一种优化的细胞培养基、细胞培养方法及其在制备蛋白和抗体中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种细胞培养基、细胞培养工艺 及其在制备蛋白和抗体中的应用。
【背景技术】
[0002] 哺乳动物细胞能够准确完成糖基化、二硫键折叠和磷酸化等一系列翻译后修饰的 过程，以及所表达的蛋白产品在分子结构和生物学特性方面最接近天然蛋白或抗体，因此， 哺乳动物细胞已广泛用于蛋白类药物的表达。大规模哺乳动物细胞培养已成为生物、医学 研宄和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长 因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。
[0003] 无血清培养基由于具有更高的成分限定性、批次差异小、简化分离纯化和下游生 产过程、培养的生理环境易于控制、避免病毒污染以及配方便于优化等优点，被广泛的应用 于哺乳动物细胞的培养以生产制备单克隆抗体和重组蛋白等。然而，商业化无血清培养基 缺乏对表达不同蛋白的细胞株的通用性，应用于细胞培养时需针对细胞株的生长代谢特性 进行配方优化。
[0004] 目前大多数哺乳细胞大规模培养工艺广泛采用批次流加工艺。在批次流加培养过 程中，通过添加浓缩培养液来抑制细胞凋亡、延长细胞培养周期、增加细胞的密度和活性， 从而提高蛋白产物的表达。同时，细胞在培养过程中其代谢产物也在不断的累积，会引起细 胞凋亡的发生，其中铵离子对细胞生长、蛋白产物性质和数量的影响最为显著。
[0005] 谷氨酰胺是细胞生长代谢过程中很重要的氮源物质，在细胞培养基中它是维持细 胞生长必不可少的组分，为细胞的生物合成提供能源。生产蛋白类药物的动物细胞对谷氨 酰胺的利用具有消耗快、代谢率低的特点。铵离子是谷氨酰胺的代谢产物，1分子谷氨酰胺 经过代谢进入三羧酸（TCA)循环要产生2分子的铵离子，铵离子的累积对细胞生长会产生 毒害作用，也对目的蛋白的糖基化等一系列反应产生副作用。
[0006]
[0007]目前，商业化的基础培养基在哺乳动物细胞的大规模培养中，特别是批次流加培 养工艺中，生产培养基中的谷氨酰胺最多能维持细胞生长96小时。为了提供细胞生长所需 要的氮源物质，需要不断的补充谷氨酰胺将其维持在一个合适的浓度范围，同时铵离子的 生成约为0. 2~0. 6mM/106cells/天，大多数细胞对铵离子的耐受浓度约在lOmmol/L左右， 由此易造成铵离子累积超过细胞的耐受浓度。为了避免铵离子对细胞生长和功能以及目的 蛋白的质量产生严重影响，将铵离子浓度控制在细胞耐受范围之内尤为重要。
[0008] 综上，现有技术存在动物细胞培养过程中谷氨酰胺易被耗竭及其代谢副产物铵离 子严重累积这一关键技术难题。
【发明内容】
[0009] 鉴于现有技术存在技术难题，本发明通过大量实验优选在基础培养基中添加谷氨 酸和谷氨酰胺，制备成既能满足动物细胞对氮源物质的需求，又能将铵离子浓度控制在细 胞耐受范围之内的生产培养基，以利于动物细胞的生长、代谢以及降低铵离子对目的蛋白 质量的影响。
[0010] 本发明的第一个目的在于提供了一种优化的细胞培养基。所述的优化的细胞培 养基具有既能满足动物细胞对氮源物质的需求，又能将铵离子浓度控制在细胞耐受范围之 内。
[0011] 本发明的上述有益效果通过以下技术方案实现：
[0012] 本发明提供了一种优化的细胞培养基，所述的细胞培养基是由基础培养基和添加 物组成。
[0013] 所述的添加物为谷氨酸（Glu)和谷氨酰胺（Gln)。
[0014] 具体的，优选所述的添加物谷氨酸的终浓度为2~5mM(Glu添加到培养基后的最 终浓度）。
[0015] 优选所述的添加物谷氨酰胺的终浓度为4mM(Gln添加到培养基后的最终浓度）。
[0016] 具体的，所述的基础培养基，其特征在于所述的基础培养基具有如下特征：
[0017] (1)无血清、无动物源成分；
[0018] (2)用于哺乳动物细胞大规模培养；
[0019] (3)谷氨酸含量低于2mmol/L，不含谷氨酰胺。
[0020] 所述的基础培养基选自下述一种或多种商用培养基：EX-CELL302 CHO Serum-Free Medium、EX-CELL325PF CHO、EX-XELL CD Fusion、SFM4CH0、CDM4CH0、Hycell CHO Medium、CDM4Mab〇
