w4部分对NK细胞生长无明显影响。各 三叶青提取物对NK细胞生长均有时间依赖性，药物诱导时间越长，促进细胞增殖越明显， 组与组之间比较均有统计学差异（P < 0. 05)，最佳的提取物浓度范围为0. 01 y g/ml至 2. 44 y g/ml，结果见图2~图9。
[0060] 实施例3:对扩增产物进行NK细胞扩增倍数检测
[0061] 四种三叶青提取物对NK细胞增殖影响：
[0062] 在试验中发现，各三叶青提取物对NK细胞生长均有浓度窗现象，并且其中一些提 取物（Th-t、Th-p、Th-w2和Th-w3)促进NK细胞增殖更明显。因此，本项试验选择这四种提 取物对NK细胞进行长时间增殖实验。经这四种提取物诱导培养的NK细胞数各时间段均高 于对照组；至培养至第16天时，提取物Th-t、Th-p、Th-w2和Th-w3诱导的NK细胞增殖倍 数分别为2468倍、1646倍、6334倍和5373倍，显著高于对照组的（263倍），相比较均有统 计学差异（P < 〇. 05)，以水煮脱糖部位（Th-w3)结果最显著，结果见图10-13。
[0063] 实施例4:扩增产物NK细胞对三株肿瘤细胞的杀伤活性检测
[0064] NK细胞培养及扩增：
[0065] 取健康献血者外周抗凝血10ml，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含500U/ml rhIL-2的NK培养基调整细胞密度为3. 5 X 105/mL，接种于6孔细胞培养板中，每孔5ml，于 37°C、5% C02培养箱培养，每2天半量换液1次，并调整细胞密度为5X105/mL，收集培养7 天的NK细胞，加入PE标记的⑶3、FITC标记的⑶56进行细胞表面标志检测。
[0066] 实验组：共设11个浓度组，加入不同浓度的三叶青总提取物（终浓度分别为 0? 000625、0. 0025、0. 01、0. 039、0. 155、0. 62、2. 44、9. 76、39、156ii g/ml)每组设 5 个复孔， 效应细胞；对数生长期的胃癌MKN45、肺癌A-549和肝癌SMMC-7721细胞分别配成2 X 108/L， 作为靶细胞；将效靶细胞各取0. 5ml等量混合（效靶细胞比例=10:1)，同时设置不加三叶 青提取物为对照组。置37°C、5% C02培养箱中孵育6h后，轻轻混匀，重悬细胞，1500r/min 离心10min，收集上清液。LDH试剂盒按说明书要求操作，340nm波长下Encore自动生化分 析仪测定LDH的活性单位（U/L)。每检测样本设3个复管，重复3遍，取平均值。
[0067] NK细胞的杀伤活性=(测定管LDH单位一效应细胞自然释放LDH管V(靶细胞最 大释放LDH管一靶细胞自然释放LDH管）X100%。
[0068] 实验结果显示，浓度为2. 44~0. 01 y g/ml三叶青总提取物（TH-t)作用72h后的 NK细胞细胞，对胃癌MKN45、肺癌A-549和肝癌SMMC-7721细胞的杀伤活性显著高于对照 组，差异有统计学意义（P < 〇. 05)。
[0069] 在0.1251^/1111时杀伤活性达最高（分别为66.4%、75.1%和79.7%)，与对照组 (分别为38. 4%、4L 8%和41. 2%)比较差异有统计学意义（P< 0.05)。三叶青浓度高于 2. 44 y g/ml时，杀伤活性随浓度增高逐渐降低，当浓度为59mg/L时，可抑制NK细胞对3株 肿瘤细胞的杀伤活性（P < 〇. 05)，结果见图14。
[0070] 实施例5:对扩增产物NK细胞的穿孔素、⑶107a和颗粒酶B的表达 [0071]NK细胞培养及扩增
[0072] 取健康献血者外周抗凝血10ml，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含500U/ml rhIL-2的NK培养基调整细胞密度为3. 5 X 105/mL，接种于6孔细胞培养板中，每孔5ml，于 37°C、5% C02培养箱培养，每2天半量换液1次，并调整细胞密度为5X105/mL，收集培养7 天的NK细胞，加入PE标记的⑶3、FITC标记的⑶56进行细胞表面标志检测。
[0073] 实验组：共设9个浓度组，加入不同浓度的三叶青总提取物（终浓终浓度分别为 0、39、9. 76、2. 44、0. 62、0. 155、0. 039、0. 01 和 0. 0025 ii g/ml 的三叶青提取物，每组 3 个复 孔。于37°C、5% C02培养箱中培养48h。收集细胞并用磷酸盐缓冲液（PBS)洗涤2次， 每管加入&11衍-〇)3-和0)56+1'0? 711^2〇111，避光孵育3〇111111。加入10〇111固定液室 温避光孵育15min，PBS洗漆1次。每管加100 y 1破膜液，100 y 1 anti-Perforin抗体及 anti-granzyme B-PE抗体和APC标记的O)107a抗体，室温避光孵育15min，PBS洗漆后，重 悬于0. 5ml的PBS溶液中，分别用流式细胞术检测穿孔素、颗粒酶B和⑶107a的表达。
[0074] 采用SPSS13. 0软件进行统计学处理，计量资料使用均数土标准差（mean土 SD)表 示，组间比较采用单因素方差分析（One-way AN0VA)，检验水准a = 〇. 05, P彡0. 05有统 计学意义。
[0075]与 0 ii g/ml 对照组相比，5 ii g/ml、10 ii g/ml、20 ii g/ml、40 ii g/ml、80 ii g/ml 的三 叶青提取物作用NK细胞48h后，其穿孔素和颗粒酶B阳性表达均明显升高，在5 y g/ml~ 40 y g/ml浓度时，具有一定的剂量依赖性。其中，40 y g/ml三叶青提取物组的穿孔素和颗 粒酶B阳性表达率达到最高值，分别为71. 70% ±2. 31 %和82. 16% ±1.29%，而浓度超过 40 y g/ml时穿孔素和颗粒酶B阳性表达率有所下降，结果见图15。
[0076] 实施例6:加三叶青总提取物（Th-t)扩增NK细胞
