明的检测灵敏度极高，可以代替白斑综合征病毒之前的相关检测方法如病理切片法、电镜观察法、抗体检测法和PCR检测法等；本发明的检测试剂盒不仅可在实验室内使用，也可在条件有限的野外的生产现场使用，对加强白斑综合征病毒的流行病学监测和疾病防控意义重大，具有很高的推广应用价值。
具体实施例方式以下结合附实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1:
白斑综合征病毒检测试剂盒，其包括含有引物的扩增反应液；引物优选如下:
I F 3:gttattaggattcagtagttctgtSEQ ID NO:1I B 3:cctgac11g11cca11ggtSEQ ID NO:2
IFIP:gcaagggctctacatcacatcataaatattcctagacaacacgtcttg SEQ ID NO:3 IBIP:ccgtgcctcaatatatacccctaaatctttctactaagatttccaacc SEQ ID NO:4 扩增反应液还含有选自下组的检测探针:
IBD:BIOTIN-ctcgactaatcgtacagaSEQ ID N O: 2 1 IFD:FITC-ccttgataatcacggttgccSEQ ID N O: 2 2
还含有阳性对照品；阳性对照品的核苷酸序列为:acagttggct gctgctgctgctgttccttg attgactcca tttttagaat attgggttat taggattcag tagttctgtt attcctagacaacacgtctt gtctgtacga ttagtcgaga tgatgtgatg tagagccctt gcccgtgcct caatatatacccctcagtag accttgataa tcacggttgc caaacaacaa cggttggaaa tcttagtaga aagaaccaatggaacaagtc aggataataa tatacagtat aagcttttgg ggaacaacat tcatttattg tcatagcgctaacattagaa gtacaagaac aggtgattct gcatccagct cattttgttc aacccacttc atttgcaggggacaacactc ttctttcttg aaaaatatgg atgaagacac ttggaattct tcaataggcc ctggggcgttgctggaggag gacgcagaag aagaagaaga acagctgccg ttgaacgagt ttatagtttc cagaagacaacataatttag ctgtaattgg acgaggagac ttcttgtaat gagagaacca caaaattctt cttcccgtcttttctggtat aaaagtagtc ccataatatg ttcctttctg gactaccaca ttatcttcgt ttaagggaacatatctgacc gactttctca tcaagggctg atctccattt cttgttgtgc ttagagccga tttgtattccccgtcgttea cgttatagtt gcatatagaa cagtgggatg aaaggaactt gtcggttacg tgttcagtttgtacaagata actggacgca tttgctagtt ctggagggac gtcctggttt ttgtttattg ttgaagtaggttttatcttt ttcctattta agcacacacc ctttgaatta atgtgtatgc gattcgcatt gatgtatatgcagattgtga gtgctggaga aaatggtatc tcaaaatcgg tagctggttc aataatttct ggttcaacttcctgttgttc ttcttcctca SEQ ID NO:29。为了进一步方便观察检测结果，还含有阴性对照品；阴性对照品为超纯水或鲑鱼精DNA。本实施例优选超纯水。本发明还相应的提供了白斑综合征病毒检测方法，其包括下列步骤:
核酸抽提步骤:抽提样品的DNA ；
扩增杂交步骤:目标DNA加入含有权利要求1和权利要求3中的引物各I对、权利要求2中的带有FITC标记和带有BIOTIN标记的探针各一条的LAMP反应液中，引物进行恒温扩增，同时扩增得到的产物将与探针结合，形成可供检测的杂交分子；如无目标DNA，则无法进行扩增，也就无法形成可供检测的杂交分子；
