一种孕妇外周血中胎儿游离dna比例的定量方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及DNA定量领域，尤其涉及一种孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量 方法。
【背景技术】
[0002] 无创产前基因检测是通过采集孕妇外周血（5ml)，提取其中的游离DNA，采用高通 量测序技术，结合生物信息分析，得出胎儿患染色体非整倍体（21-三体又称唐氏综合征， 18-三体，13-三体）的风险。研宄发现，从孕4周开始，在孕妇外周血中即可检测到胎儿的 游离DNA。随着孕周增大，胎儿游离DNA含量也随之增加。孕12周后，通过抽取孕妇外周血 并从中提取出胎儿游离DNA，利用新一代基因测序技术并结合生物信息学分析手段，便可准 确判断胎儿是否患有染色体病。该方法最佳检测时间为孕早、中期，具有无创取样、无流产 风险、高灵敏度，准确性高的特点。
[0003] 无创产前基因检测技术通过分析孕妇外周血中DNA来判断胎儿是否存在染色体 非整倍体，而不是针对性的分析胎儿的DNA，因此当胎儿DNA比例过低时（〈3%)，可能因为 胎儿DNA量太少而不能被检测出来染色体是否有异常，所以胎儿DNA的含量对检测结果的 准确性和敏感性都起到了重要的作用。
[0004] 在一份检测结果中，如果知道胎儿DNA的比例将是对一份结果准确性的最好的复 核。通过准确的定量胎儿DNA的比例，设定该DNA比例下三体所对应的阈值，对检测结果的 准确性起到复核作用，同时能够避免孕周大但胎儿游离DNA浓度低造成的假阴性。虽然现 在行业内都通过接收孕12周以后的孕妇来减少这种情况的发生，但孕妇个体之间的差异 还是可能存在胎儿DNA比例较低（2%的孕妇会因为胎儿DNA含量低而被要求重新抽血)。现 有技术通过对男胎中含有的Y染色体信息来判断男胎的浓度，对女胎还没有有效的方法。
[0005] 现有技术中，甲基化定量胎儿游离DNA浓度的方法被很多研宄证实可以用来定量 胎儿游离DNA浓度。采用该方法抽取外周血后，经DNA分离、甲基化敏感限制性内切酶消除 样本中母源性（非甲基化）DNA，未分解的胎儿DNA在PCR扩增，最后定量胎儿DNA量。 通过计算胎儿DNA量占外周血DNA量的比例来计算胎儿游离DNA浓度。
[0006] 但该方法还存在以下两个缺点： 1、被确定的稳定的甲基化标志基因较少，它需要具备两个条件：1)孕妇和胎儿甲基化 的差异要大，孕妇要完全不甲基化，胎儿要完全甲基化。2)甲基化差异必须保持稳定，不 会因为个人之间在数量或在怀孕期不同时期存在差异。
[0007] 2、甲基化定量胎儿游离DNA浓度的方法是通过一个基因，因为量少的原因需要经 过PCR来扩增，其中引入的误差不好被校正。
[0008] 另外，还有一种方法是荧光定量PCR或者绝对定量PCR法，其也被用来定量胎儿游 离DNA浓度，但其有个共同的缺点就是可用的目标基因数据少，且能获得DNA量也少，很容 易有偏差。
[0009] 因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0010] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种定量孕妇外周血中胎儿游 离DNA比例的方法，旨在解决现有的孕妇外周血DNA定量方法准确性低、容易有偏差的问 题。
[0011] 本发明的技术方案如下： 一种孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，包括步骤： A、 设计位点：在人类基因组中，找出突变频率在0. 4-0. 6的SNP位点； B、 设计引物：根据设计的SNP位点，设计出覆盖SNP位点的SNP引物； C、 提取样品DNA ; D、 扩增含有SNP位点的DNA片段：将样品DNA、多重PCR反应酶和SNP引物混匀后，进 行PCR反应得到PCR产物； E、 纯化扩增到的PCR产物； F、 末端修复：将PCR产物、末端修复酶与末端修复酶缓冲液混合，室温下孵育进行反应 得到混合DNA液； G、 片段筛选：对步骤F所得混合DNA液进行片段筛选及纯化，得到平末端DNA片段； H、 接头连接：将所得的平末端DNA片段与连接酶、连接酶缓冲液、及指定接头混合后， 室温下孵育进行反应得到混合DNA液； I、 片段筛选：对步骤H所得混合DNA液进行片段筛选及纯化，得到加接头的DNA片段； J、 PCR扩增：对所得加接头的DNA片段进行PCR扩增及纯化，得到小片段文库； K、 