专利名称：巨细胞病毒gb抗原的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域。具体而言，本发明提供了引发对巨细胞病毒(CMV)特异性的免疫应答的组合物，诸如例如，疫苗，以及方法。技术背景
人巨细胞病毒(HCMV)是属于疱疹病毒家族的普遍存在的DNA病毒。HCMV由DNA核心、外部衣壳构成，且被包含病毒特异性糖蛋白的脂质膜覆盖。
HCMV在世界的大部分地区是地方性的。然而，原发感染通常导致亚临床疾病，此后病毒变为潜伏，保留在以后任何时间再活化的能力。然而，在两个群体中，HCMV导致严重的医疗状况。HCMV是子宫内感染的新生儿中先天性缺陷的主要原因。这是发达国家中先天性感染的最常见的原因。先天性感染是指在新生儿出生前由母亲传递给胎儿的感染。在先天性感染的新生儿中，5-10%在出生时具有主要临床症状，如小头畸形、颅内钙化和肝炎。许多具有先天性HCMV感染的婴儿在出生时是无症状的。然而，随访研究已经显示，这些婴儿的15%将具有后遗症，如听力损失或中枢神经系统发育异常，尤其导致较差的智力表现。
第二个危险群体是免疫功能低下的患者，如患有HIV感染的那些和经受移植的那些。在这种情况下，病毒变成机会病原体，且引起具有高发病率和死亡率的严重疾病。临床疾病引起各种症状，包括发热、肝炎、肺炎和传染性单核细胞增多症。
为了解决HCMV-相关疾病，开发了候选疫苗，包括活减毒疫苗和亚单位疫苗。具体而言，最近，在II期临床试验中测试了包含缺失其跨膜结构域的修饰的糖蛋白B(gB)与 MF59 乳剂组合的亚单位疫苗(W0 2009/037359, N.Engl.J.Med.2009; 360:1191-9)。
发明概述 在本发明的第一个方面，提供了包含至少一部分gB蛋白细胞外结构域的巨细胞病毒(CMV) gB多肽，所述至少一部分gB蛋白细胞外结构域包含融合环I (FLl)结构域和融合环2 (FL2)结构域，其中FLl和FL2结构域中的至少一个包含至少一个氨基酸缺失或取代。
在第二个方面，提供了 CMV gB多肽，所述CMV gB多肽包含前导序列的氨基酸的至少40%、至少50%、至少70%、至少80%、至少90% 或整个前导序列的缺失。
在第三个方面，提供了具有选自以下所述序列的序列的CMV gB多肽:SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ IDNO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20 和 SEQ ID NO: 21。
在第四个方面，提供了包含CMV gB多肽群体的制剂，其中所述群体的至少50%、至少60%、或至少70%是三聚体形式。
在第五个方面，提供了免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含本发明的CMVgB多肽与合适的药学载体的混合物。
在进一步的方面，提供了编码本发明的CMV gB多肽的多核苷酸。
在又进一步方面，提供了具有选自以下所述序列的序列的多核苷酸:SEQ IDN0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11、SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15和 SEQ ID NO:17。
在又进一步方面，提供了包含本发明的多核苷酸的重组载体。
在又进一步方面，提供了本发明的重组载体转化的宿主细胞。
在又进一步方面，提供了本发明CMV gB多肽在制备用于预防和/或治疗CMV感染的药物中的用途。
在又进一步方面，提供了本发明CMV gB多肽，其用于预防和/或治疗CMV感染。
在又进一步方面，提供了用于诱发针对CMV的免疫应答的方法，所述方法包括将免疫有效量的包含本发明的CMV gB多肽的组合物施用于受试者的步骤。
图1为源自AD169毒株的缺乏跨膜结构域的CMV gB多肽(gB-DeltaTM)以及其中公开的三个示例性CMV gB多肽的图示:(i)其中融合环FLl和FL2都突变的缺失跨膜结构域的CMV gB(gB-SLP12)(参见SEQ ID NO: 3)，(ii)其中融合环FLl和FL2的突变与C末端细胞质结构域中缺失区域(Del2)相组合的缺失跨膜结构域的CMV gB (gB_SLP 12-Del2)(参见SEQ ID N0:4)，所述缺失的区域(Del2)包含富含脯氨酸结构域、保守疏水性模式和高度亲水性带负电荷区域，和(iii)其中融合环FLl的突变与多肽C末端细胞质结构域中缺失上述区域(Del2)相组合的缺失跨膜结构域的CMV gB (gB-SLPl-Del2)(参见SEQ IDNO: 5)。gB-SLP12、gB-SLP12-Del2 和 gB_SLPl_Del2 都包含两个额外点突变，在 50 和 357 位处以丝氨酸(S)取代精氨酸(R)。gB-SLP12-Del2和gB-SLPl-Del2都包含进一步点突变，在778位处以丙氨酸(A)取代半胱氨酸(C)。TM代表跨膜结构域。FLl代表融合环I。FL2代表融合环2。Del2缺失以氨基酸825开始且以氨基酸877结束，即这两个氨基酸分别是缺失区域的第一个氨基酸和最后一个氨基酸。指定编号是指源自AD169毒株且如SEQ IDNO:1所示的CMV gB序列的氨基酸位置。
图2是其中公开的其他示例性CMV gB多肽的图示。所有多肽都包含突变的融合环FLl和FL2。gB-SLP12-Deltall3额外缺失跨膜结构域和细胞质结构域的C末端部分，即氨基酸794至906。gB-SLP12-Delta725额外缺失整个细胞质结构域且保留部分跨膜结构域。LVL759 (或 gB-SLP12-Delta725-LVL759)、LVL776 (或 gB-SLP12-Delta725_LVL776)和 CD33 (或 gB-SLP12-Delta725-CD33)的骨架与 gB_SLP12_Delta725 相同，除 N 端末端以夕卜，其中氨基酸序列如所指示变化。指定编号是指源自AD169毒株且如SEQ ID NO:1所示的CMV gB序列的氨基酸位置。
图3显示对应于构建体gB_SLP12的pMax质粒图谱。
图4显示对应于构建体gB-SLP12_Delta725的pTT5质粒图谱。
图5显示与现有技术的缺失跨膜结构域的CMV gB多肽的表达和分泌水平相比，在CHO细胞中重组表达的三种不同示例性gB多肽的表达和分泌水平。显示的是使用抗gB抗体的Western印迹分析,其表明由用指定gB构建体转染的不同培养物产生的细胞部分(表示gB的未分泌形式)和培养物上清液(表 示gB的分泌形式)中存在的gB蛋白(位于150 kDa和100 kDa之间的印迹上)的水平。泳道MW:分子量梯度，泳道A:用gB-DeltaTM转染的培养物的细胞部分(C-Fr)，泳道B:用gB-SLP12转染的培养物的C_Fr，泳道C:用gB-SLPl-Del2转染的培养物的C_Fr，泳道D:用gB_SLP12_Del2转染的培养物的C_Fr，泳道E:用gB-DeltaTM转染的培养物的培养物上清液(C-Sn)，泳道F:用gB_SLP12转染的培养物的C-Sn，泳道G:用gB-SLPl-Del2转染的培养物的C_Sn，泳道H:用gB-SLP12_Del2转染的培养物的C-Sn。
图6显示与缺失跨膜结构域的现有技术CMV gB多肽的表达和分泌水平相比，在CHO细胞中重组表达的三种不同本发明示例性gB多肽(gB-SLP12、gB-SLP12_Deltall3、和gB-SLP12-Delta725)的表达和分泌水平。显示的是使用抗gB抗体的定量Elisa测定，其显示细胞部分(黑条-代表gB的未分泌形式)和培养物上清液(灰条-代表gB的分泌形式)中存在gB的蛋白的水平。
图7显示在CHO细胞中重组表达的本发明的其他示例性gB多肽的表达和分泌水平。显示的是使用抗gB抗体的三次Western印迹分析,其表明由用指定gB构建体转染的不同培养物产生的细胞部分(C-Fr,表不gB的未分泌形式)和培养物上清液(C-Sn,表不gB的分泌形式)中存在的gB蛋白(位于150 kDa和100 kDa之间的印迹上)的水平。图7八-泳道么、8^、1、1^和N代表总共2600个细胞中存在的蛋白的量。泳道C、D、G、H、K、L、0和P代表总共520个细胞中存在的蛋白的量。泳道MW:分子量梯度，泳道A和C:用gB-DeltaTM转染的培养物的C_Fr，泳道B和D:用gB-DeltaTM转染的培养物的C_Sn，泳道E和G:用gB-SLP12转染的培养物的C-Fr，泳道F和H:用gB_SLP12转染的培养物的C_Sn，泳道 I 和 K:用 gB-SLP12-Delta 725 转染的培养物的 C_Fr，泳道 J和 L:用 gB_SLP12_Delta725转染的培养物的C-Sn，泳道M和O:用gB-Delta725转染的培养物的C-Fr (具有完整融合环)，泳道N和P:用gB-Delta725转染的培养物的C-Sn (具有完整融合环)。图7B -泳道1、2、5、6、1，、2，、5，和6’代表总共2600个细胞中存在的蛋白的量。泳道3、4、7、8、3’、4’、7’和8’代表总共520个细胞中存在的蛋白的量。泳道丽:分子量梯度，泳道I和3:用gB-SLP12-Delta725转染的培养物的C-Fr，泳道2和4:用gB-SLP12_Delta725转染的培养物的C-Sn，泳道5和7:用gB-Delta725转染的培养物的C-Fr (具有完整融合环)，泳道6和8:用gB-Delta725转染的培养物的C-Sn (具有完整融合环)，泳道I’和3’:用gB-SLP12-Deltall3转染的培养物的C_Fr，泳道2’和4’:用gB_SLP12_Deltall3转染的培养物的C-Sn，泳道5’和V:用gB-Deltall3转染的培养物的C-Fr (具有完整融合环)，泳道6’和8，:用gB-S LP12-Deltall3转染的培养物的C-Sn (具有完整融合环)。
图8显示在CHO细胞中重组表达的本发明的其他示例性gB多肽的表达和分泌水平。图8A -显示的是使用抗gB抗体的Western印迹分析,其表明由用指定gB构建体转染的不同培养物产生的细胞部分(C-Fr，表示gB的未分泌形式)和培养物上清液(C-Sn，表示gB的分泌形式)中存在的gB蛋白(位于150 kDa和100 kDa之间的印迹上)的水平。泳道a、b、c、d、1、j、k和I代表总共11700个细胞中存在的蛋白的量，而泳道e、f、g、h、m、n、o和p代表总共5100个细胞中存在的蛋白的量。泳道丽:分子量梯度，泳道a和e:用gB-SLP12-Delta725转染的培养物的C_Sn，泳道i和m:用gB-SLP12_Delta725转染的培养物的C-Fr，泳道b和f:用⑶33转染的培养物的C-Sn，泳道j和η:用⑶33转染的培养物的C-Fr,泳道c和g:用LVL759转染的培养物的C_Sn，泳道k和ο:用LVL759转染的培养物的C-Fr,泳道d和h:用LVL776转染的培养物的C_Sn，泳道I和p:用LVL776转染的培养物的C-Fr。图8B -显示的是使用抗gB抗体的定量Elisa测定，其显示细胞部分(黑条-代表gB的未分泌形式)和培养物上清液(灰条-代表gB的分泌形式)中存在gB的蛋白的水平。
图9显示如戊二醛诱导的交联所分析，多肽gB-DeltaTM、gB_SLP12和gB-SLPl-Del2在CHO细胞中重组表达后的产物概况。显示的是聚丙烯酰胺凝胶的图像。箭头表示不同大小的多聚体。已经使用递增剂量(0、0.5,1%)的戊二醛。泳道MW:分子量梯度，泳道A:gB-DeltaTM - 0%戊二醛，泳道B:gB_DeltaTM - 0.5%戊二醛，泳道C:gB_DeltaTM-1% 戊二醛，泳道 D:gB-SLP12 - 0% 戊二醛，泳道 E:gB-SLP12 - 0.5% 戊二醛，泳道F:gB-SLP12 - 1% 戊二醛，泳道 G:gB-SLPl-Del2 - 0% 戊二醛，泳道 H:gB-SLPl-Del2 -0.5% 戊二醛，和泳道 1: gB-SLPl-Del2 - 1% 戊二醛。
图10显示如分析超离心(AUC)所分析，多肽gB-DeltaTM、gB_SLP12和gB-SLPl-Del2在CHO细胞中重组表达后的产物概况。如所示，峰表示不同大小的多聚体。如所示，还规定每个肽群体中所鉴定的多聚体的百分比。
图11显示如所示且如分析超离心(AUC)所分析,其他示例性CMV gB多肽在CHO细胞中重组表达后的产物概况。如所示，峰表示不同大小的多聚体。如所示，还规定每个肽群体中所鉴定的多聚体的百分比。图1lA -显示在有或没有Pluronic存在的情况下获得的gB-SLP12-Deltall3多肽(如图中的gB-Deltall3所指示)的产物概况。图1lB -显示在有或没有Pluronic存在的情况下获得的gB-SLP12-Delta725多肽(如图中的gB_Delta725所指示)的产物概况。
图12显示通过对在CHO细胞中重组表达和分泌后且在信号序列裂解掉之后生成的所示多肽的N端末端进行MS/MS图谱分析的肽分析。图12A指示信号序列裂解掉之后重组表达的gB-SLP12-Delta725群体内具有不同N端氨基酸的不同多肽的相对丰度。图12B指示信号序列裂解掉之后重组表达的gB-SLP 12-Delta725_LVL759群体内存在的具有不同N端氨基酸的不同多肽的相对丰度。图12C指示信号序列裂解掉之后重组表达的gB-SLP12-Delta725-LVL776群体内存在的具有不同N端氨基酸的不同多肽的相对丰度。图12D指示信号序列裂解掉之后重组表达的gB-SLP12-Delta725-CD33群体内存在的具有不同N端氨基酸的不同多 肽的相对丰度。
图13显示如通过基于UV的大小排阻层析(SEC-UV)所分析的，多肽gB-DeltaTM、gB-S50-DeItaTM和gB_SLP12在CHO细胞中重组表达后的产物概况。峰表示所示大小的多聚体。
图14显示使用抗gB抗体或抗His抗体的Western印迹分析,其显示所示多肽在重组表达、分泌、纯化和去糖基化后的gB蛋白含量。图14A对应于gB-DeltaTM且显示以抗gB抗体探测的Western印迹。图14B对应于gB_SLP12且显示以抗gB抗体(泳道2)和抗gB抗体(泳道3)探测的Western印迹。图14C对应于gB_SLP12_Deltall3且显示以抗His抗体(泳道A)和抗gB抗体(泳道B)探测的Western印迹。图14D对应于gB_SLP12_Delta725且显示以抗His抗体(泳道C)和抗gB抗体(泳道D)探测的Western印迹。
图15呈现免疫原性数据。图15A显示施用为注射而配制的所示多肽后诱导的中和滴度。图15B显示施用为注射而配制的所示多肽后诱导的ELISA抗gB抗体滴度。
图16显示如下文所述的序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 21。
序列表说明SEQ ID NO: 1-来自CMV AD169毒株的全长gB多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2 -来自CMV AD169毒株的gB-DeltaTM多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3 -来自CMV AD169毒株的gB- SLP12多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4 -来自CMV AD169毒株的gB_SLP12_Del2多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5 -来自CMV AD169毒株的gB_SLPl_Del2多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6 -编码来自CMV AD169毒株的gB- SLP12多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7 -编码来自CMV AD169毒株的gB_SLPl_Del2多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8 -编码来自CMV AD169毒株的gB_SLP12_Del2多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 9 -编码来自CMV AD169毒株的gB_SLP12_Delta725多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 10 -来自 CMV AD169 毒株的 gB_SLP12_Delta725 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 11 -编码来自 CMV AD169 毒株的 gB_SLP12_Deltall3 多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 12 -来自 CMV AD169毒株的 gB_SLP12_Deltall3 多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 13 -编码来自 CMV AD169 毒株的 gB-SLP12-Delta725_LVL759 (或LVL759)多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 14 -来自 CMV AD169 毒株的 gB-SLP12-Delta725_LVL759 (LVL759)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 15 -编码来自 CMV AD169 毒株的 gB-SLP12-Delta725_LVL776 (或LVL776)多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 16 -来自 CMV AD169 毒株的 gB-SLP12-Delta725_LVL776 (或LVL776)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 17 -编码来自 CMV AD169 毒株的 gB-SLP12-Delta725_CD33 (或CD33)多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 18 -来自 CMV AD169 毒株的 gB-SLP12-Delta725_CD33 (或 CD33)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 19 -来自 CMV AD169 毒株的成熟形式的 gB-SLP12-Delta725_LVL759(或LVL759)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 20 -来自 CMV AD169 毒株的成熟形式的 gB-SLP12-Delta725_LVL776(或LVL776)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID N0:21 -来自 CMV AD169 毒株的成熟形式的 gB-SLP12-Delta725_CD33(或CD33)多肽的氨基酸序列。
详述 本发明涉及新的CMV gB多肽，其呈现优秀的免疫原性和优异的工艺特征。本发明的gB多肽特别适合作为用于免疫原性组合物如疫苗中包含的抗原。具体而言，本发明的gB多肽显示了改进的同质产品概况。事实上，本发明人观察到，表达后，现有技术的gB多肽，如缺乏跨膜结构域的gB多肽(gB-DeltaTM)，组装成不同大小的多聚体，包括高分子量多聚体，使群体不均匀。他们还观察到，多聚体概况不是一致的，因为给定大小的多聚体的比例从一个实验到另一个实验变化。这种类型的可变性和不一致性在疫苗制剂的方面是不能接受的。因此，仍然需要呈现改进的同质且一致的概况产品的CMV gB多肽。此外，聚集成高分子量多聚体可以对重组多肽的后续的纯化过程具有负面影响，因为聚集尤其可能导致可溶性较差形式的多肽。因此，仍然需要呈现改进的加工特征的CMV gB多肽。