[0021] 优选的，所述的商用培养基是 EX-CELL302 CHO Serum-Free Medium、SFM4CH0 和 CDM4CH0〇
[0022] 本发明通过大量实验发现在基础培养基中同时添加谷氨酰胺和谷氨酸，并控制在 所述浓度下，以满足细胞在生产培养的前期，主要代谢消耗谷氨酰胺的需求，当谷氨酰胺消 耗尽时，细胞会转而利用谷氨酸，这样有力的保证了谷氨酰胺的耗尽对细胞的生长代谢没 有影响，同时又能很好的将铵离子控制在细胞耐受范围内。
[0023] 本发明的第二目在于提供了上述优化的细胞培养基用于哺乳动物细胞培养的方 法。
[0024] 具体的，在37°C，溶氧50%，pH7. 0条件下放大培养，当哺乳动物细胞密度达 到2X106cellS/mL，将哺乳动物细胞接种至7. 5L反应器中，接种的初始细胞密度是 3 X 105cells/ml，并使用上述优化的细胞培养基培养，培养体积为3L，培养14天。在哺乳动 物细胞培养的生产期内，不再补充氮源，如需要，在不同生产时间段分别补充补料培养基， 以维持哺乳动物细胞稳定的生长和生产目的蛋白的能力。
[0025] 所述的哺乳动物细胞为CHO细胞，优选的所述哺乳动物细胞为 DHFR(DihydrofolateReductase，二氢叶酸还原酶）缺陷型 CHO 细胞（简称 CHO-DHFIT)。
[0026] 所述的氮源为谷氨酰胺。
[0027] 所述的补料培养基选自商用补料培养基Feed A(如Gibco公司，货号A10234-01) 和 Feed B (如 Gibco 公司，货号 A10240-01)。
[0028] 本发明的第三个目的在于提供了利用上述培养基和哺乳动物细胞培养方法在制 备重组蛋白和单克隆抗体中的应用。
[0029] 具体的，利用上述哺乳动物细胞培养方法进行细胞生产培养14天，以获得目的蛋 白和抗体的细胞培养液。在生产制备目的蛋白和抗体时，同时检测本发明的多种培养条件， 包括细胞密度、细胞活率、代谢副产物铵离子浓度、表达目的蛋白和抗体的糖基化水平和生 物学活性。
[0030] 所述的重组蛋白药物选自人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白 (rhTNFRII-Fc)。
[0031] 所述的单克隆抗体选自抗⑶20单克隆抗体。
[0032] 由于在基础培养基中添加了谷氨酰胺和谷氨酸，不仅为哺乳动物细胞稳定生长提 供了足够的营养物质，而且有效的控制了代谢副产物铵离子的浓度，维持或提高了利用哺 乳动物细胞生产制备治疗性目的蛋白的糖基化水平和生物学活性。
[0033] 本发明的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
[0034] 1、提供了一种哺乳动物细胞生产培养的优化培养基，由基础培养基和添加物谷氨 酸和谷氨酰胺组成，该培养基具有既能满足哺乳动物细胞对氮源物质的需求，又能将代谢 产物铵离子浓度控制在细胞耐受范围之内。
[0035] 2、提供了一种将优化培养基用于哺乳动物细胞培养的方法，该方法的工艺选择充 分考虑了所要表达的目的蛋白的结构及特性，具有生产工艺更简单、蛋白性质稳定等优点。
[0036] 3、提供了一种优化培养基在生产制备治疗性蛋白药物方面的应用，利用该优化培 养基培养哺乳动物细胞生产制备的治疗性目的蛋白具有更高的糖基化水平和生物学活性。
[0037] 4、通过大量的研宄实验发现，谷氨酸浓度不为2_5mM，或者谷氨酰胺不为4mM，在 维持细胞生长所需氮源、控制代谢副产物铵离子浓度和保证目的蛋白质量等方面均难以达 到本发明优选培养基的效果。
[0038] 5、根据优选的技术方案，在培养基加入所述浓度谷氨酸和谷氨酰胺的情况下，在 培养过程中，无需添加其他氮源和氨基酸，可以达到进一步加入其他氮源和氨基酸的相应 培养效果。
[0039] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
[0040] 术语解释（本发明英文代号对应的中文名称）
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【附图说明】
[0043] 图