检测步骤:将得到的杂交产物滴加在核酸免疫层析试纸条上检测杂交结果；
引物选自下组:
IF 3:gttattaggattcagtagttctgtSEQ ID NO:1
IB 3:cctgacttgttccattggtSEQ ID NO:2
IFIP:gcaagggctctacatcacatcataaatattcctagacaacacgtcttg SEQ ID NO:3 IBIP:ccgtgcctcaatatatacccctaaatctttctactaagatttccaacc SEQ ID NO:4 检测探针选自下组:
IBD: BIOTIN-ctcgactaatcgtacaga SEQ ID N 0: 2 I IFD: FITC-ccttgataatcacggttgccSEQ ID N 0: 2 2其中，作为优化方案，检测步骤优选如下，
Ca)取样品0.02、.2g置于采样管中，用研磨棒磨碎样品或用其他方法使样品变至浆
状；
(b)取上述体积为N的浆状的样品中加入f2N体积的裂解液和0.0lN体积的蛋白酶K溶液，60°C水浴5 30分钟；
(c)将上述样品液转移至样品富集柱中，600(Tl2000RPM离心I飞分钟，弃滤液；
Cd)加入0.2^2毫升样品清洗液至样品富集柱中，600(Tl2000RPM离心I飞分钟，弃滤
液；
(e)加入0.05^1毫升核酸洗脱液至样品富集柱中，静置I飞分钟，600(Tl2000RPM离心Γ5分钟，收集滤液；
Cf)取3飞微升滤液加入到含有LAMP恒温扩增反应液的0.2毫升离心管内，将离心管置于55 65°C条件下保温4(T70min ；
(g)取3飞微升反应产物加到检测用的核酸免疫层析检测试纸条的样品垫上，滴加2 4滴缓冲液，室温静置I飞分钟后观察结果。(h)在试纸条上出现两条红色的带为阳性，说明样品中含有白斑综合征病毒病毒核酸；在试纸条上只出现一条红色的条带为阴性，说明样品中不含有白斑综合征病毒病毒核酸；在试纸条上无任何明显条带，说明反应无效，请重做反应。进一步的，可以采用增加上述阳性对照品和阴性品对照增加检测的准确性。
实施例2: 一种用于检测白斑综合征病毒的试剂盒，包括:
样品裂解液；(溶液配置方法为:6(T240g GuSCN溶于5(T200mL 0.lmol/L Tris-HCl(ρΗ6.4)中，加入 10 40mL 0.2mol/L EDTA, ρΗ8.0 和 2 6mL TritonX-1OO 混匀即可)
蛋白酶K ；(配制含50mmol/L TRIS-CL(PH8.0), 1.5mmol/L乙酸钙和50%甘油的溶液，高压灭菌后，该混合溶液溶解蛋白酶K粉末至浓度为20mg/ml，将配制的蛋白酶K溶液零下20度保存。)
样品清洗液；(溶液成分为:5(Γ85%的乙醇以及终浓度为3 300mmol/L的乙酸钠)
核酸洗脱液；(20mmol/L的TE溶液)
样品富集柱；(市场外购)
恒温扩增反应液；(成分如下)
对照品(包括阳性和阴性对照品)；阳性对照为人工合成的核苷酸，序列为:acagttggctgctgctgctg ctgttccttg attgactcca tttttagaat attgggttat taggattcag tagttctgttattcctagac aacacgtctt gtctgtacga ttagtcgaga tgatgtgatg tagagccctt gcccgtgcctcaatatatac ccctcagtag accttgataa tcacggttgc caaacaacaa cggttggaaa tcttagtagaaagaaccaat ggaacaagtc aggataataa tatacagtat aagcttttgg ggaacaacat tcatttattgtcatagcgct aacattagaa gtacaagaac aggtgattct gcatccagct cattttgttc aacccacttcatttgcaggg gacaacactc ttctttcttg aaaaatatgg atgaagacac ttggaattct tcaataggccctggggcgtt gctggaggag gacgcagaag aagaagaaga acagctgccg ttgaacgagt ttatagtttccagaagacaa cataatttag ctgtaattgg acgaggagac ttcttgtaat gagagaacca