缺乏跨膜结构域的CMV gB多肽描述于EP O 802 979中。
令人惊讶的是，本发明人观察到，在这样的缺乏跨膜结构域的CMV gB多肽的特定区域引入突变导致改进的概况产品，使得该群体不仅比相应的非突变多肽更同质，而且它还显示出从一个实验到另一个实验一致的概况。具体而言，减少高分子量多聚体且三聚体的比例增加了两倍系数。通常，三聚体占本发明的CMV gB多肽群体的至少50%，合适地至少60%，且更合适地至少70 %。与缺乏跨膜结构域的CMV gB多肽相比，这些突变既不影响表达水平,也不影响获得的突变体的分泌水平。这些突变位于已知负责诱导免疫应答的CMVgB抗原表位之外。观察到的从其中多肽组装成高分子量多聚体(如现有技术的缺乏跨膜结构域的多肽)的群体转 变为其中多肽具有改进的三聚体化概况的群体与多肽的更容易且更好纯化相关。具体而言，本发明人观察到，本发明的多肽的纯化产率显著高于用现有技术的缺乏跨膜结构域的CMV gB多肽获得的纯化产率。产率改进是至少2倍，且可能至少3至5倍。此外，还显示本发明的新的多肽的进一步突变导致所述多肽比现有技术多肽更有效地表达和分泌。这种特性代表了在用于疫苗制造(在该领域中抗原生产通常是限制因素)的抗原生产方面的显著优势。
本发明人还观察到，现有技术的gB多肽，如缺乏跨膜结构域的CMV gB多肽，呈现了在多肽的N末端和C末端的异质性。事实上他们观察到，在gB的C末端胞质结构域中进行的剪切在细胞中重组表达和分泌后导致至少两种不同形式的具有不同大小的多肽。对于免疫原性组合物如疫苗中包含的目的，在其主要由一种单一形式构成的意义上说，gB多肽优选具有同质群体。本发明人发现，在缺失C末端胞质结构域的至少一部分时，剪切不再发生且获得的多肽群体主要由一种单一形式的gB构成。
同样地，本发明人观察到，现有技术的gB多肽，如缺乏跨膜结构域的CMV gB多肽，呈现了在多肽的N末端部分的异质性。事实上，本发明人观察到，信号序列，当多肽重组表达和分泌后，被信号肽酶在不同的氨基酸位置裂解，因此产生在N末端具有不同末端的gB成熟多肽的群体，即由在N末端具有不同氨基酸的gB多肽构成的群体。这种现象也被称为信号肽酶“woobling”。对于效力的目的，且尤其对于一致性，在疫苗领域重要的是，待包括在疫苗中的抗原尽可能地同质且尽可能地未降解，使得疫苗批次是可重复且一致的。
应当理解的是，在本发明的意义上，改进的同质产品概况是指本发明的CMV gB多肽的群体，在它们的重组表达后，由至少50%的三聚体构成，例如，如通过分析超离心所测量的(参见实施例2，第1.2部分)。通常，包含本发明的CMV gB多肽群体的制剂由至少50 %，合适地至少60 %，且更合适地至少70 %的三聚体构成。在本说明书中，这种至少50 %的三聚体的概况也将被称为“改进的三聚体化概况”或“富含三聚体的概况”。这些术语被认为是同义的且可互换的。
当提到多肽的C末端部分的“同质/异质性”时，异质群体是指该群体由至少两种具有不同大小的多肽构成，而同质群体应当被理解为主要由给定大小的单一多肽构成的群体。
当提到多肽的N末端部分的“同质/异质性”时，异质群体是指该群体由各自在N末端以不同氨基酸开始的不同成熟多肽构成。相反，根据本发明，同质群体应当被理解为主要由单一成熟多肽构成的群体，该多肽在N末端不变地以相同的给定氨基酸开始。在本发明中，“成熟”多肽是指其中信号序列已经被裂解掉的多肽。通常，在本发明的意义上，在N末端均质群体中，超过30 %，合适地至少80 %，更合适地80 %至90 %，更合适地至少99 %的裂解信号序列后产生的成熟多肽在N末端以相同的氨基酸开始。因此，在一个实施方案中，提供了制剂，其包含裂解信号序列后产生的成熟CMV gB多肽的群体，其中至少30%，至少80 %，80 %至90 %的成熟gB多肽在N末端包含相同的氨基酸。具体而言，本发明的成熟多肽合适地在N末端位置以丝氨酸或组氨酸开始。
gB是具有许多作用的包膜糖蛋白B，作用之一是参与巨细胞病毒与宿主细胞的融合。其由HCMV基因组的UL55基因编码。gB的天然形式的大小依赖于开放读码框(ORF)的大小，其可能根据毒株存在一些变化。例如，AD169毒株的ORF(其长度为2717 bp)编码906个氨基酸的全长gB,而Towne毒株的ORF编码907个氨基酸的全长gB。虽然本发明适用于源自任何CMV毒株的gB蛋白，但是，为了便于理解，当本说明书提及氨基酸位置时，编号是相对于源自AD169毒株的SEQ ID NO:1的gB多肽的氨基酸序列而给出的，除非另有说明。然而，本发明不限于AD169毒株。本领域普通技术人员可以通过使用容易地可获得且众所周知的比对算法(如BLAST)来比对氨基酸序列，从而确定在任何其他CMV毒株的gB多肽的可比较的氨基酸位置。相应地，当提及“其他CMV gB多肽”时，其应当被理解为不同于AD169的任何毒株的CMV gB多肽。AD169 gB的天然形式在蛋白的N末端至C末端方向含有(也参见图1)⑴已知参与多肽胞内运输、包括朝向分泌靶向多肽的氨基酸信号序列，或信号肽，随后为(ii)被称为前导序列的区域，(iii)在SEQ ID NO:1中所示的序列的氨基酸456和460之间含有弗林蛋白酶类型的蛋白内切水解裂解位点的细胞外结构域，(iv)跨膜结构域和(V) C末端胞质结构域。此外，基于与源自不同的疱疹病毒(如HSV)的gB蛋白的序列比对，已经在CMV gB的氨基酸序列中将几段氨基酸序列鉴定为推定的融合环(Backovic等人.2007.J.Virol.81(17): 9596-600)。实验确定了 HSV 融合环(Hannah, B.P.等人.2009.J.Virol.83(13): 6825-6836)。如此称呼所述几段序列是因为它们参与病毒与宿主细胞融合。根据上述文献，通过在CMV gB中的序列比对鉴定了两个推定的融合环，其在本说明书的剩余部分被称为FLl和FL2。所述融合环位于跨膜结构域上游的蛋白的细胞外结构域中。
令人惊讶地，本发明人观察到，通过特异性氨基酸突变破坏具有非功能性跨膜结构域的CMV gB多肽的融合环FLl和FL2产生下列产物，与具有非功能性跨膜结构域、但具有完整的融合环的CMV gB多肽相比，所述产物在表达后呈现改进的三聚体化概况。相应地，在一些实施方案中，本发明的CMV gB多肽包含突变，如例如融合环FLl或FL2中至少一个(可能两者)的氨基酸取代或缺失。合适地，本发明的多肽在融合环FLl中包含至少一个氨基酸取代或缺失。合适地，本发明的多肽在融合环FL2中包含至少一个氨基酸取代或缺失。更合适地，本发明的CMV gB多肽包含融合环FLl和FL2两者的突变并且这样突变的CMV gB多肽形成本发明的目的。例如，本发明的gB多肽在融合环FLl中包含至少一个氨基酸取代或缺失并且在融合环FL2中包含至少一个氨基酸取代或缺失。
在本发 明的意义上，包括CMV AD169 gB的融合环FLl的氨基酸序列，即，FLl的氨基酸序列被定义为SEQ ID NO:1所示的序列的155Y.1.Y157。同样地，在本发明的含义内，包括融合环FL2的氨基酸，即FL2的氨基酸序列，被定义为SEQ ID NO:1所示的序列的24°W.L.Y242 0在来自其他CMV毒株的gB多肽内，例如，通过序列比对，可以鉴定对应的融合环FLl和FL2序列。破坏所述融合环可以包括任何类型对于这些氨基酸三聚体的突变，无论通过缺失或点突变，如氨基酸取代，其产生下列产物，所述产物在重组表达后具有富含三聚体的改进的概况，与非突变形式相比，其是具有更大比例的三聚体形式多肽的产物。关于FLl的非限制性的合适突变是选自SEQ ID N0:1所示序列的155Y.1.Y157氨基酸、或在源自不同毒株的其他CMV gB多肽的对应位置的至少一个、适当地至少两个氨基酸的缺失或被一定氨基酸取代，所述氨基酸是极性氨基酸，具体而言，非芳族极性氨基酸，更具体地，选自带正电荷的氨基酸赖氨酸(K)、组氨酸(H)和精氨酸(R)的氨基酸。相应地，在一些实施方案中，本发明的CMV gB多肽，特别是具有非功能性跨膜结构域的多肽，具有突变的融合环FLl，其中至少异亮氨酸(I156)，合适地至少酪氨酸(Y155)，合适地至少酪氨酸(Y157)，被组氨酸(H)取代，或缺失。可替代地，本发明的CMV gB多肽具有突变的融合环FL1，其中至少酪氨酸(Y157)被精氨酸(R)取代。在一个特定实施方案中，本发明的CMV gB多肽，特别是具有非功能性跨膜结构域的多肽，具有突变的融合环FL1，其中至少异亮氨酸(I156)和酪氨酸(Y157)分别被组氨酸(H156)和精氨酸(R157)取代，或缺失。在一个进一步实施方案中，本发明的具有非功能性跨膜结构域的CMV gB多肽具有突变的融合环FL1，其中至少酪氨酸(Y155)被甘氨酸(G)取代，或者缺失，任选地组合，异亮氨酸(I156)被组氨酸(H)取代或缺失，或者组合，酪氨酸(Y157)被精氨酸(R)取代或缺失，或组合上述两种取代或缺失。在一个特定的实施方案中，本发明的具有非功能性跨膜结构域的CMV gB多肽具有突变的融合环FL1，其中SEQ ID NO:1所示的序列或在源自不同毒株的其他CMV gB多肽的对应位置的三个氨基酸155Y.1.Y157，被氨基酸155G.H.R157取代，或者缺失。FLl结构域的突变可以以另一种方式定义。如下所述，可以使用疏水性指数，如Kyte和Dolittle指数确定特定氨基酸序列的疏水性(Kyte等人.1982.J.Mol.Bi0.157: 105-132)。包括氨基酸155Y.1.Y157的FLl结构域在该指数上实现了 1.9的评分。在一个实施方案中，在本发明的CMV gB多肽中，位于SEQ ID N0:1所示的序列的155-157位、或在其他的CMV gB多肽的对应位置处的一段氨基酸序列Y.1.Y被下列一段三个氨基酸序列取代，所述氨基酸序列如使用Kyte和Doolittle指数所测量的小于-3，特别是小于-7，更特别是小于-8的疏水性评分。所有三个氨基酸可以不被同时取代，只要一段氨基酸序列的总评分达到上述规定值。例如，3个氨基酸长的一段序列中的只有一个或两个氨基酸可以被取代，然后分别基于被取代的氨基酸(即一个或两个)的同一性加上天然的氨基酸(两个或一个)的同一性计算评分。
关于FL2的非限制性的合适突变是选自SEQ ID NO:1所示序列的24°W.L.Y242、或在源自不同毒株的其他CMV gB多肽的对应位置的至少一个、适当地至少两个氨基酸的缺失或被一定氨基酸取代，所述氨基酸是选自赖氨酸(K)、组氨酸(H)和精氨酸(R)的氨基酸的带正电荷的氨基酸，合适地组氨酸⑶。相应地，在一些实施方案中，本发明的CMV gB多肽具有突变的融合环FL2，其中至少酪氨酸(Y242)，合适地至少亮氨酸(L241)，合适地至少色氨酸(W24°)，被组氨酸(H)取代，或缺失，任选地组合，如上所述的突变的融合环FLl。在特定的实施方案中，本发明的CMV gB多肽具有突变的融合环FL2，其中SEQ ID NO:1所示的序列或在源自不同毒株的其他CMV gB多肽的对应位置的三个氨基酸24°W.L.Y242，被氨基酸24°A.F.H242取代，任选地组合，如上所述的突变的FLl突变。
关于FLl和/或FL2融合环的突变不限于上述突变。进一步突变，无论是否除上述的突变以外，可以进行，如，例如，突变SEQ ID NO:1所示序列、或在源自不同毒株的其他CMV gB多肽的对应位置的上述三聚体155Y.1.Y157和24°W.L.Y242周围的氨基酸，只要获得的突变体多肽呈现改进的富含三聚体的概况，且所述进一步突变不干扰当在宿主细胞中重组表达时多肽的生产(表达和分泌)、加工或稳定性。
本发明人还观察到，组合多肽的至少一个融合环(FLl和/或FL2)的突变，如任何上述突变，和多肽的C末端胞质结构域中的额外突变还提供了具有改进三聚体化概况的CMV gB多肽。在本发明的意义上，gB CMV多肽的C末端胞质结构域应当被理解为位于跨膜结构域下游的结构域(还参见图1)。具体而言，在C末端胞质结构域的额外突变合适地涉及疏水性区域的缺失，合适地富含脯氨酸的区域，合适地亲水性高的、带负电荷的区域，可能所有这些区域。作为非限制性实例，合适的突变对应于SEQ ID NO:1所示序列的氨基酸825至877的缺失，其被称为Del2。上述缺失的序列的描述是不严格限于氨基酸位置825至877，且可能发生变化，只要获得的突变体多肽呈现改进的富含三聚体的概况，且在当在宿主细胞中重组表达时的生产、处理或稳定性方面不受影响。相应地，在一些实施方案中，本发明的CMV gB多肽包含至少一个融合环(FLl和/或FL2)、合适地FLl的突变和在C末端胞质结构域中至少一个疏水区、一个富含脯氨酸区和一个高亲水性区的缺失，特别是SEQID NO:1所示序列的氨基酸825至877的缺失(Del2)。
氨基酸序列或其片段的疏水性由组成该序列或其片段的氨基酸的类型决定。通常根据氨基酸的侧链将氨基酸分成不同组。例如，一些侧链被视为非极性的，即疏水性的，而一些其他的被视为极性的。在本发明的意义上，丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)被视为是疏水性氨基酸的部分，而丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)被视为是极性氨基酸的部分。无论氨基酸的疏水性，也基于其侧链共有的共同特性将氨基酸分成亚组。例如，苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸被共同分类成芳族氨基酸，且将被视为本发明的含义内的芳族氨基酸。天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)是酸性或带负电荷的氨基酸的部分，而赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)是碱性或带正电荷的氨基酸的部分，且它们将因此被视为本发明的意义内。可以获得疏水性指数，其采用20个氨基酸中每一个的疏水性和亲水性特性，且将疏水性评分分配到每个氨基酸，因此生成疏水性排序。仅仅作为示例性实例，可以引用如前所述的 Kyte 和 DolUtle 指数(Kyte 等人.1982.J.Mol.Bi0.157: 105-132)。此指数允许计算在一个预定长度的区段内的平均疏水性。相应地，技术人员可以将氨基酸序列中的疏水区鉴定为用于本发明的突变的潜在靶标。然后可以如下所述测试所述区域的突变诱导获得的突变蛋白的改进的产品概况(即有利于群体内的三聚体群体)的能力。疏水性区域的突变可以在于如上所述的区域或其部分的缺失，或在于所述区域内用极性氨基酸取代疏水性氨基酸的点突变。将通过分析在宿主细胞中重组表达后所述突变对突变多肽的产物概况的获得的作用测定突变的相关性，即相关突变将诱导其中至少50%，合适地至少60%，且更适合地至少70%三聚体存在于突变多肽群体中的改进的富含三聚体的概况。本发明人观察到，C端细胞质结构域可以不同程度缺失，同时保持如上文所述的改进的产物概况。因此，本发明考虑CMV gB 多肽，其中合适地10%，更合适地20%，更合适地60%，更合适地80%，更合适地90%的细胞质结构域氨基酸缺失。可能缺失整个细胞质结构域。具体而言，本发明人观察到，当缺失至少70%，合适地至少80%，或更多细胞质结构域时，获得的CMVgB多肽在宿主细胞中重组表达时显示更好的表达和分泌水平。因此，在一些实施方案中，本发明的CMV gB多肽包含至少一个融合环(FLl和/或FL2)，合适地FLl，或可能其两者的突变，和整个细胞质结构域的缺失，例如SEQ ID NO:1中所示序列的氨基酸776至906或其他CMV gB多肽中的相应位置处的氨基酸的缺失。
允许根据大小或密度区分群体内成分(诸如可能彼此聚集的纯化多肽)的任何方法可以用于监测产物概况，且因此用于确定给定突变是否赋予如上文所述的改进的概况产物。合适方法可以基于沉降，诸如分析型超离心(AUC)，或层析，具体而言，大小排阻层析法，诸如基于UV的大小排阻层析法(SEC-UV)。或者，用于评估蛋白或多肽样品内的聚集水平的方法可以在于以交联剂处理样品，从而在两种或多于两种蛋白或多肽之间形成共价键。戊二醛可以合适地用作交联剂。交联后，将样品上样至变性条件下的凝胶(诸如SDS-PAGE)上，且针对蛋白的存在例如以考马斯蓝或硝酸银染色凝胶，将表现聚集体(如果存在)，其根据其分子量进行分离。平行上样由已知分子量的蛋白构成的阶梯将允许测定不同聚集体的分子量。只要已知最小单元(诸如其单体形式的多肽)的分子量，那么所观察的聚集体分子量将提示聚集体内的多聚体化水平。例如，缺失跨膜结构域的CMV AD169 gB多肽的长度为838个氨基酸。如果认为氨基酸的平均分子量为110 kDa，那么该多肽的预期分子量为92 kDa。因此，如果该多肽聚集，那么获得的多聚体的平均分子量预期将是92的倍数。具体而言，如果形成三聚体，那么由3个缺失跨膜结构域的gB分子构成的这种三聚体的预期平均分子量为276 kDa ο
融合环FLl和/或FL2中的任何上述突变可以与其他突变组合。具体而言，本发明的CMV gB多肽应当理解为具有非功能跨膜结构域且包含进一步特定突变，诸如融合环突变。可以通过使用能够从氨基酸序列用公式表示亲水性指数的计算机程序，使用20个氨基酸的疏水性和亲水性特性来预测跨膜结构域在多肽内的位置(Kyte等人.1982.J.Mol.Bi0.157: 105-132)。随着程序移动通过序列，连续计算序列的预定长度区段内的平均亲水性。然后将这些连续亲水性评分从N端至C端绘图，且中点线对应于大多数已知测序蛋白中发现的氨基酸组合物的总亲水性平均值进行印记。膜结合蛋白表现在对应于嵌入膜的脂质双分子层中的序列部分的 线的疏水性侧的大的非中断区域。跨膜结构域负责将多肽锚定至细胞膜。在病毒包膜糖蛋白中，跨膜结构域通常在多肽的C端部分附近含有几段具有20-27个不带电荷的主要疏水性氨基酸。如上文所述关于CMV gB的亲水性分析的应用的实例可以是引用的Spaete等人的公开(Spaete等人，1988, Virology 167: 207-225)。实际上，作者在来自毒株AD169和Towne的CMV gB多肽中鉴定出gB多肽的C端附近的容易显现为两个相邻宽疏水性峰的推定的疏水性跨膜结构域。第一个包含氨基酸715至748且第二个包含氨基酸752至772 (编号对应于来自如SEQ ID NO:1所示的AD169毒株的gB多肽的氨基酸序列)。Reschke等人的公开(Reschke等人，1995，J.0f Gen.Virology76:113-122)另外鉴定作为AD169 CMV gB的推定跨膜结构域的第二段氨基酸751至771。这两个公开因此提出，AD169 CMV gB的推定跨膜结构域包括至少氨基酸751至771，且可能包括氨基酸714至771。在本发明的意义上，CMV gB多肽的跨膜结构域涵盖至少SEQ IDNO:1中所示序列的氨基酸701至775或其他CMV gB多肽中的相应位置处的氨基酸，且因此长度为74个氨基酸。
“非功能跨膜结构域”在本发明含义中应当理解为至少部分推定跨膜结构域进行改变使得能够在宿主细胞中表达后从宿主细胞分泌获得的多肽。在一个实施方案中，本发明的gB多肽缺失整个跨膜结构域。在可替代的实施方案中，本发明的CMV gB多肽保留一部分跨膜结构域。具体而言，CMV gB多肽保留至少5%，合适地至少10%，更合适地至少20%，更合适地至少30%，或至少50%跨膜结构域氨基酸。因此，在一些实施方案中，本发明的CMVgB多肽中缺失至少50%跨膜结构域氨基酸数目，合适地至少70%，更合适地至少80%，更合适地至少90%和甚至95%跨膜结构域氨基酸数目缺失。根据一个特定实施方案，通过缺失SEQ ID NO:1中所示序列的氨基酸701至775或其他CMV gB多肽中的相应位置处的氨基酸使本发明的CMV gB多肽的跨膜结构域变得没有功能。基于测定跨膜结构域在多肽内的位置的上述预测，缺失程度可以进一步变化，只要获得的缺失的CMV gB多肽在宿主细胞中表达后从所述细胞分泌。跨膜结构域的功能改变不限于氨基酸缺失。改变可以在于任何其他类型的氨基酸突变，诸如插入和/或取代。氨基酸的缺失、插入和取代也可以任何方式组合，只要获得的突变CMV gB多肽在宿主细胞中表达后从所述细胞分泌。评估给定突变(诸如例如缺失跨膜结构域的给定部分)对获得的突变多肽从细胞分泌的能力的影响在技术人员的能力范围内。可检测多肽的分泌且通过本领域已知的任何技术评估分泌水平。作为非限制性说明性实例，可能分开测量保留于细胞内的表达多肽的含量，且其在表达后分泌至细胞培养物上清液或细胞培养基中。通常，在表达后收集细胞培养物上清液，随后根据任何常用裂解方法裂解细胞，由此提供两个部分，细胞部分和上清液部分。然后可以通过本领域中已知的任何蛋白检测技术测量各部分中的多肽含量。例如，可以通过Western印迹或ELISA测定检测多肽。