[0077] (1)单个核细胞分离：静脉穿刺采集患者外周血，转移至含肝素钠的抗凝瓶中，上 下混匀，将外周血样本移至离心管进行离心，弃上层血浆，生理盐水稀释血样，淋巴分离液 分离单个核细胞，生理盐水重悬单个核细胞，离心收集单个核细胞；
[0078] (2)细胞种瓶：将上述单个核细胞用含rhIL-2的NK细胞培养液稀释至细胞浓度 为3. 5 X 105,接种于6孔细胞培养板中，每孔5ml，于37°C、5 % C02培养箱培养；
[0079] (3)细胞扩增：每2天半量换液1次，并调整细胞密度为5X104/mL，NK细胞培养至 第7天，向培养液中添加三叶青总提取物（Th-t)，浓度为0. 00625 y g/ml，此后继续培养；
[0080] (4)细胞收集：培养16天，收集培养的NK细胞。
[0081] 实施例7 :加三叶青总提取物（Th-t)扩增NK细胞
[0082] (1)单个核细胞分离：静脉穿刺采集患者外周血，转移至含肝素钠的抗凝瓶中，上 下混匀，将外周血样本移至离心管进行离心，弃上层血浆，生理盐水稀释血样，淋巴分离液 分离单个核细胞，生理盐水重悬单个核细胞，离心收集单个核细胞；
[0083] (2)细胞种瓶：将上述单个核细胞用含rhIL-2的NK细胞培养液稀释至细胞浓度 为1X10 6,接种于6孔细胞培养板中，每孔5ml，于37°C、5% C02培养箱培养；
[0084] (3)细胞扩增：每2天半量换液1次，并调整细胞密度为6X 104/mL，NK细胞培养 至第7天，向培养液中添加三叶青总提取物（Th-t)，浓度为0. . 62 y g/ml，此后继续培养；
[0085] (4)细胞收集：培养21天，收集培养的NK细胞。
[0086] 按实施例6的所述的步骤方法进行三叶青提取物扩增NK细胞
[0087]
【主权项】
1. 一种体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于包括向NK细胞培养液中添加三叶青 提取物，所述的三叶青提取物的浓度为〇. 00625 μ g/ml~9. 76 μ g/ml。
2. 根据权利要求1所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 单个核细胞分离：静脉穿刺采集患者外周血，转移至含肝素钠的抗凝瓶中，上下混 匀，将外周血样本移至离心管进行离心，弃上层血浆，生理盐水稀释血样，淋巴分离液分离 单个核细胞，生理盐水重悬单个核细胞，离心收集单个核细胞； (2) 细胞种瓶：将上述单个核细胞用含rhIL-2的NK细胞培养液稀释至细胞浓度为 2X105~lX10 6/ml，接种于6孔细胞培养板中，每孔5ml，于37°C、5% C02培养箱培养； (3) 细胞扩增：每2天半量换液1次，并调整细胞密度为4X IO4~6 X 10 4/mL，NK细胞 培养至第7天，向培养液中添加三叶青提取物，浓度为0. 00625 μ g/ml~9. 76 μ g/ml，此后 继续培养； (4) 细胞收集：培养3至21天，收集培养的NK细胞。
3. 根据权利要求2所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于所述步骤（2)中的 rhIL-2 的浓度为 500U/ml。
4. 根据权利要求2所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于所述步骤（2)中 NK细胞浓度为3. 5 X105ml。
5. 根据权利要求2所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于所述步骤（3)中调 整细胞密度为5 X IO4Ail。
6. 根据权利要求1或2所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于所述三叶青提 取物的浓度为〇· 01 μ g/ml~2. 44 μ g/ml。
7. 根据权利要求1或2所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于所述三叶青提 取物为三叶青总提取物，其制备方法为用乙醇溶液加热回流三叶青而提取得到的。
8. 根据权利要求1或2所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于所述三叶青提 取物为水煮脱糖部位Thi3,其制备方法为经有机溶剂提取后的三叶青药材用水煮后减压 回收蒸干。
9. 根据权利要求1或2所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于所述三叶青提 取物为石油醚部位Th-p，取三叶青总提取物，用石油醚进行分步萃取得到。
10. 根据权利要求1或2所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于所述三叶青 提取物为Thi2,其制备方法为三叶青总提取物的水部位除去糖分，用30 %乙醇水洗脱溶 液蒸干后得到。
【专利摘要】本发明提供一种体外诱导扩增NK细胞的方法，包括向NK细胞培养液中添加三叶青提取物，所述的三叶青提取物的浓度为0.00625μg/ml~9.76μg/ml，所述的三叶青提取物为三叶青总提取物Th-t、水煮脱糖部位Th-w3、石油醚部位Th-p或水部位脱糖部位Th-w2；本方法可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的NK细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标，同时该方法操作简便，成本低，适用于大规模应用；利用本方法所获得的NK细胞，在细胞数量、纯度、杀伤活性、细胞因子分泌水平均有显著提高，利用本方法培养，细胞数量提高了几千倍。
【IPC分类】C12N5-0783
【公开号】CN104651310
【申请号】CN201510090232
【发明人】刘军权, 陈锦阳, 杨阳
【申请人】杭州中德贝尔生物科技有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月28日