caaaattcttcttcccgtct tttctggtat aaaagtagtc ccataatatg ttcctttctg gactaccaca ttatcttcgtttaagggaac atatctgacc gactttctca tcaagggctg atctccattt cttgttgtgc ttagagccgatttgtattcc ccgtcgttea cgttatagtt gcatatagaa cagtgggatg aaaggaactt gtcggttacgtgttcagttt gtacaagata actggacgca tttgctagtt ctggagggac gtcctggttt ttgtttattgttgaagtagg ttttatcttt ttcctattta agcacacacc ctttgaatta atgtgtatgc gattcgcattgatgtatatg cagattgtga gtgctggaga aaatggtatc tcaaaatcgg tagctggttc aataatttctggttcaactt cctgttgttc ttcttcctca，浓度为500 100000拷贝/毫升，每个试剂盒中为5^200微升。阴性对照为超纯水或鲑鱼精DNA。超纯水；
核酸检测试纸条及其缓冲液；核酸检测试纸条可选用Milenia_ GenLine HybriDetect和杭州Ustar公司的核酸检测试纸条等具有类似检测功能的试纸。LAMP恒温扩增试剂包括:增效引物的上游引物F3和下游引物B3各f 2uM，扩增引物的上游引物FIP和下游引物BIP各0.Γ0.4uM，扩增引物的检测探针FD和检测探针BD 各 0.Γ0.4uM, dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 0.8 2.0mM, MgCl2 4 10 mM,甜菜碱 0.6 1.2M,Tris-HCL 10 40 mM, KCl 10 20 mM, MgSO4 Γ4 mM, (NH4)2SO4 6 12 mM, Triton X-100
0.59Γ1.0%，具有链置换活性的DNA聚合酶2 20u。本发明的检测试剂盒，上述扩增反应液中扩增引物的核酸序列是:
2F 3:tcagtagttctgttattcctagaSEQ ID N O: 5
2B 3:tccccaaaagcttatactgtaSEQ ID N O:6
2FIP:tgaggggtatatattgaggcacgaaaacacgtcttgtctgtacg SEQ ID NO:7 2BIP:gtagaccttgataatcacggttgcaaattatcctgacttgttccattg SEQ ID NO:8 检测探针为:
2&3BD:BIOTIN-ggcaagggctctacatcacaSEQ ID N 0: 2 3
2&3FD:FITC-caaacaacaacggttggaaa SEQ ID NO:24 相关的所有引物由引物合成的专业公司进行合成，均为人工合成的核酸片段。应用本发明试剂盒的相应检测方法，步骤如下:
Ca)取样品0.02、.2g置于采样管中，用研磨棒磨碎样品或用其他方法使样品变至浆
状；
(b)取上述体积为N的浆状的样品中加入f2N体积的裂解液和0.0lN体积的蛋白酶K溶液，60°C水浴5 30分钟；
(c)将上述样品液转移至样品富集柱中，600(Tl2000RPM离心I飞分钟，弃滤液； Cd)加入0.2^2毫升样品清洗液至样品富集柱中，600(Tl2000RPM离心I飞分钟，弃滤
液；
(e)加入0.05^1毫升核酸洗脱液至样品富集柱中，静置I飞分钟，600(Tl2000RPM离心Γ5分钟，收集滤液；
Cf)取3飞微升滤液加入到含有LAMP恒温扩增反应液的0.2毫升离心管内，将离心管置于55 65°C条件下保温4(T70min ；
(g)取3飞微升反应产物加到检测用的核酸免疫层析检测试纸条的样品垫上，滴加2 4滴缓冲液，室温静置I飞分钟后观察结果。
(h)在试纸条上出现两条红色的带为阳性，说明样品中含有白斑综合征病毒病毒核酸；在试纸条上只出现一条红色的条带为阴性，说明样品中不含有白斑综合征病毒病毒核酸；在试纸条上无任何明显条带，说明反应无效，请重做反应。
实施例3:
根据实施例1、2，本实施例具体公布一种使用方式，由于篇幅所限，配方、序列等在此不在赘述。一.样品提取:
1.取5 IOOmg待测组织(新鲜或-70°C及液氮中保存的组织均可)置研钵中，加入Iml生理盐水研磨至浆状，将0.5ml浆状样本转移至1.5ml离心管中；
2.加入0.5ml饱和酚，颠倒混匀，10000RPM,离心10分钟，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的1.5ml离心管中；
3.加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，10000 RPM，离心10分钟，取上层转移到新的1.5ml离心管中；
4.加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)，颠倒混匀，10000 RPM，离心10分钟，取上层清液到一个新的1.5ml离心管；
5.加入2.5倍体积的-20 ° C预冷的无水乙醇沉淀DNA，冷冻保存半小时；
6.12000 RPM，离心10分钟，弃乙醇；
7.-20° C保存的75%乙醇洗涤，10000 RPM,离心5分钟，去乙醇；
8.风干，加入适量的H20溶解(必要时可65°C促溶10 15min)；
二.恒温扩增:
1.取4ul上述样本加入扩增反应液中；
2.60 °C反应40分钟。三.结果检测:
1.取Sul扩增产物，滴加于检测试纸条的样品垫上；
2.将含有产物的试纸条放入含有10(T200ul缓冲液的2ml平底小离心管中；
四.结果判读:
在试纸条上出现两条红色的带为阳性，说明样品中含有白斑综合征病毒病毒核酸；在试纸条上只出现一条红色的条带为阴性，说明样品中不含有白斑综合征病毒病毒核酸；在试纸条上无任何明显条带，说明反应无效，请重做反应。使用含有硅胶膜的核酸快速富集体系，大大缩短了样品核酸的制备时间，同时保证了样品的纯度，有利于恒温扩增反应的进行。本实施例采用的引物探针组合为:
3 F 3:ctgttattcctagacaacacgSEQ ID N O:9
3 B 3: tcccca aaagc11atactgtaSEQ ID N 0:1 0
3FIP:aggggtatatattgaggcacggaaatcttgtctgtacgattagtcg SEQ ID NO:11 3BIP:gtagaccttgataatcacggttgcaaattatcctgacttgttccattg SEQ ID NO:12 2&3BD: BIOTIN-ggcaagggctctacatcacaSEQ ID N 0: 2 3
2&3FD:FITC-caaacaacaacggttggaaa SEQ ID N 0: 2 4实施例4:
参照前实施例，本实施例的区别在于采用的弓I物和探针组合为:
4F3:aatatatacccctcagtagaccSEQ ID N O:1 3
4B3:ggatgcagaatcacctgtSEQ ID N O:1 4
4FIP:tgacttgttccattggttctttctaaaattgataatcacggttgcca SEQ ID NO:15 4BIP:atacagtataagcttttggggaacaaaatcttgtacttctaatgttagcg SEQ ID NO:16 4BD: BIOTIN-gatttccaaccgttgttgttSEQ ID N 0: 2 5
4FD: FITC-acattcatttattgtcatagSEQ ID N 0: 2 6
其余步骤不在赘述。 实施例5:
参照前实施例，本实施例的区别在于采用的弓I物和探针组合为:` 5 F 3:tgccaaacaacaacggttSEQ ID N O:1 7
5 B 3:cccctgcaaatgaagtggSEQ ID N O:1 8
5FIP:tgaatgttgttccccaaaagcttataaaggaaatcttagtagaaagaaccaa SEQ ID NO:195BIP:ttgtcatagcgctaacattagaagtaaattgaacaaaatgagctggat SEQ ID NO:205BD: BIOTIN-actgtatattattatcctgaSEQ ID N 0: 2 7
5FD: FITC-acaagaacaggtgattctgcSEQ ID N 0: 2 8
尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。
权利要求