“包含至少一部分胞外结构域”在本发明含义中应当理解为至少部分胞外结构域包含或涵盖融合环FLl和FL2。胞外结构域中在融合环之外的其他氨基酸的数目可以变化。本发明多肽中存在的胞外结构域的适当氨基酸数目或氨基酸百分比应当使得获得的多肽包含抗原表位且呈现改良的三聚体化概况。合适地，至少50%、更合适地至少70%、更合适地至少80%和甚至90%胞 外结构域氨基酸保留于本发明多肽中，所述百分比必需涵盖融合环FLl和FL2。在一个实施方案中，本发明的CMV gB多肽保留整个胞外结构域，所述结构域在两个融合环FLl和FL2之一、可能两者中包含至少一个突变。
保留“至少一部分细胞质结构域”意味着表达和分泌必需的氨基酸数目。合适地，本发明的CMV gB多肽包含至少5%，更合适地至少10%，且可能20%或20%以上细胞质结构域氨基酸。因此，在一些实施方案中，本发明的CMV gB多肽中至少80%，至少90%或至少95%细胞质结构域氨基酸缺失。在进一步实施方案中，本发明的CMV gB多肽缺失整个细胞质结构域。
跨膜结构域的突变(诸如例如缺失其至少部分)可以与细胞质结构域突变(诸如例如缺失其至少部分)组合。任何组合都考虑在本发明中，只要获得的突变CMV gB多肽如上文所述在宿主细胞中表达后从所述细胞分泌且呈现改进的三聚体化概况。因此，在特定实施方案中，本发明的CMV gB多肽缺失整个跨膜结构域和整个细胞质结构域。在可替代的实施方案中，本发明的CMV gB多肽缺失整个跨膜结构域且保留至少部分细胞质结构域，诸如例如其10%。在进一步可替代的实施方案中，本发明的CMV gB多肽缺失整个细胞质结构域且保留至少30%跨膜结构域。
令人惊讶地，本发明人观察到，融合环FLl和/或FL2的突变与缺失至少部分细胞质结构域(可能缺失其全部)和缺失至少部分跨膜结构域(可能缺失其全部)组合，提供与现有技术的多肽相比更有效表达和分泌的多肽。
此外，本发明人观察到，现有技术的CMV多肽的信号序列，当多肽重组表达和分泌后，被信号肽酶在不同的氨基酸位置裂解，因此产生在N末端具有不同末端的gB成熟多肽的群体，即由在N末端具有不同氨基酸的gB多肽构成的群体。令人惊讶地，他们观察到在gB多肽的前导序列中引入突变导致信号序列主要在一个位点处裂解，因此产生在N端具有相同氨基酸的成熟gB多肽的均质群体。因此，在一个实施方案中，提供了制剂，其包含裂解信号序列后产生的成熟CMV gB多肽的群体，其中至少30%，至少80%，80%至90%的成熟gB多肽在N末端包含相同的氨基酸。具体而言，本发明的成熟多肽合适地在N末端位置以丝氨酸或组氨酸开始。本发明的一个目标是提供包含至少40%，合适地至少50%，更合适地至少70%，更合适地至少80%，或甚至至少90%前导序列氨基酸缺失的CMV gB多肽。在一个实施方案中，提供包含整个前导序列缺失的CMB gB多肽。本发明人还观察到，上述前导序列缺失可以与合适地在信号肽的C端部分中的信号序列中出现的突变(诸如至少一个氨基酸取代)组合。或者，所述信号序列可以包含至少一个氨基酸插入，合适地在信号肽的C端部分中。前导序列的缺失程度以及信号序列中的突变类型可以变化，只要获得的gB多肽在重组表达和分泌后，在一个主要位点处通过信号肽酶裂解，由此产生在N端具有相同氨基酸的成熟gB多肽群体。N端氨基酸在多肽群体中的同一性可以通过本领域中已知的任何测序技术进行测定。或者，多肽群体中的不同多肽形式可以进行胰蛋白酶消化，且产生的不同肽可以通过质谱(诸如MS/MS)进行分析。与已知序列的标准肽的比较将允许测定消化肽的氨基酸组成。
本发明人注意到，上述前导序列缺失和/或信号序列突变可以与上述关于融合环FLl和FL结构域的突变和/或至少一部分TM结构域缺失和/或至少一部分细胞质结构域缺失中的任一者组合，同时仍保持各突变类型赋予的特性，诸如相比于现有技术的CMV gB多肽(诸如gB-DeltaTM)，改进的三聚体化概况、更好的表达和分泌、C端剪切不存在和信号序列裂解后N端的均质性。因此，在·一些实施方案中，本发明的CMV gB多肽包含前导序列突变，任选地与其中公开的信号序列突变、任何上文所述的FLl和/或FL2结构域突变、和细胞质结构域与TM结构域中的任何突变组合。
本发明的CMV gB多肽在其不与其在自然界中相同的状态存在的意义上并非“天然存在的”，即其序列已经人工修饰。术语“多肽”或“蛋白质”是指其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸的聚合物。本文使用的术语“多肽”或“蛋白质”意指包括任何氨基酸序列并包括修饰序列(例如糖蛋白)。术语“多肽”具体是指涵盖天然存在的蛋白质以及重组或合成产生的非天然存在蛋白质。提及多肽时，术语“片段”是指多肽的部分(即亚序列)。术语“免疫原性片段”是指保留全长参考蛋白质或多肽的至少一个显性免疫原性表位的所有多肽片段。多肽内的方向一般以N端至C端方向列举，由各个氨基酸的氨基和羧基部分的方向确定。多肽从N端或氨基端向C端或羧基端翻译。
本发明也可能使用上文所述的具有进一步突变的gB多肽，诸如例如使得蛋白内切水解裂解位点变得无效的所述位点处的突变。例如，位于SEQ ID NO:1中所示序列的氨基酸456至460或源自不同毒株的其他CMV gB多肽中的相应位置处的氨基酸周围的弗林蛋白酶裂解位点可以进行突变。合适地，进行至少一个选自下列的氨基酸取代:相对于SEQID NO:1中所示序列，以T456取代R456、以Q458取代R458和以T459取代R459。因此，在某些实施方案中，本发明的CMV gB多肽包含进一步点突变，其中SEQ ID NO:1中所示序列的精氨酸R456、R458和R459或源自不同毒株的其他CMV gB多肽中的相应位置处的氨基酸分别被苏氨酸(T456)、谷氨酸(Q458)和苏氨酸(T459)取代。在一些其他实施方案中，SEQ ID ΝΟ:1中所示序列的位置50和357处的精氨酸被丝氨酸取代。在仍进一步实施方案中，本发明的gB多肽，具体而言，包含C端细胞质结构域中疏水性区域缺失的多肽，包含进一步点突变，其中SEQID NO:1中所示序列的778位处的半胱氨酸被丙氨酸取代。任选地，为了便于表达和回收，本发明的gB多肽可以包括N端的信号肽。信号肽可以选自本领域中已知的多种信号肽，而且通常进行选择以便于在选择用于重组表达本发明的gB多肽的系统中的生成和加工。在某些实施方案中，信号肽是天然存在于来自AD169毒株的天然gB蛋白中的肽，即SEQ ID NO:1中所示序列的氨基酸1-20。可替代地，信号肽可以是序列由不同于gB的蛋白产生的异源序列。适合用于本发明的CMV gB多肽的上下文中的示例性信号肽包括下列的信号肽:组织纤溶酶原激活物(tPA)、单纯疱疹病毒(HSV)gD蛋白、人内皮抑制素、HIV gpl20、CD33、人Her2Neu、或埃巴病毒(EBV) gp350。“信号肽”是一种短的氨基酸序列(例如长度为约18-25个氨基酸)，其将新合成的分泌性蛋白或膜蛋白引导至膜及穿过膜，例如内质网的膜。信号肽常常但不普遍位于多肽的N端，并且常常在蛋白质穿过膜后被信号肽酶裂解掉。该裂解通常被视为蛋白“成熟”过程中的步骤。具体而言，一旦信号肽裂解掉，该蛋白被称为其“成熟”形式。信号序列通常含有三种常见的结构特征:N端极性碱性区(η区)、疏水性核心和亲水性c区。根据一个实施方案，本发明的gB多肽包含天然gB中天然存在的信号肽。在可替代的实施方案中,本发明的gB多肽包含异源信号肽，如蛋白CD33的信号肽。信号序列可以是非天然的且可以包含突变，如氨基酸的取代、插入或缺失。因此在一些实施方案中，其中本发明的gB多肽包含信号肽，特别是天然信号肽，所述信号肽包含至少一个氨基酸取代，合适地在信号肽的C-末端部分中包含至少一个氨基酸取代。可替代地，所述信号肽包含至少一个氨基酸插入，合适地在信号肽的C-末端部分中包含至少一个氨基酸插入。
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任选地，其中公开的本发明的CMV gB多肽可以包括添加构成标记的氨基酸序列，其促进重组表达多肽的随后加工或纯化。这种标记可以是抗原标记或表位标记、酶促标记或聚组氨酸标记。通常，标记位于多肽的一端或另一端，诸如多肽的C端或N端处。因此，在一些实施方案中，本发明的CMV gB多肽包含位于多肽的C端的聚组氨酸标记。在某些实施方案中，本发明的CMV gB多肽具有选自下列的氨基酸序列:SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ IDN0:16和SEQ ID NO: 18或其亚序列(例如，缺乏氨基酸的信号序列或具有不同信号序列的取代的亚序列)。可替代地，在特定实施方案中，本发明的CMV gB多肽具有选自SEQ IDNO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21 的氨基酸序列。本公开的另一个方面涉及编码本发明的CMV gB多肽的核酸。将这样的核酸或载体导入的细胞(即宿主细胞)也是本发明的一部分。宿主细胞可以是细菌细胞，但是更通常是真核细胞，如酵母细胞(例如毕赤酵母(Picchia))、植物细胞、昆虫细胞、或哺乳动物细胞(例如CHO细胞)。根据一个实施方案，本发明的CMV gB多肽在CHO细胞中重组表达。术语“多核苷酸”和“核酸序列”是指核苷酸长度至少为10个碱基的聚合形式。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任一种核苷酸的修饰形式。该术语包括DNA的单链和双链形式。“分离的多核苷酸”是指不与从中得到该多核苷酸的生物的天然存在的基因组中两个与之直接邻接的编码序列(一个位于5'端，一个位于3'端)直接邻接的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸编码多肽。通过参考各个核苷酸单位的连接性定义核酸的5'和3'方向，并根据脱氧核糖(或核糖)糖环的碳位置命名。以5' -3'方向读取多核苷酸序列的信息(编码)内容。“重组”核酸是具有不是天然存在的序列或具有由两个本来分开的序列区段的人工组合构成的序列。可通过化学合成，或者更通常通过人工操作核酸的分离区段，例如通过遗传工程技术，来实现这种人工组合。“重组”蛋白是指由异源性(例如，重组)核酸编码的蛋白质，其已被导入宿主细胞，例如细菌或真核细胞。可以将核酸引入具有能够表达由引入的核酸编码的蛋白的信号的表达载体上，或者可以将核酸整合到宿主细胞染色体中。在某些实施方案中，重组核酸进行密码子优化用于在选定的原核或真核宿主细胞中进行表达，诸如哺乳动物、植物或昆虫细胞。为了促进复制和表达，可将核酸引入原核或真核表达载体等载体中。虽然本文公开的核酸可包含在多种载体(包括例如细菌质粒；噬菌体DNA ;杆状病毒；酵 母质粒；得自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，病毒DNA，例如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒、腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒等等)的任一种中，但是最常见的载体为适于产生多肽表达产物的表达载体。在表达载体中，编码嵌合CMVgB多肽的核酸通常排列在相对于指导mRNA合成的合适转录控制序列(启动子和任选一个或多个增强子)的附近和方向上。即目标多核苷酸序列与合适的转录控制序列可操作地连接。这类启动子的实例包括:CMV的即时早期启动子、LTR或SV40启动子、杆状病毒的多角体蛋白启动子、大肠杆菌Iac或trp启动子、噬菌体T7和λ Pl启动子以及已知在原核或真核细胞或其病毒中控制基因表达的其他启动子。表达载体通常还含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体任选包括用于扩增表达的合适序列。另外，表达载体任选包含一个或多个选择标记基因以提供用于选择转化宿主细胞的表型性状，例如二氢叶酸还原酶、真核细胞培养的新霉素抗性或卡那霉素抗性，或例如大肠杆菌中的四环素或氨苄西林抗性。表达载体还可包括例如改进翻译的效率的其他表达元件。这些信号可包括ATG起始密码子和邻接序列。在某些情况下，例如，将翻译起始密码子和相关序列元件与目标多核苷酸序列一起同时插入合适的表达载体中(例如天然起始密码子)。在这类情况下，不需要其他翻译控制信号。然而，在仅插入多肽编码序列或其部分的情况下，提供包括ATG起始密码子在内的外源翻译控制信号用于表达CMV gB序列。将起始密码子置于正确的读框中以确保目标多核苷酸序列的翻译。外源转录元件和起始密码子可以是各种来源的，既可以是天然的也可以是合成的。如果需要，可通过包含对使用中的细胞系统合适的增强子，来进一步提高表达效率(Scharf 等人(1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62; Bitter等人(1987) Methods in Enzymol 153:516-544)。足以指导本领域普通技术人员产生重组CMV gB核酸的示例性方法可参见Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第 2 版，Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989; Sambrook ^Molecular Cloning: A LaboratoryManual,第 3 片反，Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel 等人，Current Pro toco Isin Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (和 2003 的增刊)；以及 Ausubel 等)\，Short Pro toco Is in Molecular Biology: A Compendium of Methodsfrom Current Pro toco Is in Molecular Biology,第 4 IK, Wiley & Sons, 1999。编码本发明的CMV gB多肽的示例性核酸是由SEQ ID NOs: 6、7、8、9、11、13、15和17表达的。与示例性变体共有序列同一性的其他序列变体可由本领域技术人员产生。核酸变体通常编码不同的多肽，这种不同不多于核苷酸或氨基酸的1%、或2%、或5%、或10%、或15%、或20%。即编码的多肽共有至少80%、或85%、更通常至少约90%或更多(例如95%或甚至98%或99%)的序列同一性。本领域技术人员可立即理解到，编码CMV gB多肽的多核苷酸序列由于遗传密码的丰余性而自身可共有较少的序列同一性。本领域技术人员将理解的是，关于多肽序列和核苷酸序列，CMV gB多肽和多核苷酸序列之间的相似性一般可以在序列之间的相似性、或者被称为序列同一性方面来表示。经常在百分比同一性(或相似性)方面来测量序列同一性；百分比越高，两个序列的一级结构越相似。通常，两个氨基酸(或多核苷酸)序列的一级结构越相似，由折叠和装配产生的更高阶结构越相似。CMV gB多肽和多核苷酸序列的变体可以具有一个或少量的氨基酸缺失、添加或取代，但是尽管如此它们的氨基酸和通常它们的多核苷酸序列将共有非常高的百分比。确定序列同一性的方法是本领域众所周知的。各种程序和比对算法描述如下:Smith和Waterman, Adv.App1.Math.2:482，1981; Needleman和Wunsch, J.Mol.Biol.48:443，1970; Higgins 和 Sharp, Gene 73:237，1988; Higgins 和 Sharp, CABIOS5:151, 1989; Corpet 等人，Nucleic Acids Research 16:10881，1988;和 Pearson 和Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:2444，1988。Altschul 等人，NatureGenet.1994提供了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST) ( Altschul等人，J Mol.BioL 215:403, 1990)可以从几个来源包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda, MD)和因特网上获得，其与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx联系使用。如何使用该程序确定序列同一'I"生的描述可以在因特网上的NCBI网站获得。两个核酸间的序列相似性的另一个标识是杂交的能力。两个核酸的序列越相似，它们杂交的条件越严格。杂交条件的严格性是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下不同。因此，导致特定严格性程度的杂交条件将根据所选择的杂交方法的性质和杂交核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其Na+和/或Mg++浓度)决定杂交的严格性，尽管洗涤次数也影响严格性。一般选择在规定的离子强度和PH下比特定序列的热解链温度(Tm)低约5°C-20°C的严格条件。Tm是50%的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在规定的离子强度和PH下)。核酸杂交的条件和严格性的计算可参见例如Sambrookifo/ecw/ar Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Tijssen, Hybridization WithNucleic Acid Probes, Part 1: Theory and Nucleic Acid Preparation, LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY,NY, 1993.以及 Ausubel 等X Short Pro toco Is in Molecular Biology,第 4 版，JohnWiley & Sons, Inc.，1999。对于本说明书的目的，“严格条件”包括只有杂交分子和靶序列之间的错配小于25%时才可发生杂交的条件。可将“严格条件”分成特定的严格性水平用于更精确的定义。因此，本文使用的“适度严格性(moderate stringency) ”条件是错配超过25%序列的分子将不会杂交的条件；“中等严格性(medium stringency) ”条件是错配超过15%的分子将不会杂交的条件，而“高严格性”条件是错配超过10%的序列将不会杂交的条件。“非常高严格性”条件是错配超过6%的序列将不会杂交的条件。相比之下，在“低严格性”条件下杂交的核酸包括具有少得多的序列同一性或只在核酸短的亚序列内具有序列同一性的核酸。因此，将理解的是，由本公开包括的各种核酸变体能够与SEQ ID N0:6、7、8、9、ll、13、15和17中至少一个在基本上其整个长度进行杂交。可采用用于表达和纯化重组蛋白的已充分完善的方法来产生本文公开的CMV gB多肽。足以指导本领域技术人员的方法可参见,例如，上面引用的Sambrook和Ausubel参考文献。下文提供其他和具体细节。通过多种众所周知的方法中的任一种，将编码CMV gB多肽的重组核酸，如(但不限于)由SEQ ID NOs:6、7、8、9、11、13、15和17所示的示例性的核酸导入宿主细胞，所述方法诸如电穿孔、脂质体介导的转染、磷酸钙沉淀、感染、转染等，这取决于载体和宿主细胞的选择。