文库检测：对小片段文库检测浓度和片段大小； L、 高通量测序：对检测合格的小片段文库进行高通量测序； M、 数据预处理：将高通量测序得到的数据首先经过低质量过滤，筛选出长度大于 100bp的序列； N、 序列比对：将预处理后的序列与人类基因组序列进行比对； 〇、序列筛选：根据比对的结果，筛选出unique read的序列； P、 SNP数据统计：根据比对结果及SNP位点的位置统计出SNP位点的覆盖深度、碱基种 类、每种碱基对应数目； Q、 根据统计结果，对每个SNP位点中四种碱基的出现次数进行排序，然后计算出SNP 位点的覆盖深度D印th，并根据排序结果求出SNP位点的测序错误率Error ;根据每行的 覆盖深度D印th和测序错误率Error，求出SNP位点的平均覆盖度和测序错误率的较大值 ErrorUp ;根据平均覆盖度或者用户自定的覆盖深度，对SNP位点进行过滤；或根据每个SNP 位点的测序错误率Error是否大于ErrorUp来过滤； R、 计算每个SNP距离：对每一个SNP位点，计算出可能的胎儿游离DNA浓度Cone在四 种SNP组合类型下所有SNP位点到相应胎儿游离DNA浓度的距离TypeDistance ; U、 计算出总距离：找出每一 SNP位点在四种SNP组合类型下对应最小的 TypeDistance，最后求和：AllDistance=sum (TypeDistancei)，i=l…N，N 为 SNP 位点总个 数； V、 选择最优的总距离：在Cone范围内计算出的AllDistance中选出其中最小的，其所 对应的Cone即为实际的胎儿游离DNA浓度。
[0012] 所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，所述步骤0中，筛选出 错配碱基在4个以下，且只比对到一处的序列，作为unique read。
[0013] 所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，所述步骤Q中， ErrorUp= (ErrorMean+ErrorSD氺2)，Errormean (Errori ) i=l". N，N 为 SNP 位点个数。
[0014] 所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，所述步骤U中，四种SNP 组合类型为：类型1 :母亲和胎儿都是纯合SNP ;类型2 :母亲纯合SNP，胎儿杂合SNP ;类型 3 :母亲杂合SNP，胎儿纯合SNP ;类型4 :母亲和胎儿都是杂合SNP。
[0015]所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，所述步骤A中，在1-13、 18及21这15条染色体上共选出1035个SNP位点。
[0016] 所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，Cone的范围为 0. 025-0. 5〇
[0017] 所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，所述步骤R具体包括： 按以下公式计算3即距离018七&]1〇6,018七&11〇6=&匕8(]\^]_〇1'*六 + ]\1；[1101'*13)/(六**2 + B**2)**0? 5，其中A，B是参数，具体如下： Type=l, A=Err/3, B=-(1-Err); Type=2, A=Conc/2*(l-Err) + (l-Conc/2)*Err/3, B= -((l-Conc/2)*(l-Err)+Conc/2*E rr/3)； Type=3, A= (l/2_Conc/2)*(l-Err) + (l/2+Conc/2)*Err/3, B= -((l/2+Conc/2)*(1-Err ) + (l/2-Conc/2)*Err/3)； Type=4, A=l，B=-l，每个SNP位点在四种SNP类型下对应有四个距离值，记作 TypeDistance=Distance*C，C是一个参数，其在四种SNP类型下分别是：2,1，1，2 ;根据计算 得到的四种类型对应的距离判断该SNP位点所对应的类型；其中Typej (j=l，2, 3, 4)表示 四种类型的SNP组合，Major、Minor分别为SNP位点中四种碱基出现次数排第一及第二的 值，Err=mean (Errori) i=l*" 1035 且 Err