1.斑综合征病毒检测试剂盒，其特征是:包括含有扩增引物的扩增反应液；所述的扩增引物选自下组: IFIP:gcaagggctctacatcacatcataaatattcctagacaacacgtcttgSEQ ID NO:3， IBIP:ccgtgcctcaatatatacccctaaatctttctactaagatttccaaccSEQ ID NO:4 ； 2FIP:tgaggggtatatattgaggcacgaaaacacgtcttgtctgtacgSEQ ID NO:7, 2BIP:gtagaccttgataatcacggttgcaaattatcctgacttgttccattgSEQ ID NO:8 ； 3FIP:aggggtatatattgaggcacggaaatcttgtctgtacgattagtcgSEQ ID NO:11， 3BIP:gtagaccttgataatcacggttgcaaattatcctgacttgttccattgSEQ ID NO:12; 4FIP:tgacttgttccattggttctttctaaaattgataatcacggttgccaSEQ ID NO:15，4BIP:atacagtataagcttttggggaacaaaatcttgtacttctaatgttagcgSEQ ID NO:16;5FIP:tgaatgttgttccccaaaagcttataaaggaaatcttagtagaaagaaccaa SEQ ID NO:19， 5BIP:ttgtcatagcgctaacattagaagtaaattgaacaaaatgagctggatSEQ ID NO:20。
2.据权利要求1所述的白斑综合征病毒检测试剂盒，其特征是:所述的扩增反应液还含有选自下组的检测探针: IBD:BIOTIN-ctcgactaatcgtacagaSEQ ID NO:21， IFD:FITC-ccttgataatcacggttgccSEQ ID NO:22 ； 2&3BD:BIOTIN-ggcaagggctctacatcacaSEQ ID NO:23， 2&3FD:FITC-caaacaacaacggttggaaaSEQ ID NO:24 ； 4BD:BIOTIN-gatttccaaccgttgttgttSEQ ID NO:25， 4FD:FITC-acattcatttattgtcatagSEQ ID NO:26 ； 5BD:BIOTIN-actgtatattattatcctgaSEQ ID NO:27， 5FD:FITC-acaagaacaggtgattctgcSEQ ID NO:28。
3.据权利要求1所述的白斑综合征病毒检测试剂盒，其特征是:所述的扩增反应液还含有选自下组的增效引物: 1F3:gttattaggattcagtagttctgtSEQ ID NO:1, 1B3:cctgacttgttccattggtSEQ ID NO:2 ； 2F3:tcagtagttctgttattcctagaSEQ ID NO:5, 2B3:tccccaaaagcttatactgtaSEQ ID NO:6 ； 3F3:ctgttattcctagacaacacgSEQ ID NO:9， 3B3:tccccaaaagcttatactgtaSEQ ID NO:10 ； 4F3:aatatatacccctcagtagaccSEQ ID NO:13， 4B3:ggatgcagaatcacctgtSEQ ID NO:14 ； 5F3:tgccaaacaacaacggttSEQ ID NO:17， 5B3:cccctgcaaatgaagtggSEQ ID NO:18。
4.据权利要求1至3任一权利要求所述的白斑综合征病毒检测试剂盒，其特征是:还含有阳性对照品；所述的阳性对照品的核苷酸序列为:acagttggct gctgctgctgctgttccttg attgactcca tttttagaat attgggttat taggattcagtagttctgtt attcctagacaacacgtctt gtctgtacga ttagtcgaga tgatgtgatg tagagcccttgcccgtgcct caatatatacccctcagtag accttgataa tcacggttgc caaacaacaa cggttggaaatcttagtaga aagaaccaatggaacaagtc aggataataa tatacagtat aagcttttgg ggaacaacat tcatttattg tcatagcgctaacattagaa gtacaagaac aggtgattct gcatccagct