因此，包含重组CMV gB多肽编码核酸的宿主细胞也是本说明书的特征。有利的宿主细胞包括原核(即细菌)宿主细胞，例如大肠杆菌，以及许多真核宿主细胞，包括真菌(例如酵母，例如酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母iPicchia pastor is))细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞(如CHO细胞)。将重组CMV gB核酸通过例如载体(例如表达载体)导入(例如转导、转化或转染)宿主细胞。如上所述，载体最典型是质粒，但这种载体也可以是，例如，病毒颗粒、噬菌体等。合适表达宿主的实例包括:细菌细胞，例如大肠杆菌、链霉菌属i^treptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌iSedmorwllei typhimurium)；真菌细胞，例如酿酒酵母，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastor is)和粗糙脉胞菌{Neurosporacrassa);昆虫细胞,例如果蚬属WrosophiIa)和草地贪夜蛾{Spodoptera frugiperda)；哺乳动物细胞，例如3T3、C0S、CH0、BHK、HEK 293或鲍斯黑色素瘤(Bowes melanoma);植物细胞，包括藻类细胞等。可将宿主细胞培 养在为激活启动子、选择转化体或扩增插入多核苷酸序列而酌情改良的常规营养培养基中。例如温度、PH等培养条件，通常为之前与选择以进行表达的宿主细胞一起使用的条件，对本领域技术人员而言是显而易见的并存在于本文所引用的参考文献中，包括例如 Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of BasicTechnique,第3版，Wiley-Liss, New York及其中引用的参考文献。与本发明的核酸对应的表达产物还可在非动物细胞中产生，例如植物、酵母、真菌、细菌等。除Samtoook、Berger和Ausubel以外，关于细胞培养的详情可参见Payne等人(1992) Plant Cell andTissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc.New York, NY; Gamborg和 Phillips (主编)(1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; FundamentalMethods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)以及 Atlas 和 Parks (主编)The Handbook of Microbiological Media (1993) CRCPress, Boca Raton, FL。在细菌系统中，可根据所表达产物的预期用途选择多种表达载体。例如，当需要大量的多肽或其片段以产生抗体时，最好使用指导高水平表达易于纯化蛋白的载体。这类载体包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体，例如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中可将目标编码序列(例如上述本发明的多核苷酸)与氨基端翻译起始甲硫氨酸和随后7个产生催化活性的β半乳糖苷酶融合蛋白的半乳糖苷酶的残基的序列符合读框地连接到载体中；ρΙΝ载体(Van Heeke & Schuster (1989) T Biol Chem264:5503-5509) ;pET载体(Novagen, Madison WI),其中氨基端甲硫氨酸与组氨酸标记符合读框地连接；等等。同样，在酵母(例如酿酒酵母)中，可以使用含有组成型或诱导型启动子(例如α因子、醇氧化酶和PGH)的多个载体以产生所需要的表达产物。对于综述，参见Berger, Ausubel,和例如 Grant 等人.(1987; Methods in Enzymology 153:516-544)。在哺乳动物宿主细胞中，可使用多个表达系统，包括基于质粒和病毒两者的系统。任选针对所需方式调节插入序列表达或加工所表达的蛋白质的能力选择宿主细胞。蛋白质的这类修饰包括但不限于糖基化(以及例如乙酰化、羧化、磷酸化、脂化和酰化)。翻译后加工，例如将蛋白的前体形式裂解为成熟形式(例如，由弗林蛋白酶)任选地在宿主细胞的背景中进行。不同的宿主细胞(例如3T3、COS、CH0、HeLa, BHK、MDCK、293、WI38等)具有用于这类翻译后活性的特殊细胞机器和特有机制，可选择以确保导入的外源蛋白的正确修饰和加工。对于本文公开的由核酸编码的重组CMV gB多肽的长期高产率生产，通常使用稳定的表达系统。例如，通过将含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的表达载体导入宿主细胞，而获得稳定表达本发明的CMV gB多肽的细胞系。在导入载体后，使细胞在富集培养基中生长1-2天后，将其转移到选择培养基中。选择标记的目的是赋予选择抗性，并且选择标记的存在允许成功表达导入序列的细胞生长和回收。例如，可采用适于所述细胞类型的组织培养技术，使稳定转化细胞的抗性群或集落增殖。任选将用编码CMV gB多肽的核酸转化的宿主细胞培养在适于表达和从细胞培养物中回收编码蛋白质的条件下。在合适的宿主细胞系转导和宿主细胞生长到适当细胞密度后，通过合适的方法(例如温度变化或化学诱导)诱导选定的启动子，并再将细胞培养一段时间。然后，从培养基中回收和纯化分泌的多肽产物。或者，可通过离心收获细胞，通过物理或化学方法破坏细胞，并保留所得到的粗制提取物用于进一步纯化。用于蛋白质表达的真核或微生物细胞可通过任何合宜的方法破坏，包 括冻融循环、超声处理、机械破坏、或使用可通过本领域众所周知的多种方法中的任一种从重组细胞培养物中回收和纯化细胞CMV gB多肽，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析(例如使用本文所述任何标记系统)、羟磷灰石层析和凝集素层析。在完成成熟蛋白质的构型时，可根据需要使用蛋白质再折叠步骤。最后，在最终的纯化步骤中可采用高效液相层析(HPLC)。除了上述参考文献以外，多种纯化方法是本领域众所周知的，包括例如以下文献提供的方法:Sandana (1997) Bioseparation of Proteins,Academic Press, Inc.;和Bollag等X (1996) Protein Methods,第2版,Wiley-Liss,NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris和 Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRLPress at Oxford, Oxford, U.K.; Scopes (1993) Protein Purification: Principlesand Practice 第 3 版， Springer Verlag, NY; Janson 和 Ryden (1998) ProteinPurification: Principles, High Resolution Methods and Applications,第 2 版,ffiley-VCH, NY;以及Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ。在一个实例中，将编码CMV gB多肽的多核苷酸克隆到适合用于引入哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)的载体中。在该示例性实施方案中，将编码CMV gB多肽的多核苷酸序列引入Amaxa开发的pMax载体中。多肽在组成型启动子立即早期CMV启动子下表达。基于转染的细胞在卡那霉素存在的情况下生长的能力选择稳定转染的表达chimer的细胞。已经成功整合pMax的细胞能够在卡那霉素存在的情况下生长，因为pMax载体表达卡那霉素抗性基因。选择的细胞可以克隆扩增且表征CMV gB多肽的表达。可替代地，可以将编码本发明的CMV gB多肽的多核苷酸序列引入NRC开发的pTT5载体中，所述ρΤΤ5载体表达氨苄青霉素抗性基因。转染和诱导表达(根据选择的启动子和/或增强子或其他调控元件)之后，回收(例如，纯化或富集)表达的多肽。下面是用于纯化CMV gB多肽的示例性程序。为了促进纯化，CMV gB多肽包括C末端的多聚组氨酸标记。简而言之，转染后6天收集细胞培养上清液。澄清后，将上清液上样至镍柱。术语“纯化”是指从组合物中除去不需要存在的组分的过程。纯化是相对术语，并不需要从组合物中除去所有痕量的不需要的组分。在疫苗产生的情况下，纯化包括例如离心、透析、离子交换层析和大小排阻层析、亲和纯化或沉淀等方法。因此，术语“纯化的”不要求绝对纯度；而是意指相对术语。可以纯化基本纯的核酸或蛋白质的制备物，使得所需要的核酸或蛋白质占制备物总核酸含量的至少50%。在某些实施方案中，基本纯的核酸或蛋白质占制备物总核酸或蛋白含量的至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或更多。在本发明的意义上，“分离的”生物组分(如核酸分子，或蛋白)已经基本上远离该组分天然存在的生物体的细胞中的其他生物组分进行分离或纯化，所述其他生物组分如染色体和染色体外的DNA和RNA、蛋白和细胞器。已经“分离”的核酸和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语也包括通过在宿主细胞中重组表达而制备的核酸和蛋白，以及化学合成的核酸和蛋白。本发明的CMV gB多肽和核酸可用于制备用于治疗CMV感染的药物。本发明的CMVgB多肽特别适合作为用于免疫原性组合物如疫苗中包含的抗原。相应地，本发明还包括用于引发针对CMV的免疫应答的方法，其通过将免疫有效量的组合物施用于受试者而实现，所述组合物含有本发明的任何CMV gB多肽。受试者可以是HCMV血清阳性或HCMV血清阴性的受试者。在一些实施方案中，受试者是少女，通常是12至16岁的少女。可替代地，受试者是生育年龄的妇女。通常，生育年龄的妇女的组代表16至45岁之间的年龄且可以怀孕的妇女。在一个特定的实施方案中，本发明考虑了用于引发针对CMV的免疫应答的方法，所述方法包括将免疫有效量的组合物施用于HCMV血清阴性的生育年龄的妇女的步骤，所述组合物包含本发明的gB多肽。在一个可替代的实施方案中，本发明的CMV gB多肽可用于制备用于预防和/或治疗CMV感染的药物。合适地，组合物或药物，引发保护性免疫应答，所述保护性免疫应答降低或防止CMV感染和/或降低或防止CMV感染后的病理应答。具体而言，本发明的方法，其中将免疫有效量的组合物施用于生育年龄的妇女(所述组合物含有本发明的任何CMV gB多肽)，防止C MV从母亲传播到胎儿，即防止CMV先天性感染。术语“防止新生儿中的HCMV先天性感染”意味着新生儿在出生时没有CMV感染。可替代地，接受本发明的免疫原性组合物的合适受试者是免疫功能低下的受试者，如例如，移植的患者。相应地，在一些实施方案中，本发明考虑了本发明的CMV gB多肽用于在免疫功能低下的受试者中降低和/或预防CMV感染的用途。在进一步的实施方案中，本发明考虑了用于引发针对CMV的免疫应答的方法，其包括将本发明的CMV gB多肽施用于免疫功能低下的受试者的步骤。“受试者”是活的多细胞脊椎动物生物体。在本公开的范围内，受试者可以是实验受试者，如非人动物，例如，小鼠、棉鼠、或非人灵长类。可替代地，受试者可以是如上文所述的人受试者。“抗原”指能通过在动物中产生抗体和/或T细胞应答而刺激免疫应答的化合物、组合物或物质，包括注射、吸收或以其他方式导入动物中的组合物。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位。术语“表位”或“抗原决定簇”是指B细胞和/或T细胞对之产生应答的抗原上的位点。“显性抗原表位”是对其产生功能上重要的宿主免疫应答(例如抗体应答或T细胞应答)的表位。因此，对于针对病原体的保护性免疫应答，显性抗原表位是当被宿主免疫系统识别时产生免于由该病原体引起的疾病的保护的抗原部分。术语“T细胞表位”是指当与合适的MHC分子结合时被T细胞(通过T细胞受体)特异性结合的表位。“B细胞表位”是被抗体(或B细胞受体分子)特异性结合的表位。“免疫应答”是免疫系统的细胞(例如B细胞、T细胞或单核细胞)对刺激的应答。免疫应答可以是B细胞应答，其导致特异性抗体(例如抗原特异性中和抗体)的产生。免疫应答也可以是T细胞应答，例如CD4+应答或CD8+应答。在某些情况下，应答对特定抗原有特异性(即“抗原特异性应答”)，特别是，CMV。如果抗原来源于病原体，则抗原特异性应答是“病原体特异性应答”。“保护性免疫应答”是抑制病原体的有害功能或活性、降低病原体的感染或减少因病原体感染产 生的症状(包括死亡)的免疫应答。可通过例如在噬斑减少测定或ELISA中和测定中抑制病毒复制或噬斑形成，或者体内测定抗病原体攻击的抗性，来测定保护性免疫应答。通常，免疫应答弓I发免疫应答，其特征在于产生Thl型细胞因子，例如Thl-型免疫应答。“Thl”型免疫应答的特征在于产生IL-2和IFN-Y的⑶4+ T辅助细胞。相比之下，“Th2”型免疫应答的特征在于产生IL-4、IL-5、和IL-13的CD4+辅助细胞。“免疫有效量”是用于在受试者中引发免疫应答的组合物(通常，免疫原性组合物)的量。通常，所需结果是产生能够或有助于保护受试者免于病原体如CMV的抗原(如病原体)特异性的免疫应答。然而，获得针对病原体的保护性免疫应答可以需要多次施用免疫原性组合物。因此，在本公开的上下文中，术语免疫有效量包括有助于组合以前或随后的施用以实现保护性免疫应答的部分剂量。还提供了免疫原性组合物，如疫苗，其包括CMV gB多肽和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。“免疫原性组合物”是适于施用于人或动物受试者的能够诱导例如引发病原体(例如CMV)的特异性免疫应答的物质的组合物。因此，免疫原性组合物包含一种或多种抗原(例如多肽抗原)或抗原表位，如，例如，本发明的CMV gB多肽。免疫原性组合物还可包含一种或多种能够引发或提高免疫应答的其他组分，例如赋形剂、载体和/或佐剂。在某些情况下，施用免疫原性组合物以引发防止受试者免于由病原体引起的症状或病况的免疫应答。在某些情况下，在受试者暴露于病原体后，通过抑制病原体(例如CMV)的复制来预防(或减轻或改善)由病原体引起的症状或疾病。在本说明书的情况下，术语免疫原性组合物将被理解为包括旨在施用于受试者或受试者群以引发针对CMV的保护性或治标性免疫应答的组合物(即，疫苗组合物或疫苗)。本发明的免疫原性组合物不限于包含CMV gB多肽的组合物。本发明还考虑了免疫原性组合物，如疫苗，其包含本发明的CMV gB多肽和至少一种或多种选自PP65、IEl、pUL131、gL、gH、pUL128、pUL130、或其任何组合的CMV抗原。本发明还考虑了免疫原性组合物，如疫苗，其包含本发明的CMV gB多肽和至少一种或多种选自HPV、衣原体、RSV、刚地弓形虫、带状疱疹和曲霉菌的抗原。多种药学上可接受的稀释剂和载体和/或药学上可接受的赋形剂是本领域已知的，且描述于，例如，E.ff.Martin 的，5.Pharmaceutical Sciences, MackPublishing C0., Easton, PA,第15版(1975)。形容词“药学上可接受的”表明稀释剂、或载体、或赋形剂适合用于施用于受试者(例如，人或动物受试者)。通常，稀释剂、载体和/或赋形剂的性质将取决于所采用的具体施用方式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射的液体，其包括药学上和生理上可接受的液体，如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为媒介物。在某些制剂(例如，固体组合物，如粉末形式)中，不采用液体稀释剂。在这种制剂中，可以使用无毒固体载体，包括，例如，药物级海藻糖、甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。相应地，本领域技术人员可以选择合适的赋形剂和载体以产生适合用于通过选择的施用途径递送给受试者的制剂。赋形剂包括，但不限于:甘油、聚乙二醇(PEG)、玻璃形成多元醇(诸如山梨糖醇、海藻糖)、N-月桂酰肌氨酸(例如钠盐)、L-脯氨酸、非去污剂磺基甜菜碱、盐酸胍、尿素、三甲胺氧化物、KC1、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+(和其他二价阳离子相关盐)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(dithioerytrol)、β-巯基乙醇、去污剂(包括例如 Tween80、Tween20、Triton X-100、NP-40、Empigen BB、辛基葡糖苷、月桂酰麦芽糖苷、两性去污剂3-08、两性去污剂3-10、两性去污剂3-12、两性去污剂3_14、两性去污剂3_16、CHAPS、去氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、和溴化十六烷基三甲铵)。
