人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人类SLC01B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，尤其涉及一种快速 有效地检测少量样本的SLC01B1和ApoE基因多态性的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 他汀类药物（statins)是三羟基三甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，自 从问世以来就成为世界上临床使用最为广泛的降脂药，该类药物对抑制心脑血管疾病也有 显著作用。他汀类药物通过竞争性抑制HMG-CoA(三羟基三甲基戊二酰辅酶A)还原酶从而 减少胆固醇的生物合成，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反 馈性刺激细胞膜表面（主要为肝细胞）低密度脂蛋白受体数量和活性增加、使血清胆固醇 清除增加、水平降低，进而达到降低血脂的作用，是目前防治冠心病、脑中风、高血脂、动脉 粥样硬化的首选用药。
[0003] 有机阴离子转运多肽lBl(OATPlBl)参与多种药物的转运，在他汀类药物代谢中 负责将血液中的药物转移至肝脏中直接发挥药效或代谢转化为有活性的物质，由定位在12 号染色体上的SLC01B1基因编码。研宄表明SLC01B1基因具有遗传多态性，其中388A>G、 521T>C是两种常见的单核苷酸多态性，可以形成4种单倍型SLC01Bl*la(388A-521T)、 SLC01Bl*lb(388G-521T)、SLC01B1*5(388A-521C)和 SLC01B1*15(388G-521C)。突变型 SLC01B1基因引起编码的0ATP1B1转运蛋白活力减弱，表现为肝脏摄取药物能力降低，引起 他汀类药物血药浓度上升，增加横纹肌溶解症或肌病的发生风险。
[0004] 载脂蛋白E(ApoE)通过多种途径参与机体的脂质代谢调节，是影响机体血脂水 平的重要内在因素。ApoE多态性被认为是高脂蛋白血症及动脉粥样硬化性血管病的易 感候选基因。人类ApoE基因定位于19号染色体上，有4个外显子和3个内含子，主要有 两种单核苷酸多态性526C>T和388T>C，可以形成3种单倍型分别是ApoE3 (388T-526C)、 ApoE2 (388T-526T)、ApoE4 (388C-526C)。文献报道，ApoE4携带者患冠心病的风险要高 40 %，并且他汀类药物对Ap〇E4携带者疗效往往不佳或无疗效，而对Ap〇E2携带者的降脂作 用最强。
[0005] 表1 :SLC01B1和ApoE基因多态性
[0006]
【主权项】
1. 一种SLC01B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，HotStart Taq酶，UNG酶，4组特异性引物，4组特异性探针和内标系统，其中，所述4组特异性引物序 列分别为 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3 与 SEQ ID N0:4;SEQ ID N0:5 与 SEQ ID N0:12〇
2. 如权利要求1所述的SLC01B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述4 组特异性探针序列分别为 SEQ ID NO: 13 与 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 与 SEQ ID NO: 16， SEQ ID NO: 17 与 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 与 SEQ ID NO: 20,且所述特异性探针 5' 端 修饰有FAM或VIC，3'端修饰有NFQ-MGB。
3. 如权利要求1或2所述的SLC01B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述 内标系统包含内标引物和内标探针，所述内标引物序列为SEQ ID N0:21和SEQ ID N0:22， 所述内标探针序列为SEQ ID N0:23。
4. 如权利要求3所述的SLC01B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述内 标探针5'端修饰有R0X，3'端修饰有BHQ2。
5. 如权利要求1至4任一项所述的SLC01B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，其特征 在于，所述检测试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液含有7种质粒DNA混 合液，所述7种质粒DNA分别含有4种不同的SLC01B1等位基因和3种不同的ApoE等位基 因，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。
6. -种用于检测SLC01B1和ApoE基因多态性的方法，该方法包括以下步骤： (1) 设计并筛选含有SLC01B1和ApoE的检测探针，ARMS引物，通用引物； (2) 使用从非细胞体系或细胞体系中提取的基因组DNA作为模板DNA ; (3) 进行实时荧光定量PCR扩增：每个样本的SLC01B1基因多态性和ApoE基因多态性 检测分4管进行PCR反应。
7. -种用于检测SLC01B1和ApoE基因多态性的方法，该方法包括以下步骤： (1) 设计并筛选特异性扩增与检测SLC01B1和ApoE基因多态性的引物组合和探针组 合；制备如权利要求1至5任选一项所述试剂盒； (2) 获得待测样品基因组DNA ; (3) 进行荧光定量PCR扩增：每个样本分两个反应管分别检测SLC01B1和ApoE基因的 多态性，每管中加入特异性引物组和探针组、PCR反应缓冲液、Taq酶、UNG酶、内标系统，将 上述获得的基因组DNA先后取相同的量加入所述2个反应管中并同时进行PCR反应。
【专利摘要】本发明提供了一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，dNTP，MgCl2，4组特异性引物，4组特异性探针，内标系统，HotStart Taq酶、UNG酶。本发明用于检测SLCO1B1和ApoE基因多态性的试剂盒具有特异性强、敏感度高、操作简单快速、高通量、安全、结果判读客观等优势。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104846085
【申请号】CN201510219089
【发明人】张喆, 叶婷, 张 浩, 周鹏飞
【申请人】武汉友芝友医疗科技有限公司
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年4月30日