cattttgttc aacccacttc atttgcaggggacaacactc ttctttcttg aaaaatatgg atgaagacac ttggaattct tcaataggcc ctggggcgttgctggaggag gacgcagaag aagaagaaga acagctgccg ttgaacgagt ttatagtttc cagaagacaacataatttag ctgtaattgg acgaggagac ttcttgtaat gagagaacca caaaattctt cttcccgtcttttctggtat aaaagtagtc ccataatatg ttcctttctg gactaccaca ttatcttcgt ttaagggaacatatctgacc gactttctca tcaagggctg atctccattt cttgttgtgc ttagagccga tttgtattccccgtcgttea cgttatagtt gcatatagaa cagtgggatg aaaggaactt gtcggttacg tgttcagtttgtacaagata actggacgca tttgctagtt ctggagggac gtcctggttt ttgtttattg ttgaagtaggttttatcttt ttcctattta agcacacacc ctttgaatta atgtgtatgc gattcgcatt gatgtatatgcagattgtga gtgctggaga aaatggtatc tcaaaatcgg tagctggttc aataatttct ggttcaacttcctgttgttc ttcttcctcaSEQ ID NO:29。
5.斑综合征病毒检测方法，其特征是包括下列步骤: 核酸抽提步骤:抽提样品的DNA ； 扩增杂交步骤:将核酸抽提步骤得到的DNA加入含有引物和探针的LAMP反应液中； 所述的引物为权利要求1中所述的扩增引物或权利要求3中所述的增效引物或其组合；所述的探针为含有权利要求2中所述核苷酸序列；所述的LAMP反应液中的I条带有FITC标记和I条带有BIOTIN标记的探针的引物进行恒温扩增，同时扩增得到的产物能与所述的探针结合，形成可供检测的杂交分子； 检测步骤:将得到的杂交分子滴加在核酸免疫层析试纸条上检测杂交结果。
6.据权利要求5所述的白斑综合征病毒检测方法，其特征是所述的检测过程包括如下步骤: Ca)取样品物理处理至浆状； (b)取上述体积为N的浆状的样品中加入1~2N体积的裂解液和0.0lN体积的蛋白酶K溶液，60°C加温处理5 30分钟； (c)将上述样品液600(Tl2000RPM离心I 5分钟，弃滤液； Cd)加入样品清洗液至经步骤(c)处理的样品液中，600(~l2000RPM离心1~5飞分钟，弃滤液； (e)加入核酸洗脱液至样品富集柱中，静置I飞分钟，600~l2000RPM离心1~5飞分钟，收集滤液； Cf)取步骤(e)处理的滤液到含有LAMP恒温扩增反应液中，置于55~65°C条件下保温40 70min ； (g)取经步骤(f)处理的产物到检测用的核酸免疫层析检测试纸条的样品垫上，滴加缓冲液，观察结果。
7.据权利要求6所述的白斑综合征病毒检测方法，其特征是:所述的LAMP恒温扩增反应液包括:扩增引物、增效引物、检测探针；还含有dATP、dTTP、dGTP、dCTP，MgCl2 4 10mM，甜菜碱，Tris_HCL，KCl，MgS04，(NH4)2SO4, Triton X-100，具有链置换活性的 DNA 聚合酶。
全文摘要
本发明公开了一种白斑综合征病毒检测试剂盒及检测方法。本发明的试剂盒结合了核酸快速提取、LAMP等温扩增以及核酸免疫层析试纸条检测各自的优势，使得整个检测过程无需昂贵的仪器设备；同时由于采用核酸免疫层析试纸条方法进行结果检测，提高了检测可靠性和结果易判断性。本试剂盒检测成本低、使用方便，对人和环境安全，可替代已有的相关检测方法。本发明的试剂盒可在野外生产现场和各级实验室使用，对加强白斑综合征病毒监测，及时发现并控制病毒传播、尽早发现并预防疫病大规模暴发流行等，具有推广应用价值。
文档编号C12Q1/70GK103088156SQ20121057401
公开日2013年5月8日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者石坚, 钱冬, 徐锦余 申请人:杭州三合创新科技有限公司, 宁波大学