在某些实例中，免疫原性组合物还包含佐剂。适合于在含有本发明的CMV gB多肽的免疫原性组合物中使用的佐剂是与本文中所公开的所述多肽组合在对受试者施用时是安全且反应原性最小的佐剂。“佐剂”是以非特异性方式增强免疫应答产生的物质。常见佐剂包括抗原吸附在其上的无机物(明矾、氢氧化铝、磷酸铝)的悬浮液；乳剂，包括油包水和水包油乳剂(及其变化，包括双乳剂和可逆乳剂)、脂糖(Iiposaccharide)、脂多糖、免疫刺激性核酸(例如CpG寡核苷酸)、脂质体、Toll样受体激动剂(特别是TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9激动剂)和这类组分的各种组合。与本发明的CMV gB多肽组合使用的合适的佐剂是皂苷。相应地，本发明的免疫原性组合物可以包含皂苷QS21 (W08809336A1; US5057540A)。QS-21在本领域众所周知作为源自Quillaja saponaria Molina的树皮的天然皂苷，其诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)、Thl细胞和主要的IgG2a抗体应答。为了避免疑问，提到QS21包括0PT-821。在本发明的合适形式中，本发明的免疫原性组合物包含基本上纯形式的QS21，也就是说，QS21是至少80 %，至少85%，至少90%纯，例如至少95%纯，或至少98%纯。本发明的组合物可以包含QS21的量为约至约100μδ,例如约至约6(^g之间或10μδ和约5(^g之间，例如，约lOKg、约12.5Pg、约15Pg、约20μ8、约25μ8、约30μ8、约40μ8或者尤其约50μ8。具体而言，QS21存在的量为约40μδ和60μδ之间或45和55 μδ之间或47和53μδ之间或48和52Kg之间或49和51之间或约5(^g。可替代地，QS21存在的量为约2lPg和29 μδ之间或约22Pg和约28Pg之间或约23Pg和约27Pg之间或约24gg和约26Pg之间，或约25 Pg。在一些实施方案中，包含本发明的CMV gB多肽的免疫原性组合物包含QS21的量为约10 Pg，例如约5μ〖至约Ι5μ〖之间，约6μ〖和约Ι4μ〖之间，约7μ〖和约Ι3μ〖之间，约8μ〖和约l2gg之间或约9Pg和约IlPg之间，或约lOPg。在一个进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含QS21的量为约5Pg，例如约IPg至9Pg之间，约2Pg和约8Pg之间，约3Pg和约7Pg之间，约4Pg和约6Pg之间，或约5Pg。本发明的组合物的人用剂量中合适量的QS21为例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或 50 Pg 中的任一种。包含本发明的CMV gB多肽的免疫原性组合物可以包含QS21和甾醇，特别是胆固醇。这种组合物显示当 与其中缺乏留醇的组合物相比的反应原性降低，同时保持佐剂作用。反应原性研究可以根据WO 96/33739中公开的方法进行评价。采用本发明的甾醇意味着可以采用外源性留醇，即对于由其制备β淀粉样蛋白抗原制剂的生物体不是内源的留醇。合适地，外源性留醇与WO 96/33739中描述的皂苷佐剂相关。在特定的实施方案中，胆固醇相对于QS21过量存在，例如，QS21:甾醇的比例将通常是大约1:100至1:1 (w/w)，合适地在1:10至1:1 (w/w)之间,和优选地1:5至1:1 (w/w)。具体而言，QS21:甾醇的比例为至少1:2 (w/w) 0在一个特定的实施方案中，QS21:甾醇的比例为1:5 (w/w) 0合适的甾醇包括β_谷留醇、豆留醇、麦角固醇、麦角钙化醇和胆固醇。在一个特定的实施方案中，本发明的组合物包含胆固醇作为留醇。这些留醇是本领域众所周知的，例如胆固醇作为在动物脂肪中发现的天然存在的甾醇公开于Merck Index，第11版，第341页中。因此，在一个特定实施方案中，包含本发明的CMV gB多肽的免疫原性组合物在其反应原性较低的组合物中包含QS21，其中它被外源留醇例如胆固醇猝灭。存在几个具体形式的反应原性较低的组合物，其中QS21被外源胆固醇猝灭。在一个特定的实施方案中，皂苷/留醇是脂质体结构的形式(W0 96/337391)。因此，例如，本发明的CMV gB多肽可以合适地与包含QS21和胆固醇的组合的佐剂用于免疫原性组合物中。术语“一种或多种脂质体”一般指封装水性内部的单或多层(取决于形成的脂质膜数目，特别是2、3、4、5、6、7、8、9或10层)脂质结构。脂质体和脂质体制剂是本领域众所周知的。能够形成脂质体的脂质包括具有脂肪或脂肪样性质的所有物质。可以构成脂质体中的脂质的脂质可以选自甘油酯、甘油磷脂、甘油膦酰脂(glycerophosphinolipids)、甘油磷酸酯、硫脂、鞘脂、磷脂、异戊二烯、类固醇、硬脂、留醇、archeolipids、合成阳离子脂质和含碳水化合物的脂质。脂质体可适当地包含磷脂。合适的磷脂包括(但不限于):其为磷脂酰胆碱合成中的中间产物的磷酸胆碱(PC);天然磷脂衍生物:蛋磷酸胆碱、蛋磷酸胆碱、大豆磷酸胆碱、氢化大豆磷酸胆碱、作为天然磷脂的鞘磷脂；和合成磷脂衍生物:磷酸胆碱(二癸酰-L-C1-磷脂酰胆碱[DDPC]、二月桂酰磷脂酰胆碱[DLPC]、二肉豆蘧磷脂酰胆碱[DMPC]、二棕榈酰磷脂酰胆碱[DPPC]、二硬脂酰磷脂酰胆碱[DSPC]、二油酰磷脂酰胆碱[D0PC]、1-棕榈酰、2-油酰磷脂酰胆碱[P0PC]、二反油酰磷脂酰胆碱[DEPC])、磷酸甘油(1，2-二肉豆蘧酰-Sn-甘油-3-磷酸甘油[DMPG]、1,2-二棕榈酰-Sn-甘油-3-磷酸甘油[DPPG]、1，2- 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[DSPG]、1_棕榈酰-2-油酰-sn_甘油-3-磷酸甘油[POPG])、磷脂酸(1,2-二肉豆蘧酰-sn-甘油-3-磷脂酸[DMPA]、二棕榈酰磷脂酸[DPPA]、二硬脂酰-磷脂酸[DSPA])、磷酸乙醇胺(1，2-二肉豆蘧酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DMPE]、I, 2- 二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DPPE]、I, 2- 二硬脂酰-sn_甘油-3-磷酸乙醇胺DSPE、I, 2- 二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DOPE])、磷酸丝氨酸、聚乙二醇[PEG]磷脂(mPEG-磷脂、聚甘油-磷脂、官能化的磷脂、末端激活的磷脂)。在一个实施方案中，脂质体包含1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酸乙醇胺。在一个实施方案中，使用高度纯化的磷脂酰胆碱，并且可以选自磷脂酰胆碱(蛋)、氢化磷脂酰胆碱(蛋)、磷脂酰胆碱(大豆)、氢化磷脂酰胆碱(大豆)。在进一步的实施方案中，脂质体包含磷脂酰乙醇胺[POPE]或其衍生物。取决于磷脂组成和用于其制备的方法，脂质体大小可以从30 nm到数Mm变化。在本发明的特定实施方案中，脂质体大小将在50 nm - 500 nm的范围中，并且在进一步实施方案中，50 nm - 200 nm。动态激光散射是本领域技术人员众所周知的用于测量脂质体的大小的方法。本发明的脂质体可以包含二油酰基磷脂酰胆碱[D0PC]和甾醇，特别是胆固醇。因此，在一个特定的实施方案中，包含本发明的CMV gB多肽、如具有非功能性跨膜结构域和至少一个融合环FLl和FL2突变(可能两者都突变)的免疫原性组合物包含本文描述的脂质体形式的任何量的QS21，其中所述脂质体包含二油酰基磷脂酰胆碱[D0PC]和留醇，特别是胆固醇。本发明的免疫原性组合物可以包含一种或多种进一步的免疫刺激剂。在一个实施方案中，如本文所述的包含本发明的CMV gB多肽的免疫原性组合物进一步包含脂多糖，适当地脂质A的无毒衍生物，特别是单磷酰脂质A或更具体而言3-脱酰单磷酰脂质A (3D -MPL)。3D-MPL 在名称 MPL 下由 GlaxoSmithKline Biologicals N.A.销售，并且说明书自始至终称为MPL或3D-MPL。参见例如，美国专利号4，436，727; 4,877,611; 4，866，034和4，912，094。3D-MPL主要促进具有IFN-Y (Thl)表型的CD4+ T细胞应答。3D-MPL可以根据GB2220211 A中公开的方法产生。在化学上，它是具有3、4、5或6条酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。在本发明的组合物中，可以使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有这样的颗粒大小，从而使得它可以通过0.22 μ m滤器无菌过滤。此类制剂在WO 94/21292中描述。本发明的组合物可以包含3D-MPL的量为约IPg至约IOOPg之间，例如约Mg至约6(^g之间或10μδ和约5(^g之间，例如，约軸、约12.5Pg、约馳、约2(^g、约25Pg、约3(^g、约4(^g或者尤其约5(^g。具体而言，3D-MPL存在的量为约40Pg和6(^g之间或45和55 Pg之间或47和53Pg之间或48和52 Pg之间或49和51之间或约5(^g。可替代地，3D-MPL存在的量为2lPg和29 μδ之间或约22Pg和约28Pg之间或约23Pg和约27Pg之间或约24μδ和约26μδ之间，或约25 μδο在另一个实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含在约10μ8，例如5和15Pg之间，合适地6和14μδ之间，例如7和13μδ之间或8和12μδ之间或9和IlPg之间，或10μδ的水平的3D-MPL。在进一步实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含在约5Pg，例如I和9Pg之间，或2和8Pg之间或者合适地3和7Pg之间或4和6Pg之间，或5Pg的水平的3D-MPL。在本发明的 组合物中3D-MPL的合适的量是，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 Pg的任何一种。在其他实施方案中，脂多糖可以是J_l_6)葡糖胺二糖，如描述于美国专利号6，005，099和欧洲专利号O 729 473 BI。基于这些参考文献的教导，本领域技术人员会容易地能够生成各种脂多糖，诸如3D-MPL。在前述免疫刺激剂(其在结构上与LPS或MPL或3D-MPL类似)外，作为上述MPL结构的亚部分的酰化单糖和二糖衍生物也是合适的佐剂。在其他实施方案中，佐剂是脂质A的合成衍生物，其中一些被描述为TLR-4激动剂，并且包括但不限于:
OMl74 (2-脱氧-6-0-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二酰氧基四-癸酰氨基]-4_o-膦酰基-β -D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)_3-羟基十四酰氨基]_α -D-吡喃葡萄糖基磷酸二氢盐)，(W0 95/14026)。OM 294 DP (3S, 9 R) _ 3—[ (R)-十二酰氧基十四酰氨基]_4_氧代_5_氮杂-9 (R)-[(R)-3-羟基十四酰氨基]癸-1，10-二醇，I, 10-双(磷酸二氢盐(或酯))(W099/64301和 WO 00/0462)。OM 197 MP-Ac DP ( 3S-, 9R) -3-[(R)-十二酰氧基十四酰氨基]_4_氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰氨基]癸-1，10-二醇，1-磷酸二氢盐(或酯)10-(6-氨基己酸盐)(W0 01/46127)
也可以在具有CMV gB多肽的组合物中使用不同佐剂如上文所提及的佐剂的组合。例如，如已经指出的，可以将QS21与3D-MPL配制在一起。QS21:3D_MPL的比例通常会是大约1:10至10:1，如1: 5至5: 1，和经常基本上为1:1。典型地，比例在2.5:1至1:13D-MPL:QS21的范围中。因此，在一些实施方案中，包含本发明的CMV gB多肽的免疫原性组合物包含至少QS21和3D-MPL。包含本发明的CMV gB多肽的免疫原性组合物也可以合适地与水包油乳剂配制。水包油乳剂包含可代谢的油(即，可生物降解的油)。油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成油，其对于受体没有毒性，且能够通过代谢转化。坚果、种子、和谷物是植物油的常见来源。合成油也是合适的。相应地，与本发明的CMV gB多肽组合使用的水包油乳剂包含可代谢的油。在一个特定的实施方案中，水包油乳剂包含鲨烯(例如，约4%和6% [v/v]之间)。水包油乳剂可以进一步包含表面活性剂。本发明的水包油乳剂包含一种或多种表面活性剂。合适的表面活性剂是技术人员众所周知的且包括但不限于聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween 80、聚山梨醇酯80)、脱水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)、磷脂酰胆碱(卵磷脂)、聚氧乙烯(12)十六基十八基醚和辛笨聚醇-9 (Triton X-100)。在本发明的一个特定实施方案中，水包油乳剂包含聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween 80、聚山梨醇酯80)。在一个进一步实施方案中，本发明的水包油乳剂包含聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween 80)和进一步表面活性剂,具体而言脱水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)。本发明的水包油乳剂还可以包含母育酚。母育酚是本领域众所周知的并描述于EP0382271。具体而言，母育酚是α-生育酚或其衍生物如α-生育酚琥珀酸酯(也称为维生素E琥珀酸酯)。在本发明的一个特定实施方案中，提供包含本发明的CMV gB多肽的免疫原性组合物与包含S烯(例如约5% [v/v])和α -生育酹(例如约5% [ν/ν])的水包油乳剂的组合。在一个特定实施方案中，水 包油乳剂包含可代谢油(例如鲨烯)、母育酚(例如α-生育酚)和表面活性剂(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯[聚山梨醇酯80])。在本发明的进一步实施方案中，本发明的水包油乳剂包含可代谢油(例如鲨烯)、表面活性剂(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯[聚山梨醇酯80])和任选的第二表面活性剂(例如脱水山梨糖醇三油酸酯[Span 85])。在本发明的进一步实施方案中，本发明的水包油乳剂包含可代谢油(例如鲨烯)、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子性表面活性剂(例如聚氧乙烯(12)十六基十八基醚)和疏水性非离子型表面活性剂(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯[聚山梨醇酯80]或脱水山梨糖醇三油酸酯[Span 85])。在一些实施方案中，包含本发明的CMV gB多肽、如具有非功能性跨膜结构域和融合环FLl和FL2中至少一个突变(可能两者都突变)的免疫原性组合物包含含有鲨烯、α -生育酚和聚山梨醇酯80的水包油乳剂。合适地，水包油包含每剂量疫苗的11 mg或11 mg以下(例如0.5-11 mg、0.5-10mg 或0.5-9 mg 1-10 mg、l_ll mg、2_10 mg>4-8 mg、或4.5-5.5 mg)可代谢油(诸如S烯)，和 5 mg 或 5 mg 以下(例如 0.1-5 mg、0.2-5 mg、0.3-5 mg、0.4-5 mg、0.5-4 mg、1-2 mg或2-3 mg)乳化剂(诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。合适地，母育酚(例如α-生育酹)每人疫苗剂量存在12 mg或12 mg以下,例如0.5-12 mg、10_ll mg、l_ll mg、2_10mg>4-9 mg、或 5-7 mg。术语“疫苗人剂量”意味着适于人使用的体积的剂量。通常在0.25和1.5 ml之间。在一个实施方案中，人剂量是0.5 ml。在进一步实施方案中，人剂量高于0.5 ml，例如
0.6、0.7、0.8、0.9或I ml。在进一步实施方案中，人剂量在I ml和1.5 ml之间。在另一个实施方案中，特别当免疫原性组合物用于儿科群体时，人剂量可以小于0.5 ml如在0.25和0.5 ml之间。免疫原性组合物通常含有免疫保护量(或其分数剂量)的抗原，并且可以通过常规技术来制备。免疫原性组合物(如疫苗，包括用于对人受试者施用的免疫原性组合物)的制备一般描述于 Pharmaceutical Biotechnology,第 61 卷 Vaccine Design-the subunitand adjuvant approach, Powell 和 Newman 编辑，Plenum Press, 1995。New Trends andDevelopments in Vaccin es, Voller 等人编辑，University Park Press, Baltimore,Maryland, U.S.A.1978。例如，Fullerton的美国专利4，235，877描述了封装在脂质体内。例如，Likhite，美国专利4，372，945和Armor等人，美国专利4，474，757公开了蛋白质与大分子的缀合。典型地，每剂免疫原性组合物中的蛋白量选择为在典型的受试者中诱导免疫保护性应答而没有显著的、不利的副作用的量。在此上下文中的免疫保护性的并不必然意味着针对感染的完全保护的；它意味着保护免于症状或疾病，尤其是与病毒有关的严重疾病。抗原量可以采用何种特定的免疫原被而变化。一般而言，预期每个人剂量会包含1-1000 μ g的蛋白质,如约I μ g至约100 μ g,例如约I μ g至约50 μ g,如约I UgJS 2P g、约 5 μ g、约 10 μ g、约 15 μ g、约 20 μ g、约 25 μ g、约 30 μ g、约 40 μ g、或约50 Ug0基于受试者群体(例如婴儿或老年人)来选择免疫原性组合物中利用的量。可以通过牵涉在受试者中观察抗体滴度和其他应答的标准研究来确定特定组合物的最佳量。初始疫苗接种后，受试者可以在约4周中接受加强免疫。除非另有解释，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本说明书所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。分子生物学的常见术语的定义可参见Benjamin Lewin,Genes V, Oxford University Press 出版，1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew 攀yl (主编)，The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd 出版；1994 (ISBN 0-632-02182-9);以及 Robert A.Meyers (主编)，MolecularBiology andBiotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。单数术语“一(a)”、“一(an)”和“该(the) ”包括复数的对象，除非上下文另有明确规定。应当进一步理解的是，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小和所有分子量或分子质量值是近似的，且提供用于说明。术语“多种(个)”是指两种(个)或更多种(个)。还要进一步理解的是，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小和所有分子量或分子质量值是近似的，且提供用于说明。另外，给出的有关物质(例如抗原)的浓度或水平的数值限制意指是近似的。因此，如果指明浓度为至少(例如)200 pg，则是指此浓度应理解为至少近似(或“约”或“、)200 pg。虽然类似于或等同于本文所述方法和材料的方法和材料可用于实施或检验本说明书，但下面描述了合适的方法和材料。术语“包含(comprises)”是指“包括(includes)”。因此，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprises) ”和各种变化如“包含(comprise) ”和“包含(comprising) ”应理解为表示含有规定的化合物或组合物(例如核酸、多肽、抗原)或步骤，或一组化合物或一组步骤，而非排除任何其他的化合物、组合物、步骤或其组。缩写词“e.g.”源于拉丁文exempli gratia,本文用来表示非限制性实例。因此，缩写词“e.g.”是术语“例如”的同义词。在本发明中考虑下列实施方案:
a)巨细胞病毒(CMV) gB多肽，在N末端至C末端方向，其包含:包含融合环I(FLl)结构域和融合环2(FL2)结构域的至少一部分的细胞外结构域，任选地至少一部分跨膜(TM)结构域，和至少一部分细胞质结构域，其中FLl结构域的至少一个氨基酸被取代或缺失，并且其中TM结构域或其部分，如果存在，是非功能性的。b)实施方案 a)的CMV gB多肽，其中通过缺失相对于SEQ ID NO:1中所示的序列的701-775位或在其他CMV gB多肽的对应位置处的氨基酸而使得TM结构域没有功能。c)实施方案a)或b)的CMV gB多肽，进一步包含在融合环FL2结构域中至少一个氨基酸取代或缺失。d)实施方案a)至c)中任一项的CMV gB多肽，进一步包含在多肽的细胞质结构域中至少一个疏水性氨基酸区的缺失。e)实施方案a)至d)中任一项的CMV gB多肽，其中融合环FLl结构域中所述一个氨基酸取代在于位于相对于SEQ ID NO:1中所示序列的155-157位或在其他CMV gB多肽的对应位置处的在Y.1.Y中至少一个氨基酸被非芳族的极性氨基酸的取代。f)实施方案e)的CMV gB多肽，其中取代在于位于相对于SEQ ID NO:1中所示序列的155-157位或在其他CMV gB多肽的对应位置处的在Y.1.Y中至少两个氨基酸被非芳族的极性氨基酸的取代。g)实施方案e)或f)的CMV gB多肽，其中极性氨基酸选自带正电荷的氨基酸赖氨酸(K)、组氨酸(H)和精氨酸(R)。h)实施方案g)的CMV gB多肽，其中位于相对于SEQ ID NO:1中所示的序列的156位或在其他CMV gB多肽的对应位置处的异亮氨酸(I)被组氨酸(H)取代。i)实施方案g)或权利要求h)的CMV gB多肽，其中位于相对于SEQ ID NO:1中所示的序列的157位或在其他CMV gB多肽的对应位置处的酪氨酸(Y)被精氨酸(R)取代。j)实施方案e)至i)中任一项的CMV gB多肽，其中位于相对于SEQ ID NO:1中所示的序列的155位或在其他CMV gB多肽的对应位置处的酪氨酸(Y)被甘氨酸(G)取代。k)实施方案a)至d)中任一项的CMV gB多肽，其中位于相对于SEQ ID NO:1中所示序列的融合环FLl结构域中的155-157位或在其他CMV gB多肽的对应位置处的氨基酸Y.1.Y分别被氨基酸G.H.R取代。I)实施方案a)至d)中任一项的CMV gB多肽，其中位于相对于SEQ ID NO:1中所示序列的融合环FLl结构域中的155-157位或在其他CMV gB多肽的对应位置处的一段氨基酸序列Y.1.Y (所述氨基酸序列Y.1.Y具有通过Kyte和Doolittle指数所测量的+ 1.9的疏水性评分)被下列一段三个氨基酸序列取代，所述氨基酸序列具有通过Kyte和Doolittle指数所测量的小于_3，小于-7，小于-8的疏水性评分。m)实施方案a)至I)中任一项的CMV gB多肽，其中融合环FL2结构域中氨基酸取代在于位于相对于SEQ ID NO:1中所示序列的240-242位或在其他CMV gB多肽的对应位置处的在W.L.Y中至少一个氨基酸被带正电荷的氨基酸的取代，所述带正电荷的氨基酸选自赖氨酸(K)、组氨酸(H)和精氨酸(R)。η)实施方案m)的CMV gB多肽，其中位于相对于SEQ ID N0:1中所示的序列的240-242位或在其他CMV gB多肽的对应位置处的W.L.Y中的氨基酸被组氨酸(H)取代。O)实施方案m)或η)的CMV gB多肽，其中至少位于相对于SEQ ID NO:1中所示序列的242位或在其他CMV gB多肽的对应位置处的酪氨酸(Y)被组氨酸(H)取代。P)实施方案c)至η)中任一项的CMV gB多肽，其中位于相对于SEQ ID NO:1中所示序列的融合环FL2结构域中的240-242位或在其他CMV gB多肽的对应位置处的氨基酸W.L.Y分别被氨基酸A.F.H取代。`q)实施方案d)至P)中任一项的CMV gB多肽，其中相对于SEQ ID NO:1中所示的序列，细胞质结构域中的缺失对应于825至877氨基酸区。r)实施方案a)至q)中任一项的CMV gB多肽，其中所述多肽在蛋白内切水解位点处突变。s)实施方案r)的CMV gB多肽，其中进行至少一个氨基酸取代，所述取代选自下列:相对于SEQ ID NO:1中所示序列或在其他CMV gB多肽的对应位置处，R456被T456取代、R458被Q458取代以及R459被T459取代。t)实施方案s)的CMV gB多肽，其中相对于SEQ ID NO:1中所示的序列或在其他CMV gB多肽的对应位置处的R456、R458和R459分别被T456、Q458和T459取代。u)实施方案a)至t)中任一项的CMV gB多肽，其中相对于SEQ ID NO:1中所示的序列的精氨酸(R357)被丝氨酸(S357)取代。V)实施方案a)至u)中任一项的CMV gB多肽，其中相对于SEQ ID NO:1中所示的序列的精氨酸(r5°)被丝氨酸(s5°)取代。w)实施方案a)至V)中任一项的CMV gB多肽，其中相对于SEQ ID NO:1中所示的序列的半胱氨酸(C778)被丙氨酸(A778)取代。X) SEQ ID NO:3中所示的序列的CMV多肽。y) SEQ ID NO:4中所示的序列的CMV多肽。
Z ) SEQ ID NO: 5中所示的序列的CMV多肽。aa)包含CMV gB多肽的制剂，其中如通过AUC(分析超速离心)测定的，所述多肽的超过50%是三聚体形式。bb)免疫原性组合物，其包含实施方案a)至z)中任一项的CMV gB多肽与合适的药物载体的混合物。cc)实施方案bb)的免疫原性组合物,进一步包含佐剂。dd)多核苷酸，其编码实施方案a)至z)中任一项的CMV gB多肽。ee)重组载体，其包含实施方案dd)的多核苷酸。ff)用实施方案ee)的重组载体转化的宿主细胞。gg)实施方案a)至z)中任一项的CMV gB多肽，其用于预防和/或治疗CMV感染。hh)实施方案a)至z)中任一项的CMV gB多肽在制备用于预防和/或治疗CMV感染的药物中的用途。 ii)用于引发针对CMV的免疫应答的方法，所述方法包括将免疫有效量的组合物施用于受试者的步骤，所述组合物包含实施方案a)至z)中任一项的CMV gB多肽。本发明将通过参考下列非限制性实施例进行进一步描述。实施例1: CMVgB多肽
以下指定的所有gB多肽变体(对于图示参见图1和图2)的源自CMV毒株AD169的gB的氨基酸序列。相应地，当指定突变位置时，氨基酸的编号是相对于SEQ ID NO:1中所述的AD169 CMV gB的序列。此外，除如下所述它们各自含有的特定突变以外，下列构建体(i)所有缺失跨膜结构域(缺失氨基酸701至775)和(ii)所有包含下列点突变:用氨基酸S取代氨基酸R50和R3570尽管下列变体在用于瞬时转染的多肽的C末端包含组氨酸标记，但是所述标记的序列不包括在其中公开的SEQ ID中。1.1 gB~SLP12
gB-SLP12变体包含2个系列的点突变，其分别针对靶向gB的推定的融合环，FLl和FL2。FLl通过用氨基酸155G.H.R157取代氨基酸155Y.1.Y157进行突变，而FL2通过用氨基酸240A.F.H242取代氨基酸24°W.L.Y242进行突变。该构建体编码830氨基酸长的蛋白。gB_SLP12的完整氨基酸序列以SEQ ID NO:3给出。1.1.1 表汰载体 DMax-AD169-gB_SLP12 的构律
gB-SLP12基因序列(SEQ ID NO:6)由GeneArt公司合成。将编码序列进行密码子优化而用于在CHO细胞中表达。分xMj^HindIII M BamHI限制性位点引入5’末端(在起始密码子之前)和3’末端(刚好在终止密码子之后)。密码子优化的基因序列在第一个推定的融合环(用155G.H.R157替换155Y.1.Y157)和第二个推定的融合环(用24°A.F.H242替换240W.L.Y242)中携带突变。使用KpnI和SacI克隆位点接受合成的DNA片段作为2558 bp长的DNA插入物以克隆进pMA载体(GeneArt专有质粒)，生成AD169-gB-SLP12-pMA质粒。用HindIIlMBamHI 限制性处理 AD169-gB_SLP12_pMA 质粒。将含有 gB_SLP12 基因的 2530 bpDNA片段进行凝胶纯化,并且连接到哺乳动物表达载体pMax (Amaxa的pMaxCloning载体的修饰版本)中。pMaxCloning载体骨架已经修饰，以消除Amaxa商业载体的多克隆位点中存在的ATG起始密码子Q(pnl和HindIII之M )。在通过自动DNA测序验证序列后，使用pMax-AD169-gB-SLP12重组质粒以瞬时转染CHO-S细胞。1.2 gB-SLP12~Del2
将包括氨基酸Pro825至Lys 877的一个疏水区缺失引入gB_SLP12变体，产生gB-SLP12-Del2变体。该构建体编码777氨基酸长的蛋白。gB-SLP12_Del2变体的完整氨基酸序列以SEQ ID N0:4给出。编码gB-SLP12-Del2的核苷酸序列以SEQ ID N0:8给出。1.2.1 表汰载体 pMax-AD169-gB-SLP12-Del2 的构律
使用作为模板的 AD169-gB-SLP12-pMA 质粒和引物 SLP-Fw (SEQ ID NO:22)(5’-GAAAGCGGGCAGTGAGCGGAAGGC-3’)和 SLP-Rv (SEQ ID NO:23) (5’-TGTCCTCCACGTACTTCACGCGCTGC-3，)，通过PCR扩增存在于AD169_gB_SLP12编码序列中的包括HindIII和ClaI独特限制性位点的2159 bp DNA片段。使用作为模板的Del2-pMA质粒和引物Del-Fw (SEQID NO:24) ( 5’-CCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCA-3’)和Del-Rv (SEQ ID NO:25) (5，-CCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGC-3’)，也 PCR 扩增 AD169_gB_SLP12Del2 基因的 C 末端部分作为包括CZaJ和fee/限制性位点的745 bp片段。由GeneArt公司构建携带编码gB_SLP12_Del2基因的C末端部分的合成DNA片段的Del2-pMA载体。用适当的酶限制性处理后，将PCR片段克隆到用HindIII和SacI限制性处理的pMax载体中。在通过自动DNA测序验证序列后，使用pMax-AD169-gB-SLP12重组质粒以瞬时转染CHO-S细胞。1.3 gB-SLPl-Del2
将包括氨基酸Pro825至Lys 877的一个疏水区缺失引入gB_SLPl变体，产生gB-SLPl-Del2变体。该变体编码777氨基酸长的蛋白。gB-SLPl_Del2变体的完整氨基酸序列以SEQ ID NO:5给出。
1.3.1 表汰载体 pMax-AD169-gB-SLPl-Del2 的构律
gB-SLPl基因首先由GeneArt合成。密码子优化的基因序列在第一个推定的融合环中携带突变(用155G.H.R157替换155Y.1.Y157)。使用KpnI和SacI克隆位点接受该合成的基因作为2558 bp DNA片段以克隆进pMA载体，生成AD169-gB-SLPl-pMA质粒。从AD169-gB-SLPl-pMA 和载体质粒 Del2_pM 构建表达载体 pMax-AD169-gB-SLPl_Del2。用HindIII和ClaI限制性处理pMA_gB_SLPl载体，且通过凝胶纯化分离编码SLP1-De1-2蛋白的N末端部分的1964 bp DNA片段。用CZa/和5^/消化载体质粒Del2_pMA，且通过凝胶纯化分离编码gB-SLPl-Del2蛋白的C末端部分的420 bp DNA片段。将这两个片段一起连接至用HindIII和SacI限制性处理的pMax表达载体中，生成最终表达载体pMax-AD169-gB-SLPl-Del2。在通过自动DNA测序验证序列后，使用pMax-AD169-gB-SLP1-De12重组质粒以瞬时转染CHO-S细胞。编码gB_SLPl_Del2的核苷酸序列以SEQ ID NO:7显示。1.4 gB-SLP12-Deltall3
在gB-SLP12-Deltall3变体中进行在氨基酸793开始的胞质结构域的C末端部分的缺失，以及跨膜结构域的氨基酸701-775的缺失。该变体编码717氨基酸长的蛋白。gB-SLP12-Deltall3变体的完整氨基酸序列以SEQ ID N0:12给出。1.4.1 载体 pTT5-gB-SLP12-Deltall3 的构律
用于构建pTT5-gB-SLP12-Deltall3表达载体的策略如下。首先，用HindIII和ClaI限制性处理pMax-AD 169-gB-SLP 12载体(参见部分1.1.1)。通过凝胶纯化分离获得的对应于gB-SLP12-Deltall3构建体的N末端部分的1970-bp gB片段。由Geneart合成包括ClaI取BernHI位点(刚好在终止密码子之后)的gB-SLP12_Deltall3构建体的C末端，并且接受作为230-bp长的DNA插入物(命名为new-2)，用于克隆到pMA载体(Geneart专有质粒)。用ClaI和BamHI限制性处理New-2-pMA载体且凝胶纯化230_bp插入物。将两个凝胶纯化的DNA片段一起连接至以前用HindIII和BamHI限制性处理的pMax表达载体中，生成 pMax-AD169-gB-SLP12-Deltall3 质粒。然后使用来自 Stratagene (N0.200513)的“QuickChange多位点定向诱变”试剂盒将AD169-gB-SLP12_Deltall3构建体的50和357位的丝氨酸回复为天然的精氨酸。序列验证后，用限制性酶"ifli////取BamHI消化获得的质粒。凝胶纯化2200-bp gB片段且连接至以前用HindIII和BernHI限制性处理的pTT5载体(NRC，Canada)中，生成最终的pTT5-gB-SLP12_Deltall3表达质粒。该载体用于瞬时转染CHO-S细胞。编码gB-SLP12-Deltall3的核苷酸序列以SEQ ID NO: 11显示。1.5 gB-SLP12-Delta725
在gB-SLP12-Delta725中进行在氨基酸725开始的跨膜结构域部分的缺失，和整个胞质结构域的缺失。该变体编码724氨基酸长的蛋白。gB-SLP12-Delta725变体的完整氨基酸序列以SEQ ID NO: 10给出。1.5.1 表汰载体 pTT5-gB-SLP12-Delta725 的构律
首先，使用来自Stratagene (N0.200513)的“QuickChange多位点定向诱变”试剂盒将gB-SLP12-Del2构建体(参见部分1.2)的50和357位的丝氨酸回复为天然的精氨酸。序列验证后，用限制性酶和ClaI消化获得的质粒，且通过凝胶纯化分离获得的1970-bp gB片段。还生成包括CZaJ和及丽奴限制性位点(SEQ ID NO: 26)且包含下列序列的PCR片段:
47CG^TCCCCTGGAGAACACCGACTTCAGGGTGCTGGAGCTGTACTCCCAGAAGGAACTGAGGT CCAGCAACGTGTTCGACCTGGAGGAAATCATGAGAGAGTTCAACAGCTACAAGCAGCGCGTGAA GTACGTGGAGGACAAGGTGGTGGACCCCCTGC CCCCCTACCT GAAGGGCCTGGACGACCTGA
TGAGCGGACTCGGGGCTGCTGGAAAGGCCTGAGG^reC。将 1970-bp HindII1-ClaI片段和用ClaI和BamHI限制性处理的PCR DNA 一起连接至pTT5载体(NRC, Canada)的HindIII取BamHI克隆位点之间，以生成最终的pTT5-gB-SLP12_Delta725表达载体。在通过自动DNA测序检查序列后，使用PTT5-gB-SLP12-Delta725重组质粒以瞬时转染CHO-S细胞。编码gB-SLPl-Delta72的核苷酸序列以SEQ ID N0:9显示。1.6 gB-SLP12-Delta725-LVL759
该变体编码683氨基酸长的蛋白。gB-SLP12-Delta725-LVL759的完整氨基酸序列以SEQ ID NO: 14 给出。1.6.1 表汰载体 pTT5-AD169-Delta725-LVL759 的构律
使用来自 Stratagene (N0.200522)的 QuickChange II XL 位点定向诱变试剂盒和引物 CANl498 S’-gtgcatctfgtgeel_gatocgaggec#gagecae8gg-T 和CANl499 5-cctgt9gclcacggcctcggalccGaggcacacgatpcac-3'突变 pTTS-gB-SLPU-DeltaTSS-RR-1eaderf 质粒, 产生中间质粒 pTT5_694_13。 使用相同的QuickCha nge II XL位点定向诱变试剂盒和引物 CAN1650 S'- gtgaacciglQcalcgl9tgcc{g§ccclggcx:agccaccgggcc3acgagaca3-3'和CAN1651 5'- ttgtetcg _eccgglggctggeeagig agieacacgaigcaeag_cae-y 突变该中间质粒，产生
最终的表达载体 pTT5-gB-SLP12-725-LVL75。编码 gB-SLP12-Delta725_LVL759 的核苷酸序列以SEQ ID NO: 13显示。1.7 gB-SLP12-Delta725-LVL776
该变体编码683氨基酸长的蛋白。gB-SLP12-Delta725-LVL776变体的完整氨基酸序列以 SEQ ID NO: 16 给出。1.7.1 表汰载体 pTT5-AD169-Delta725-LVL776 的构律
使用相同的QuickChange II XL位点定向诱变试剂盒和引
物 C A N I 6 4 8 S'-cctgtgcatcgtgtgcclgggagccci§gccagccaccgggccaacgagacaatc-3'和 C A N I 6 4 9 S-gattgtctcgttggcccggtggclggccagQgcttJCcaagcacaciatgcacafg-S'突变上述中间质粒PTT5-694-13，产生进一步的中间质粒pTT5_LVL758-1。使用相同的QuickChange II XL位点定向诱变试剂盒和引物C A N I 6 9 7 5'*tggtgtgcgtgaac:clgtgeatc#gclcclgggage :lggc ccggg(xaacgagaMalctao3'
和 C A N I 6 9 8 8.gtaga^lgιctogIl9gcccigtgigccagggclcccaggag€acg^^9C8cagg!^cacgGacacca-3,突变该中间质粒，产生最终的表达载体pTT5-gB-SLP12-Delta725-LVL776。编码gB-SLP12-Delta725-LVL759 的核苷酸序列以 SEQ ID NO: 15 显示。1.8 gB-SLP12-Delta725_CD33
gB-SLP12-Delta725-CD33变体编码677氨基酸序列长的蛋白。该构建体与gB-SLP12-Delta725构建体·几乎相同，除了包括核苷酸I至192的gB基因的N末端部分(成熟gB蛋白的信号序列和前64个氨基酸)被CD33的信号序列所替换(Taylor等人.1999，第274卷，第17期:第11505-11512页)。gB-SLP12Delta725_CD33变体的完整氨基酸序列以SEQ ID NO: 18给出。1.8.1 表汰载体 pTT5-gB-SLP12-Delta725-CD33 的构律
使用作为模板的 pTT5-gB-SLP12-Delta725 质粒和引物 CD33 (SEQ ID NO:27)
(5'- AATCAAAAGCTTACTAGTGCCGCCACCATGGCCCCCCTGCTGCTTCTGCTGCCCCTGCTTTGGG
CAGGGGCCCTGGCXCACCGGGGCAACG.^1》和 CM0578 (SEQ ID NO:28)
(S'- GTAATAGGATCCGGTACCTCATCAGGCCTTTCCAGCAG-3!),通过 PCR 扩增构建gB-SLP12-Delta725-CD33基因。正向引物含有历位点和CD33信号序列。反向引物包含终止密码子和BamHI位点。用适当的酶限制性处理后，将PCR片段克隆到用HindIIIMBglII限制性处理的pEE14载体中。序列验证后，选择pEE14-gB-SLP12-Delta725-CD33重组质粒。最后，如下将gB-SLP12-Delta725-CD33基因亚克隆到pTT5载体中。使用作为模板的 ΡΕΕ14- gB-SLP12-Delta725-CD33 载体和引物 CD33F (SEQ IDNO:29) (5,-AATCAAAAGGTTOC:TAGTGCCGCGMXATGGGCCCCXTGCTG-3’》和 Ecto-Rv (SEQID NO:30)
《S'-GACTTATAGGATCCTCATCAGTGGTGGTGATGATGGTGGCCGCCGGCCTTTCCAGCAGC-S.)
