羽衣甘蓝红叶基因Re的SSR标记及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及与羽衣甘蓝红叶基因Zfe紧密连锁的简单重复序列(Simple SequenceRepeats，SSR)标记及其获得方法。
【背景技术】
[0002]羽衣甘蓝是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，为二年生草本植物。原产地中海沿岸至小亚西亚一带，现广泛作为观赏植物栽培，主要分布于温带地区。
[0003]我国引种栽培历史不长，但已成为冬春季应用最为广泛的观赏植株。本课题组构建了成熟的羽衣甘蓝小孢子培养技术体系，并创制出了系列DH系。为了加快育种进程，有必要开发出羽衣甘蓝重要观赏性状-红叶性状的分子标记。
[0004]目前，还没有获得羽衣甘蓝红叶基因的分子标记，也就无法应用于分子标记辅助选择育种。鉴于SSR标记具有稳定、廉价、方法简便、重复性好等优点，我们开展了筛选与羽衣甘蓝红叶基因Zfe紧密连锁的SSR标记的研宄工作。
【发明内容】
[0005]本发明的目的:提供与羽衣甘蓝红叶基因Zfe连锁的2个SSR标记；提供由所述SSR标记的PCR引物序列；提供在对羽衣甘蓝红叶基因进行辅助选择的过程中，对上述SSR标记进行应用的方法。
[0006]本发明提供的技术方案如下:
1.位于羽衣甘蓝红叶基因基因Zfe两侧，并与其紧密连锁的SSR标记C9Z90与C9Z94，其特征在于，这两个SSR标记分别具有如下核苷酸序列:
(1)C9Z90
5’ -TAAATCATGTGTTTTAATCTATAAACTGAATAAAAACTTTTAAAATCTCATCTAATTTA AGTCTAATAGAATTGATTTCAAGTTATACAACCAATAACACCTCCTAAAGTGTGAGCTGGCTGAGTTTGATAGATTTCTTAATTTCTCTTATATATATATATATATATATATCTAATAACTTTTTGGAATATTACGCATAATAAAATAACGAAAGAAACTAAAT-3，
(2)C9Z94
5 ’ -GCAATAAGAAGAGAAGCCCCAAAATAAGCATGGTTGGCACTTATCATAAGAATACA AATTCTATTCATGACCCATCGCTATATATCATCACATGTCGCCTCTCTTTTTTCACGGCTAATTTATATTGGGTTTACTATAAGTATGTATATATATATATATATATATATATATATACAACCATGGTCTGAAAGTTTAATATATACTAAATTTTTTGATCCATGCACCAGTGCGGATGTTATTAATT-3’
2.上述SSR标记C9Z90与C9Z94的特异性扩增引物分别具有如下序列:
(1)C9Z90
C9Z90-L: 5’ -TAAATCATGTGTTTTAATCTATAAACTGAA-3’
C9Z90-R: 5’ - ATTTAGTTTCTTTCGTTATTTTATTATGC-3’
(2)C9Z94C9Z94-L: 5’ -GCAATAAGAAGAGAAGCCCCA-3’
C9Z94-R: 5’ -AATTAATAACATCCGCACTGGTG-3’
3.上述SSR标记C9Z90与C9Z94在辅助选择中的应用方法为:
(1)用CTAB法对待测材料进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增
a.反应体系:1uL体系，各组分物质的含量分别为20ng两种羽衣甘蓝DH系的DNA;0.8 M-L 2.5 mM dNTP, 1.0 M-L 10 X Taq PCR buffer 含 Mg2+，0.8 μ L 0.4 MM primers和 0.25 U Taq polymerase.ddH20 补齐 10uL，混勾，离心；
b.扩增程序:预变性95°C /2min，95°C /30s,58°C /30s、72°C /60s，35 个循环后，72°C延伸3min ；
c.电泳:?C9Z90:将1uL扩增产物与5uL的变性Buffer (980ml/L去离子甲酰胺，
