25ng/ml骨形成蛋白4 (BMP4)、luM维甲酸(RA)和0.3mmol/L抗坏血酸(AA)，所述用于胚胎干细胞培养的分化培养基含有体积百分比浓度为1%的N2添加剂、体积百分比浓度为99%的DMEM/F12培养液。
[0034]2.2实验组诱导方法:采用传代后第4天的hESC在上述配方的诱导剂中贴壁培养7日，每日换液，第7日将细胞以中性蛋白酶(Dispase)消化后，取1/3的细胞接种至I型胶原包被的培养皿以角化细胞培养液继续贴壁培养4周，隔日换液，在细胞对数生长期传代。
[0035]2.3对照组设置:对照组培养基的配制:将对照诱导剂加入到用于胚胎干细胞培养的分化培养基中既得，其中，对照诱导剂由骨形成蛋白4和抗坏血酸组成，对照组培养基中含有25ng/ml骨形成蛋白4 (BMP4)和0.3mmol/L抗坏血酸(AA)。对照组中用于胚胎干细胞培养的分化培养基同实验组，且对照组诱导方法同实验组。
[0036]3.本发明的效果检测:
[0037]3.1形态学检测，结果如图1 (A2、A7、A14、A21、A28和A35分别为对照组细胞分化第2、7、14、21、28和35天倒置显微镜镜下照片，B2、B7、B14、B21、B28和B35为实验组细胞分化第2、7、14、21、28和35天照片，标尺显示0.1mm)所示:
[0038]对照组诱导分化l-7d，克隆面积逐渐增大，分化由克隆边缘开始向中心进展，分化细胞呈卵圆形单层贴壁生长，部分区域呈现铺路石状，未分化细胞仍克隆样聚集生长，分化细胞与未分化细胞之间分界明显。第7天1:3传代接种于I型胶原铺被的培养皿中用DSFM培养，24h内贴壁仍以克隆形式生长。第10天，细胞加速增殖，核分裂象多见，细胞数量明显增多，第14天，细胞逐渐生长融合成片，克隆周围见铺路石状细胞，中央仍保持未分化细胞层叠状。第16天，细胞融合，按上述方法传代，第18天，细胞贴壁，完全伸展的细胞呈扁平多边形，大小形状不一。第35天，见细胞融合，未分化细胞密集成堆，分化细胞散在生长呈铺路石状。
[0039]实验组诱导第l-7d，ES克隆生长速率大于实验A组，第2天镜下见分化细胞多于A组，细胞呈卵圆形、形态大小均一的铺路石状，逐渐生长融合成片，分化与未分化细胞之间界限不明显。第7天细胞密集层叠，传代方法同A组，24h内贴壁细胞多于A组。第9天细胞加速增殖逐渐融合成片，核分裂像多见，呈大小均一的铺路石状。第14天细胞逐渐生长融合成片，克隆周围见条索状细胞，中央为大小均一的铺路石状细胞，单层细胞生长。细胞生长速率减慢，明显小于A组。第19天细胞融合，传代同A组。第21天细胞逐渐贴壁，为折光性强的圆形细胞。随后细胞逐渐伸出短小伪足，胞质展开，单细胞生长。第35天，细胞增多，呈大小形态均一的铺路石状，未见未分化细胞。
[0040]3.2流氏细胞技术检测，结果如图2 (ES为诱导前hESC的CK14表达率，A为对照组分化第35天细胞CK14阳性率，B为实验组分化第35天细胞CK14阳性率)所示:
[0041]实验组分化第35天细胞CK14阳性率为77.93%±4.08 (n=3)，对照组细胞阳性率为(9.97±2.16)% (n=3，)经 Student，st 检验，差异有统计学意义 t (=28.9, P < 0.01)o
[0042]3.3免疫荧光染色检测，结果如图3 (A为对照组细胞分化第35天CK15染色，B为实验组细胞分化第35天CK15染色；C为实验组细胞分化第35天P63染色，D为C与核染色照叠加；E为对照组细胞分化第35天P63染色，F为E与核染色照叠加所示):
[0043]分化第35天，实验组CK15、P63荧光表达量均显著高于对照组。
[0044]本发明将AA、BMP4与RA联合诱导胚胎干细胞，第35天时细胞高表达角化细胞标记物P63蛋白、角蛋白14、15，细胞呈大小形态均一的铺路石状，在外观和生物学特性上均接近人角化细胞。经流式细胞技术检测角蛋白14表达率高达77.93%，远远高于其他配方诱导剂。本发明提供的诱导剂提高人胚胎干细胞定向诱导分化为角化细胞的效率，提供了一条高效诱导hESC向角化细胞分化的途径。
[0045]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1.一种诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的诱导剂，其特征在于，所述诱导剂包含骨形成蛋白4、维甲酸和抗坏血酸。
2.根据权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，所述诱导剂中，骨形成蛋白4、维甲酸和抗坏血酸的含量比为(l_50g): (0.l-5mol): (50_600mol)。
3.根据权利要求2所述的诱导剂，其特征在于，骨形成蛋白4、维甲酸和抗坏血酸的含量比为(20-35g): (0.5-3mol): (200_400mol)。
4.一种诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的培养基，其特征在于，所述培养基中含有权利要求1所述的诱导剂，且培养基中骨形成蛋白4的含量为l_50ng/ml，维甲酸的含量为0.l_5uM，抗坏血酸的含量为0.05-0.6mmol/L0
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述培养基中骨形成蛋白4的含量为20-35ng/ml，维甲酸的含量为0.5_3uM，抗坏血酸的含量为0.2-0.4mmol/L。
6.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括用于胚胎干细胞培养的分化培养基。
7.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述的用于胚胎干细胞培养的分化培养基含有DMEM/F12培养液和N2添加剂，DMEM/F12培养液的体积百分比浓度为95-99.9%、N2添加剂的体积百分比浓度为0.1-5%。
8.一种诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的方法，其特征在于，采用权利要求4-7中任意一项所述的诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的培养基，包括以下步骤: 步骤1，采用传代后胚胎干细胞在权利要求4-7中任意一项所述的培养基诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的中贴壁培养5-10日，每日换液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括前处理步骤:将胚胎干细胞株在培养基中进行培养，传代。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括后处理步骤:将步骤I处理得到的细胞以中性蛋白酶消化后，接种至I型胶原包被的培养皿中，以角化细胞培养液继续贴壁培养3-6周，隔日换液，在细胞对数生长期传代。
【专利摘要】本发明提供了一种诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的诱导剂所述诱导剂包含骨形成蛋白4、维甲酸和抗坏血酸。优选地，所述诱导剂中，骨形成蛋白4、维甲酸和抗坏血酸的含量比为（1-50g）:（0.1-5mol）:（50-600mol）。本发明提供的诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的诱导剂，复合了骨形成蛋白4、维甲酸和抗坏血酸，能够有效提高hESC定向诱导分化为角化细胞的效率（高达77.93%，远远高于其他配方诱导剂）提供了一条高效诱导hESC向角化细胞分化的途径，为组织工程化口腔黏膜构建提供种子细胞。
【IPC分类】C12N5-071, C12N5-0735
【公开号】CN104651298
【申请号】CN201310596606
【发明人】周海文, 李晗卿, 傅歆, 肖苒
【申请人】上海交通大学医学院附属第九人民医院
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2013年11月21日