PCR扩增编码序列。正向和反向引物分别含有和克隆位点。用HindII和BernHI限制性处理扩增的DNA和pTT5载体，然后连接。序列验证后，获得的pTT5-gB-SLP12-Delta725-CD33表达载体用于瞬时转染CHO-S细胞。编码gB-SLP12-Delta725-CD33 的核苷酸序列以 SEQ ID NO: 17 显示。实施例2:CMV gB多肽的表达
使用来自Invitrogen的Freestyle MAX CHO表达系统将上述不同的DNA构建体瞬时转染至CHO(中国仓鼠卵巢)细胞中。编码多肽gB-DeltaTM的构建体用作对照。gB_DeltaTM的氨基酸序列以SEQ ID NO: 2给出。用于表达gB-DeltaTM的表达载体是pMax_AD169。Freestyle MAX CHO使用CHO-S细胞系(常用CHO-Kl细胞系适应于悬浮的分开的亚克隆)和作为转染试剂的基于合成的阳离子性脂质的聚合物。使用Qiagen Maxiprep试剂盒(Qiagen, Valencia, CA)根据制备商的方案分离用于转染的质粒DNA。如Invitrogen所推荐地制备转染复合物。简而言之，将37.5 μ g质粒和37.5 μ I FreeStyle MAX转染试剂分别稀释在0.6 ml Opt1-Pro SFM培养基中。之后立即将稀释的FreeStyle MAX转染试剂添加至稀释的DNA溶液。DNA-FreeStyle MAX混合物在室温下孵育10分钟，然后添加至细胞培养物。转染的培养物在37°C培养3天。然后，培养物在29°C维持另外3天期间。在转染后第6天，收集包含悬浮的转染细胞以及细胞培养基的各自I ml的细胞培养物。通过以12，000 g离心将细胞培养上清液与悬浮的细胞分开。收集上清液，且用Iml裂解缓冲液(补充1% Triton X-100的PBS)溶解细胞沉淀。通过在4°C以12，000 g离心5 min而从细胞裂解物中除去不溶性物质。使用MOPS缓冲液将培养物上清液和溶解的细胞级分的等分试样(15 μ )在Criterion XT 4-12% Bis Tris凝胶(Biorad)上运行。将蛋白转移至硝酸纤维素膜且用抗gB抗体MAb 27-156 (Spaete等人，1990)探测膜。可替代地,使用抗gB抗体通过Elisa测定检测表达和分泌水平。在96孔板中进行测定。用多克隆抗gB抗体包被板(通过在兔中注射多肽gB** - EP0759995中所述-而产生抗体)。在37°C下在脱脂奶3%中饱和步骤Ih后，抗体在4°C下孵育过夜。然后洗涤孔4次。在生物素缀合的单克隆抗gB抗体(通过用完整CMV病毒注射小鼠而产生抗体)存在的情况下，将待测试的每份样品(用给定的gB构建体转染的上清液和细胞级分)的10份2倍稀释液的系列添加至包被的板，在37°C持续2h 。用PBS/Tween 20 0.1% 4次洗涤后，添加100 μ 链霉亲和素-辣根过氧化物酶，且在37°C下孵育30 min。用PBS/Tween 20 0.1%将板洗涤4次，且用水洗涤一次。然后，在37°C下在0.1M柠檬酸盐缓冲液pH 5.8 (25%)中用100 μ 四甲基-联苯胺75% (TMB)将板孵育10 min。用100 μ H2SO4 0.4Ν停止该反应，且在分光光度计中在450/620 nm阅读比色度。其浓度已知的以前批次的纯化的gB-DeltaTM用作在该实验中的标准品。使用软件SoftMax Pro，定量待测试的每份样品的浓度。2.1 gB_SLP12、gB-SLPl~Del2 和 gB-SLP12_Del2 的表汰和分泌-Western 印迹分析
图3中显示的是独立进行的三次实验的代表性Western印迹-泳道A、B、C和D分别代表用 gB-DeltaTM、gB_SLP12、gB-SLPl-De12 和 gB_SLP12_Del2 转染的培养物的细胞级分。所述细胞级分中存在的gB的水平表明细胞内的gB水平。泳道E、F、G和H分别代表用 gB-DeltaTM、gB_SLP12、gB-SLPl-De12 和 gB_SLP12_Del2 转染的培养物的上清液。所述上清液中存在的gB的水平表明分泌的gB水平。如果将泳道B、C和D中存在的gB水平与泳道A中存在的gB水平进行比较，注意到，与具有完整融合环的gB-DeltaTM(即，现有技术的多肽)相比，当突变融合环时(即，本发明的多肽)的细胞内gB水平保持不变，提示融合环中的突变不影响分泌。事实上，如果将泳道F、G和H中存在的gB水平与泳道E中存在的gB水平进行比较，观察到，本发明的gB多肽(具有突变的融合环)的表达和它们的分泌至少与现有技术的gB多肽(具有完整融合环的gB-DeltaTM)的表达和分泌一样有效。2.2 gB_SLP12、gB-SLP12_Deltall3 和 gB-SLP12_Delta725 的表达和分泌二Elisa测定
图4中显示了通过Elisa测定获得且以图的形式表示的结果的定量-黑色条分别代表用 gB-DeltaTM、gB_SLP12、gB_SLP12_Deltall3 和 gB_Delta725 转染的培养物的细胞级分，而灰色条代表相同培养物的上清液。相应地，每种表达的变体的灰色条和黑色条的总和代表在CHO细胞中转染后获得的总表达水平。关于gB-DeltaTM，观察到在表达的多肽群体内，约一半的多肽保留在细胞内(灰色条)且约一半的多肽分泌(黑色条)，令人惊讶的是，当表达gB-SLP12时，观察到总表达水平比gB-DeltaTM的显著高约2倍。此外，如果比较分别的胞内形式和分泌形式的水平，观察到，超过80 %的多肽分泌，而仅10-20%保持在细胞内，提示gB-SLP12也比gB-DeltaTM更有效地分泌。该结果表明，融合环的突变对表达和分泌具有积极影响。用多肽gB-SLP12-Deltall3和gB-SLP12_Delta725类似地观察到比gB-DeltaTM更高的表达和分泌水平。然而，令人惊讶的是，那两种多肽甚至比gB_SLP12更显著表达，分别为超过2倍和约1.6倍，这提示至少部分细胞质结构域的缺失与融合环突变的组合进一步改善了多肽的表达和因此获得的分泌多肽的最终产率。2.3 gB-SLP12、gB-SLP12_Deltall3、gB-SLP12_Delta725、gB~SLP12 的表汰和分泌-融合环的作用
Western印迹显示于图5中-图5A显示gB_SLP12的分泌至少与gB_SLP12_Delta725一样地有效，其二者显示了比gB-DeltaTM更高的分泌水平(比较泳道F和J与泳道B)，验证了通过Elisa测定观察到的结果。泳道M和N代表用具有完整融合环FLl和FL2的gB-SLP12-Delta725转染的培养物的细胞级分和上清液。在培养上清液中没有检测到gB的情况(参见泳道N)表明，gB的良好表达/分泌水平需要融合环被突变-在图5中得到了类似的观察结果，其中与用gB-SLP12-Delta725转染的培养物的上清液相比，具有完整融合环FLl和FL2的gB-Delta725转染的 培养物的上清液中没有检测到gB蛋白(分别比较泳道6和2)。对于多肽gB-SLP12-Deltall3类似地观察到对于实现比gB-DeltaTM更好的分泌需要突变融合环FLl和FL2。与用gB-SLP12-Deltall3转染的培养物的上清液相比，具有完整融合环FLl和FL2的gB-SLP12-Deltall3转染的培养物的上清液中几乎检测不到gB(分别比较泳道6’和4’)。2.4 gB-SLP12~Delta7 25.gB - S L P I 2-D e 11 a 7 2 5 - L V L 7 5 9、矛口gB-SLP12-Delta725-LVL776 的表汰和分泌
Western印迹显示于图5C中-用gB_SLP12-Delta725_LVL759转染的培养物的上清液中存在的gB水平至少与用gB-SLP12-Delta725转染的培养物的上清液中存在的gB水平一样好(分别比较泳道f和h与泳道b和d)。用gB-SLP12-Delta725-LVL776转染的培养物的上清液中存在的gB水平仅稍微低于用gB-SLP12-Delta725转染的培养物的上清液中存在的gB水平(分别比较泳道j和I与泳道b和d)。这些结果表明，在本发明的多肽(参见图2)中N末端部分中的突变没有显著影响所述多肽的分泌水平。实施例3:CMV gB多肽的产物概况如实施例2中描述，在CHO细胞中瞬时表达gB-DeItaTM,gB-SLP12和gB_SLP1-De12，且在转染后第6天收集培养上清液。澄清后，用350 mM NaCl和0.4% Empigen补充上清液，然后0.22 Mm过滤。镍柱用于从细胞对应的培养物上清液纯化转染和分泌的多肽。用包含10 mM TRIS-HCl, 350 mM NaCl, 10 禮咪唑和0.4% Empigen pH 8.0 的缓冲液平衡 XK 16柱(Qiagen)。以4 ml/min的流速将以前澄清、补充且过滤的细胞培养上清液上样，且用平衡缓冲液洗涤保留的蛋白。用包含10 mM TRIS HCl, 350 mM NaCl, 350 mM咪唑和0.4%Empigen pH 8.0的缓冲液以4 ml/min的流速进行洗脱。然后以2 ml/min的流速在用包含10 mM磷酸盐(K)缓冲液和0.4% Empigen pH 7.2的缓冲液平衡的XK 26柱(GE)中注射洗脱的级分。收获第一蛋白峰，用于进一步分析。然后将对应于该峰的洗脱级分上样至用包含10 mM磷酸盐(K)和0.4% Empigen pH 7.2的缓冲液平衡的cellufine硫酸盐柱(ChissoCorporation)上。用包含 5 mM 磷酸盐(K), IM NaCl 和 0.1% Pluronic F68 pH 7.2 的缓冲液以3 ml/min的流速进行洗脱。然后从上述纯化过程产生的纯化多肽进行下列实验。3.1戊二醛交联实验
将戊二醛直接添加至15 μ 每种纯化的多肽(对应于约7 Pg总蛋白)，以便获得0.5%和1%的最终戊二醛浓度。作为对照，留下没有戊二醛的每种纯化多肽的样品。将混合物孵育150 min,且然后通过添加NaBH4 (Aldrich)而停止戊二醒反应,且样品在冰上孵育20min。使用MOPS缓冲液将样品在Criterion XT 4-12% Bis Tris凝胶(Biorad)上运行。凝胶用考马斯蓝R-250染色，且显示于图9中。结果
如果多肽的多聚体在用戊二醛处 理之前存在于样品中，那么任何给定大小的多聚体，无论是二聚体、三聚体、或任何其他高分子量的多聚体，进行交联，且因此，当在变性条件下在凝胶上迁移时，保持相同。相应地，所述多聚体根据其分子量进行迁移。相反，对于没有用戊二醛处理的对照样品，所述样品中存在的任何多聚体当在变性条件中在凝胶上迁移时被变性为单体，使得对照样品中的多肽根据等同于多肽的单体的分子量进行迁移(参见泳道A、D和G中稍低于150 kDa的单一条带)。如果考虑gB-DeltaTM的多聚体概况(泳道A、B和C)，观察到用戊二醛处理的样品中非常高分子量的2条条带(由箭头指出)。还注意到，这两条条带具有相同强度，这提示gB-DeltaTM样品主要包含两种类型的多聚体且样品内的每种多聚体的比例应该是大致相同的。相反，当考虑gB-SLP12的概况时，尤其在泳道E和F中，其中用戊二醛处理样品，同时也观察到两条高分子量条带，每条条带的强度显著不同。事实上，较低分子量条带的强度至少比最高的条带强3-5倍，这表明在gB-SLP12样品内的较低分子量多聚体群体远大于较高分子量多聚体的群体。当考虑gB-SLPl-Del2样品(泳道G、H和I)时得到了类似的观察结果，其中较低条带的强度比较高条带的强度强约2-3倍。这表明，gB-SLP12和gB-SLPl-Del2具有较低分子量多聚体的比例富集的类似多聚体概况，这不同于现有技术的多肽gB-DeltaTM。应当注意的是，该实验中使用的凝胶没有提供好到足以确定条带中观察到的关于gB-DeltaTM的较低分子量条带与条带中观察到的关于gB-SLP12和gB-SLPl-Del2的条带大小是否相同的分辨率。出于同样的原因，不可能精确地确定每条条带的实际大小，使得从该实验中鉴定观察的多聚体是二聚体或三聚体等...是困难的。为了获得该信息，用纯化多肽进行下列两个实验。3.2 分析轺谏离心-gB-DeltaTM、gB_SLP12、gB-SLPl_Del2使用分析超速离心(AUC)通过测量分子对离心力响应的移动速率来确定纯化的多肽样品内不同种类(例如，聚集的纯化多肽的不同大小的多聚体)的溶液总共的同质性和大小分布。这是基于通过沉降速率实验获得的不同种类的沉降系数的计算，其取决于它们的分子形状和质量。纯化后，在AN-60Ti转子已经平衡至15°C之后，在IOmM磷酸钠，IMNaCl 和 0.1% Pluronic, pH 7.2 中重悬浮的 gB-DeltaTM, gB-SLP 12 和 gB-SLP 1-De 12 在Beckman-Coulter ProteomeLab XL-1分析超速离心机中以28 000 rpm离心。为了收集数据，每隔5 min在280nm和230nm记录160次扫描。使用程序SEDFIT进行数据分析，用于测定C(S)分布。用SEDNTERP软件从它们的氨基酸序列和它们的预期聚糖组合物的组合进行蛋白的微分比容的测定。SEDNTERP还用来通过忽略Pluronic F68的贡献(这没有表示在该软件的数据库中)确定缓冲液的粘度和密度。结果以图的形式提供，其代表针对分子量绘制的每个种类的浓度。已经通过考虑总分布的曲线下的总面积作为100%的样品且通过计算每个种类的贡献代表的该总面积的百分比来进行所有种类的相对丰度的测定。
图10相继显示了通过分析超速离心分析的纯化的gB-DeltaTM、gB-SLP 12和gB-SLP 1-De 12的概况。对应于gB-DeltaTM样品的图表明通过多个峰代表的不均匀分布。具体而言，在所述样品中观察到的主要群体是417 kDa (35%)和723 kDa (30%)种类，其可能分别代表三聚体和六聚体。更高分子量多聚体也存在于所述样品中。相比之下，当融合环FLl和FL2突变时，对应的纯化的gB-SLP12多肽的概况表明更均匀的群体，因为主要群体是327 kDa (63%)的种类，其可能代表三聚体。更高分子量多聚体的存在是几乎察觉不到的。在gB-SLPl-Del2样品中观察到类似的概况，其中主要群体是311 kDa (67%)的种类，其也可能代表三聚体 ，而更高分子量的多聚体的存在仅仅是微小的。总之，本发明的gB多肽(gB_SLP12和gB_SLPl_Del2)呈现改进的产物概况，因为与现有技术的gB多肽(gB-DeltaTM)的三聚体群体相比，三聚体群体增加了约2倍系数。3.3 分析轺谏离心-gB-SLP12_Delta725、gB-SLP12_Deltall3
如上述部分3.2中所述进行分析超速离心，以确定在纯化多肽gB-SLP12-Delta725和gB-SLP12-Deltall3内不同种类的溶液中的同质性和大小分布。如实施例2中描述重组表达多肽，且如本实施例3中的第一段描述进行纯化。纯化后，将gB-SLP12-Delta725和gB-SLP12-Deltal 13各自再悬浮在包含0.1% Pluronic的缓冲液中或没有Pluronic的缓冲液中。结果
-图1lA相继显示了在0.1% Pluronic存在或不存在的情况下通过分析超速离心分析的纯化的gB-SLP12-Deltall3多肽的概况。在Pluronic不存在的情况下，观察到的概况与图10中对于gB-SLP12和gB-SLP12-Del2观察到的概况相类似，类似的72%群体代表在纯化的多肽群体内的三聚体，即与现有技术的gB多肽(gB-DeltaTM)相比改进的产物概况。然而，在Pluronic存在的情况下，三聚体的百分比降低，伴随单体的百分比增加(25% )和大小约230 kDa的多聚体的存在。这种gB-SLP12-Deltall3多肽在Pluronic存在的情况下单体化的倾向表明对去污剂的敏感性。-图1lB相继显示了在0.1% Pluronic存在或不存在的情况下通过分析超速离心分析的纯化的gB-SLP12-Delta725多肽的概况。用这种纯化的多肽观察到的概况是类似的，无论Pluronic存在与否。事实上，在两种情况下三聚体的百分比为约70%，即与用上述gB-SLP 12和gB-SLP 12_De 12多肽观察到的三聚体百分比一样高，且因此，gB-SLP12-Delta725也显示与现有技术的gB多肽(gB-DeltaTM)相比改进的产物概况。结论
尽管gB-SLP12-Deltall3和gB_SLP12_Delta725两者都显示出具有三聚体的富集比例的改进的产物概况，但是获得的结果表明，gB-SLP12-Delta725提出了在溶液中具有增加的结构稳定性的额外优势，因为在Pluronic存在或不存在的情况下保持了其三聚体概况。事实上，去污剂处理对于该多肽的沉降特性没有可观察到的影响。3.4大小排阻层析
还使用在280 nm的UV-检测器和TSK G5000PWXL柱(Tosoh Bioscience)通过大小排阻层析确定纯化的gB-DeltaTM和gB_SLP12的蛋白大小。在室温下以0.5ml/min的流速将样品上样。在室温下以相同的流速用PBS + 0.1% Pluronic进行洗脱。甲状腺球蛋白(669kDa)、铁蛋白(440 kDa)、过氧化氢酶(232 kDa)、醛缩酶(158 kDa)、白蛋白(68 kDa)、伴清蛋白(75k Da)、卵清蛋白(43 kDa)、碳酸酐酶(29 kDa)、和核糖核酸酶(13.7kDa)用于校准。益果
如图13上所示，如通过大小排阻层析法所测量的，gB-SLP12具有357 kDa的大小，这可能代表三聚体形式。现有技术的两种多肽gB-DeltaTM和gB-S50_DeltaTM，即具有完整融合环的多肽，具有类似的代表较高分子量多聚体的710 kDa的大小。这些结果验证了上述用分析超速离心获得的结果，因为本发 明的多肽(gB-SLP12)具有不同于现有技术的多肽(gB-DeltaTM)的产物概况。实施例4: gB-SLP 12多肽的C末端剪切
4.1表汰和钝化
如实施例2中描述，瞬时转染和表达gB-DeltaTM、gB_SLP12、gB_SLP12_Deltall3和gB-SLP12-Delta725 多肽。如实施例 3 的第一段中描述，纯化 gB-SLP12、gB-SLP12_Deltall3和gB-SLP12-Delta725多肽。在转染后第6天收集后，用Bis-Tris和Empigen BB补充gB-DeltaTM上清液以分别达到20 mM和0.4%的最终浓度。然后将其上样至在包含20mM Bis-Tris - 0.4% Empigen BB, pH 6.0 的缓冲液中平衡的 Q-Sepharose XL 柱(GEHealthcare)上。用 75% 的包含 20 mM Bis-Tris - 0.4% Empigen BB, pH 6.0 的缓冲液和 25% 的包含 20 mM Bis-Tris - 0.4% Empigen BB -1 M NaCl, pH 6.0 的缓冲液的混合物从柱上洗脱结合的多肽。然后用磷酸钠补充洗脱物以达到10 mM的最终浓度，且调整至pH 6.8。然后将其上样至在包含10 mM磷酸钠-0.4% Empigen BB - 0.25M NaCl, pH
6.8的缓冲液中平衡的羟基磷灰石II型柱(Bio-Rad)上。回收含有多肽的流出物，且上样至在包含10 mM磷酸钠-0.4% Empigen BB - 0.25M NaCl, pH 6.8的缓冲液中平衡的Cellufine硫酸盐柱(JNC Corporation)上。回收含有多肽的流出物,使用IOOkD PelliconXL膜(Millipore)通过超滤浓缩,且上样至在包含10 mM磷酸钠-0.4% Empigen BB, pH