3.72g/L乙二胺四乙酸，2.5g/L溴酚蓝，2.5g/L 二甲苯腈)混匀，95°C变性5min，取5uL点入5%变性聚丙烯酰胺凝胶(420.42g/L尿素，47.5g/L丙烯酰胺，2.5g/L甲叉丙烯酰胺，10XTBE 100 ml)电泳中，在2000V，75W条件下电泳lh20min，经银染后观察拍照。②C9Z94:将1uL扩增产物与5uL的变性Buffer (980ml/L去离子甲酰胺，3.72g/L乙二胺四乙酸，2.5g/L溴酚蓝，2.5g/L 二甲苯腈)混勾，95°C变性5min，取5 uL点入5%变性聚丙烯酰胺凝胶(420.42g/L尿素，47.5g/L丙烯酰胺，2.5g/L甲叉丙烯酰胺，10XTBE100 ml)电泳中，在2000V，75W条件下电泳lh20min，经银染后观察拍照。
[0007]其中银染步骤分为:首先放入IL蒸馏水+10ml无水乙醇+5ml冰醋酸中固定7min，然后放入IL蒸馏水+2g硝酸银+2ml甲醛中染色lOmin，用IL蒸馏水漂洗3_4秒，最后转入IL蒸饱水+16g氢氧化钠+2ml甲醛中显影1min。
[0008]本发明的有益效果:
上述SSR标记C9Z90与C9Z94距离羽衣甘蓝红叶基因Zfe的遗传距离分别为0.3cM和2.0cM，可广泛应用于羽衣甘蓝红叶基因Zfe的分子标记辅助选择育种。本发明通过特异引物PCR扩增可对待测植株进行苗期鉴定，提高育种效率。
【附图说明】
[0009]图1:C9Z90在亲本及部分F2代个体上的扩增结果。
[0010]图2:C9Z94在亲本及部分F2代个体上的扩增结果。
[0011]图1、2中符号分别表不为:
Pl:红叶亲本；
P2:白叶亲本；
*:F2代群体中在羽衣甘蓝红叶基因位点和SSR标记间发生交换的单株；
M:D2000 DNA ladder。
【具体实施方式】
[0012]实施例1:与羽衣甘蓝红叶基因Zfe连锁的简单重复序列(SSR)标记的获得一、分离群体的构建
母本欧系列红羽衣甘蓝与名古屋系列白羽衣甘蓝均购自我国的郑州金世纪园艺资材有限公司，以欧系列红羽衣甘蓝经游离小孢子培养获得的红叶羽衣甘蓝DH系作为母本与名古屋系列白羽衣甘蓝经游离小孢子培养获得的白叶羽衣甘蓝DH系作为父本杂交，所获Fl代植株全部表现为红叶。之后Fl自交，构建F2代分离群体。在播种的全部4，284株F2代个体中，3，234株为红叶，I, 050株表现为白叶。叶色基因分离比符合孟德尔遗传定律3: I。
[0013]其中，两亲本的获得是通过游离小孢子培养的方法，从Fl商品种欧系列红和名古屋系列白中获得的。游离小孢子培养的方法及步骤可参见发表于2015年12月植物生理学通讯上的第41卷第六期725-727页的《羽衣甘蓝的小孢子胚诱导和植株再生》。
[0014]二、DNA的提取
a.将0.2 g羽衣甘蓝红叶和白叶材料的幼嫩叶片加入已灭菌的1.5 ml离心管中，液氮速冻同时，研磨棒研磨至粉末；
b.加入700 ul CTAB 裂解液(30g/L CTAB, 10mmoI/L Tris-HCl, 20mmol/L EDTA,1.4mol/LNaCl，)以及14uL β -巯基乙醇，摇勾，放入65 °〇水浴锅中一小时，每隔20分钟反转摇匀一次；
c.冷却10分钟后再加入与CTAB等体积的700ul体积比为24:1的氯仿:异戊醇，充分颠倒3分钟，300下；
d.常温离心(21-240C ),12000 rpm，5 分钟;
e.事先先把无水乙醇放到_20°C冰箱里；
f.移上清液400ulA 1.5ml已灭菌的离心管，加入2倍体积800ul预先在_20°C冰箱里存放的无水乙醇，_20°C静置0.5-1小时或_80°C静置8-10分钟；
g.常温离心，12000rpm，10分钟；
h.弃上清液，在滤纸上吸一下，加入Iml 70%乙醇(700ul无水乙醇+300ul超纯水)；
1.常温离心，12000rpm,I分钟；
j.弃上清，置于50°C培养箱10-20分钟或室温放置至完全晾干； k.加入50ul，I倍TE溶解或用10ul灭菌超纯水溶解；
三、DNA浓度的检测
a.琼脂糖0.2 g，TAE (硼酸缓冲液)2 ml，蒸馏水20 ml，于三角瓶中混匀。b.用封口膜封口，加热20秒，充分溶解。
[0015]c.在溶解后的混合液中加入2 ul lmg/ml的EB。
[0016]d.将混合液放入胶盒中，置于室温凝结。
[0017]e.取2-3 ul Loading Buffer指示剂，与5 ul