7.2的缓冲液中平衡的Superdex 200柱(GE Healthcare)上。收集洗脱物,浓缩,且用IOmM磷酸钾，PH 7.2进行渗滤。4.2 Western 印迹分析使用N-糖苷酶F去糖基化试剂盒(Roche，N0.11836552001)根据制备商的说明将上述纯化的多肽去糖基化。使用MOPS缓冲液将等量的每种纯化的去糖基化多肽在CriterionXT 4-12% Bis Tris凝胶(Biorad)上运行。将蛋白转移至硝酸纤维素膜，且用抗gB抗体MAb 27-156 (Spaete 等人，Virology 167，207-225 (1988)(图 14A,图 14B,泳道 3，图14C,泳道B,和图14D,泳道D)和抗6X His标记抗体(Abeam, N0.ab9108)(图14B,泳道2，图14C，泳道A，和图14D，泳道C)探测膜。结果
-图14A显示抗gB抗体识别纯化的gB-DeltaTM多肽群体中两种不同形式，表明在纯化群体中多肽以至少两种不同大小的形式存在，分别为92 kDa和80 kDa。基于氨基酸分子量的平均值(110 Da)，包含830个氨基酸的gB-DeltaTM的分子量应该是约91 kDa。因此，92 kDa条带可能对应于全长gB-DeltaTM多肽,而80 kDa条带可能对应于更短的多肽版本，表明在群体内，一些多肽被裂解且产生约80 kDa的剪切形式。-图14B显示，gB-SLP12多肽在细胞中重组表达后，抗gB抗体(泳道3)提供了识别类似大小的两种形式( 分别为92 kDa和80 kDa)的相同概况，表明在这种多肽中发生类似的裂解。这里应当注意的是，gB_SLP12的预期分子量也是约91 kDa，因为氨基酸的数目与对于gB-DeltaTM的是相同的。当用抗His标记抗体探测膜(泳道2)时，仅检测到约92kDa的条带。由于His标记位于多肽的C末端，这些数据表明，在多肽的C末端部分发生裂解，且因此生成缺失C末端的80 kDa的片段。-图14C显示，gB-SLP12-Deltall3多肽在细胞中重组表达后，抗gB抗体(泳道B)仅识别一条条带(在约80 kDa)。因为gB-SLP12-Deltall3包含717个氨基酸，所以其预期平均分子量应当是约79 kDa。因此，在约80 kDa的仅一条条带的观察结果表明，该纯化的多肽的群体仅由全长多肽构成，表明在该多肽群体中不再发生以前观察到的在C末端部分的裂解。通过用抗His标记抗体探测膜且观察到在约80 kDa的相同条带验证了这一点(泳道A)，表明存在多肽的C末端。-从关于多肽gB-SLP12_Delta725的图14D中提供的Western印迹可以得出类似的结论。泳道D代表用仅识别一条条带(在约80 kDa)的抗gB抗体探测的膜。包含824个氨基酸的该多肽的预期平均分子量应该是约79 kDa。泳道C代表用抗His标记抗体探测的膜且类似地仅识别在约80 kDa的一条条带，表明存在多肽的C末端。-在去糖基化过程中多肽可能沉淀，这可能导致不完整的去糖基化。当去糖基化不完整时，一些多肽以它们的糖基化形式保留，该形式通常在凝胶中以弥散方式迁移，如在图 14C和 14D 中提供的 Western 印迹中对于多肽gB_SLP12_Deltall3和 gB_SLP12_Delta725
所观察到的。
图14中提供的数据显示，当缺失至少部分胞质结构域时，多肽的C末端部分中的多肽gB-DeltaTM和gB_SLP12发生的剪切没有发生。 实施例5:多肽的gB-SLP12_Delta725的N末端异质性
如图12A中所示，CMV gB-SLP12-Delta725多肽，当在细胞中重组表达时，产生成熟多肽的群体，该成熟多肽在N末端是异质的。事实上，如所示，信号肽酶碰巧在不同的氨基酸位置裂开信号序列。这种现象也被称为信号肽酶“woobling”。
5.1表汰和钝化
如实施例2中描述的，重组表达如实施例1中描述的含有His标记的gB-SLP12-Delta725、 gB_SLP12-Delta725_LVL759、 gB-SLPl2-Delta725-LVL776 和gB-SLP12-Delta725-CD33多肽。转染后第6天，收集培养上清液。将不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche, N0.11873580001)添加至上清液中，且将NaCl浓度调节至500 mM,且最终pH调节至8.3。将IMAC琼脂糖6 FF (GE Healthcare)填充至5 cm直径玻璃柱(Waters)。用 5个柱体积的结合缓冲液(10 mM Tris, 500 mM NaCl, 10 mM咪唑，pH 8.3)平衡该柱。以10 ml/min的流速将上清液上样至平衡柱上。用两个柱体积的上述结合缓冲液洗涤未结合的物质。收获50 ml的级分。用额外两个柱体积的上述结合缓冲液进一步洗涤柱。收获10 ml的级分。用6个柱体积的洗脱缓冲液(Tris，500 mM NaCl, 350 mM,咪唑，pH 8.30)洗脱与柱结合的蛋白。收获10 ml的级分。将级分上样至SDS-PAGE凝胶，且合并阳性级分，且用Centricon超滤装置(Millipore)进行浓缩。通过RCDC修改的Lowry比色测定(Biorad)定量浓缩的蛋白。使用N-糖苷酶F去糖基化试剂盒(Roche, N0.11836552001)根据制备商的说明将5至10 Pg纯化的蛋白去糖基化。通过RCDC沉淀反应物(BioRad)沉淀去糖基化的蛋白，重悬浮在SDS-PAGE还原上样缓冲液中，且在SDS-PAGE上上样。切割在对应于去糖基化蛋白的位置处迁移的蛋白条带，用于胰蛋白酶消化和MS/MS肽图谱分析。5.2胰蛋白酶消化
含有纯化蛋白的凝胶片用乙腈(ACN)脱水。通过添加还原缓冲液(10 mM DTT, 100 mM碳酸氢铵)在40°C下还原蛋白30分钟，且通过添加烷化缓冲液(55 mM碘乙酰胺，100 mM碳酸氢铵)在40°C下烷化20分钟。然后凝胶片在40°C下通过添加CAN 5 min进一步脱水和洗涤，然后丢弃所有试剂。然后凝胶片在40°C下干燥5 min，且然后在4°C下用胰蛋白酶溶液(来自Promega的6 ng/μ 的测序级胰蛋白酶,25mM碳酸氢铵)再水合40 min。蛋白消化在58°C下进行lh，且用15μ I的1%甲 酸和2% ACN的混合物停止。将上清液转移至96孔板，且在室温下使用提取缓冲液(I %甲酸和50% ACN)用两个30分钟提取步骤进行胰蛋白酶消化的肽的提取。将所有提取的肽合并到96孔板中，且然后在真空离心机中完全干燥。将板密封，且保存在_20°C，直至进一步进行LC-MS/MS分析。5.3 JIlt
在LC-MS/MS分析之前，在12 μ 的0.2%甲酸中在搅拌的条件下将提取的肽重新溶解15 min,然后在2000rpm下离心I min。LC柱是用高压包装单元填充的C18反相柱。用C18Jupiter 5 lm300 A反相材料(Phenomenex)填充100 mm长的75 Im 1.d.溶融的二氧化娃毛细管。该柱安装在 nano LC-2D 系统(Eksigent)上，且与 LTQ Orbitrap (ThermoFisherScientific)结合。用于层析的缓冲液是0.2%甲酸(缓冲液A)和100% ACN/0.2%甲酸(缓冲液B)。在前12 min期间，将5 μ 样品以650nl/min的流速上样至柱上，且随后，梯度在20 min内从2%至80%缓冲液B，然后持续10 min回复至2%缓冲液B。使用4次扫描事件循环完成LC-MS/MS数据采集，所述4次扫描事件由在Orbitrap中获得的扫描事件I的全扫描MS构成。益果
-图12显示在测试的不同多肽的信号序列的裂解位点发生的信号肽“woobling”的定量评价的结果。信号肽酶的Woobling导致在表示的多肽的每个群体内的在其N末端处以不同氨基酸开始的各种成熟多肽形式的生成。-图12A显示，在胰蛋白酶消化总蛋白提取物和随后通过MS/MS对获得的包含N末端的多肽相对定量之后，观察到，在裂解信号序列之后，gB-SLP12-Delta725多肽的群体主要作为以相对等量比例(范围为约10%至约30%)的五种不同多肽形式(如所示，每种以不同氨基酸开始)存在于溶液中。-图 12B 和 12C 显示分别在 gB_SLP12-Delta725_LVL759 和gB-SLP12-Delta725-LVL776的群体中存在的不同形式的多肽的MS/MS相对定量的类似分析。据观察，在裂解信号序列之后，那两种多肽的群体主要作为以高于99 %的百分比的一种主要多肽形式存在于溶液中，其分别以SEQ ID NO: 14中所述序列的23位的氨基酸和以SEQ ID NO: 16中所述序列的24位的氨基酸开始。由信号肽酶裂解且生成两种额外的在N末端具有不同氨基酸的多肽形式的两个可替代的裂解位点代表多肽的各自群体内仅仅少于I %。-图12D显示在gB-SLP12-Delta725_CD33多肽的群体中存在的不同形式的多肽的MS/MS相对定量的类似分析。据观察，在裂解信号序列之后，该群体主要作为以高于99%的百分比的一种主要多肽形式存在于溶液中，其以SEQ ID NO: 18中所述序列的18位的氨基酸开始。由信号肽酶裂解且生成一种额外的在N末端具有不同氨基酸的多肽形式的其他可替代的裂解位点代表gB-SLP12-Delta725-CD33多肽群体内仅仅少于I %。结论
那些结果表明，gB-SLP12-Delta725-LVL759、gB-SLP12-Delta725-LVL776、和gB-SLP12-Delta725-CD33多肽中不再发生woobling，因为信号肽酶一致地仅识别一个主要裂解位点。这表明，对gB多肽的信号序列和前导序列进行的修饰对成熟多肽群体的异质性具有明显积极影响，使得所述群体在大于99%的程度上具有同质性。实施例6:含有本发明的示例性CMV gB多肽的免疫原性组合物的免疫原性
如下测试免疫原性组合物的免疫原性,所述免疫原性组合物含有下列包含C末端His标记且如在部分中描述表达且纯化的多肽:gB-DeltaTM、gB_SLP12、gB_SLP12_Deltall3、gB-SLP12-Delta725、LVL759、LVL776 和 CD33。6.1实骀设计
如表I中所示，10只C57BL/6小鼠的组已经用两个剂量的上述示例性免疫原性组合物接种疫苗，间隔为21天。已经进行肌内免疫(总体积为50 μ 的脂质体制剂中用包含2.5Pg D-MPL和2.5 μδ QS21的佐剂系统佐剂化的1.5 μδ每种gB多肽)。
表1-研究组
权利要求
1.巨细胞病毒(CMV)gB多肽，包含至少一部分gB蛋白细胞外结构域，所述至少一部分gB蛋白细胞外结构域包含融合环I (FLl)结构域和融合环2(FL2)结构域，其中所述FLl和FL2结构域中的至少一个包含至少一个氨基酸缺失或取代。
2.权利要求1的CMVgB多肽，包含至少50%、至少70%、至少80%、至少90%的所述细胞外结构域的氨基酸，或包含整个细胞外结构域。
3.权利要求1至2中任一项的CMVgB多肽，包含非功能性的跨膜(TM)结构域。
4.权利要求3的CMVgB多肽，包含至少一部分所述TM结构域的缺失。
5.权利要求4的CMVgB多肽，其中缺失至少50%、至少70%、至少80%、或至少90%的TM结构域的氨基酸。
6.权利要求4或权利要求5的CMVgB多肽，包含SEQ ID NO:1所示序列的725-775位或其他CMV gB多肽的对应位置处的氨基酸的缺失。
7.权利要求4至5中任一项的CMVgB多肽，包含SEQ ID NO:1所示序列的701-775位或其他CMV gB多肽的对应位置处的氨基酸的缺失。
8.权利要求1-7中任一项的CMVgB多肽，包含在所述FLl结构域中至少一个氨基酸的缺失或取代。
9.权利要求1-8中任一项的CMVgB多肽，包含在所述FL2结构域中至少一个氨基酸的缺失或取代。
10.权利要求1至7的CMVgB多肽，包含在所述FLl和FL2结构域两者中至少一个氨基酸的缺失或取代。
11.权利要求1至10中任一项的CMVgB多肽，包含至少一部分所述细胞质结构域的缺失。
12.权利要求11的CMVgB多肽，包含至少一个细胞质结构域的疏水氨基酸区的缺失。
13.权利要求12的CMVgB多肽，包含SEQ ID NO:1所示序列的氨基酸825至877或其他CMV gB多肽的对应位置处的氨基酸的缺失。
14.权利要求11的CMVgB多肽，包含至少80%、至少90%、至少95%的所述细胞质结构域的氨基酸的缺失，或所述整个细胞质结构域的缺失。
15.权利要求1至14中任一项的CMVgB多肽，其中所述融合环FLl结构域中至少一个氨基酸取代包含选自位于SEQ ID NO:1所示序列的155-157位或其他CMV gB多肽的对应位置处的Y.1.Y的至少一个氨基酸被除芳族氨基酸以外的极性氨基酸取代。
16.权利要求15的CMVgB多肽，其中所述取代包含选自位于SEQ ID NO:1所示序列的155-157位或其他CMV gB多肽的对应位置处的Y.1.Y的至少两个氨基酸被除芳族氨基酸以外的极性氨基酸取代。
17.权利要求15或权利要求16的CMVgB多肽，其中所述极性氨基酸选自带正电荷的氨基酸赖氨酸(K)、组氨酸(H)和精氨酸(R)。
18.权利要求17的CMVgB多肽，其中位于SEQ ID NO:1所示序列的156位或其他CMVgB多肽的对应位置处的异亮氨酸(I)被组氨酸(H)取代。
19.权利要求17或权利要求18的CMVgB多肽，其中位于SEQ ID NO:1所示序列的157位或其他CMV gB多肽的对应位置处的酪氨酸(Y)被精氨酸(R)取代。
20.权利要求15至19中任一项的CMVgB多肽，其中位于SEQ ID NO:1所示序列的155位或其他CMV gB多肽的对应位置处的酪氨酸(Y)被甘氨酸(G)取代。
21.权利要求1至14中任一项的CMVgB多肽，其中位于SEQ ID NO:1所示序列的融合环FLl结构域中的155-157位或其他CMV gB多肽的对应位置处的氨基酸Y.1.Y分别被氨基酸G.H.R取代。
22.权利要求1至14中任一项的CMVgB多肽，其中位于SEQ ID NO:1所示序列的融合环FLl结构域中155-157位、或其他CMV gB多肽的对应位置处的氨基酸Y.1.Y被一段氨基酸取代，所述一段氨基酸如通过Kyte和Doolittle指数所测量的具有小于_3，小于-7,小于-8的疏水性评分。
23.权利要求1至22中任一项的CMVgB多肽，其中所述融合环FL2结构域中至少一个氨基酸取代包含选自位于SEQ ID NO:1所示序列的240-242位或其他CMV gB多肽的对应位置处的W.L.Y的至少一个氨基酸被选自赖氨酸(K)、组氨酸(H)和精氨酸(R)的带正电荷的氨基酸取代。
24.权利要求23的CMVgB多肽，其中选自位于SEQ ID NO:1所示序列的240-242位或其他CMV gB多肽的对应位置处的W.L.Y的氨基酸被组氨酸(H)取代。
25.权利要求23或权利要求24的CMVgB多肽，其中位于SEQ ID NO:1所示序列的242位或其他CMV gB多肽的对应位置处的酪氨酸(Y)被组氨酸(H)取代。
26.权利要求1至22中任一项的CMVgB多肽，其中位于SEQ ID NO:1所示序列的融合环FL2结构域中的240-242位或其他CMV gB多肽的对应位置处的氨基酸W.L.Y分别被氨基酸A.F.H取代。
27.权利要求1至26中任一项的CMVgB多肽，包含至少一部分所述前导序列的缺失。
28.权利要求27的CMVgB多肽，包含至少40%、至少50%、至少70%、至少80%、至少90%的所述前导序列的氨基酸或整个前导序列的缺失。
29.CMV gB多肽，包含至少40%、至少50%、至少70%、至少80%、至少90%的所述前导序列的氨基酸或整个前导序列的缺失。
30.权利要求29的CMVgB多肽，进一步包含一个或多个权利要求1至26中任一项的特征。
31.CMV gB多肽，具有选自以下所示序列的序列:SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20 和 SEQ ID NO:21。
32.制剂，包含CMVgB多肽群体，其中所述群体的至少50%、至少60%、或至少70%是三聚体形式。
33.免疫原性组合物，包含权利要求1至31中任一项的CMVgB多肽与合适的药学载体的混合物。
34.权利要求33的免疫原性组合物，进一步包含至少一种或多种选自pUL131、gL、gH、pUL128、pUL130或其任何组合的CMV抗原。
35.权利要求3 3至34的免疫原性组合物，进一步包含佐剂。
36.权利要求35的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含脂质体制剂中的3D-MPL和QS21。
37.权利要求35的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含水包油乳剂。
38.多核苷酸，编码权利要求1至31中任一项的CMVgB多肽。
39.多核苷酸，具有选自以下所示序列的序列:SEQID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ IDNO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15 和 SEQ ID NO:17。
40.重组载体，包含权利要求38或权利要求39的多核苷酸。
41.用权利要求40的重组载体转化的宿主细胞。
42.权利要求1至31中任一项的CMVgB多肽或权利要求33至37中任一项的组合物，其用于预防和/或治疗CMV感染。
43.权利要求1至31中任一项的CMVgB多肽或权利要求33至37中任一项的组合物在制备用于预防和/或治疗CMV感染的药物中的用途。
44.权利要求42或权利要求43的用途，其用于预防新生儿中先天性CMV感染。
45.用于引发针对CMV的免疫应答的方法，所述方法包括将免疫有效量的包含权利要求I至31中任一项的CMV gB多肽的组合物或权利要求33至37中任一项的组合物施用于受试者的步骤。
46.用于预防新生儿中免于CMV的先天性感染的方法，所述方法包括将免疫有效量的包含权利要求1至31任一项的CMV gB多肽的组合物和权利要求33至37中任一项的组合物施用于受试者的步骤。
47.权利要求42至44的用途或权利要求45或权利要求46的方法，其中所述受试者是CMV血清阴性受试者。
48.权利要求47的用途或方法，其中所述CMV血清阴性受试者是生育年龄的妇女。
49.权利要求47的 用途或方法，其中所述CMV血清阴性受试者是少女。
全文摘要
本发明涉及包含至少一部分gB蛋白细胞外结构域的巨细胞病毒(CMV)gB多肽，所述至少一部分gB蛋白细胞外结构域包含融合环1(FL1)结构域和融合环2(FL2)结构域，其中所述FL1和FL2结构域中的至少一个包含至少一个氨基酸缺失或取代。
文档编号C07K14/045GK103237560SQ201180060437
公开日2013年8月7日 申请日期2011年10月14日 优先权日2010年10月15日
发明者G.J.M.F.P.鲍道克斯, N.布莱斯, M.马汉德 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司