专利名称：蛹虫草腺苷的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种蛹虫草腺苷的提取方法，属于生物制品加工技术领域。
背景技术：
蛹虫草，又名北冬虫夏草，蛹草，北虫草，蛹草菌等，分类学上属于真菌门，子囊菌亚门，核菌纲，球壳目，麦角菌科，虫草属。它是中国的一味传统中药，具有巨大的药用价值。蛹虫草中含有多种化学成分，具有多种药用功效，与冬虫夏草的药理功能和临床效果相似，但价格却远远低于冬虫夏草，因此蛹虫草逐渐成为冬虫夏草的替代品，具有极大的潜在市场。常规提取方法如水提法，水提醇沉法，醇提法等，提取过程单一，无法彻底提取蛹虫草中的有效成分。同时这些提取方法在保留有效成分，弃除无效成分方面，仍存在提取不够充分，有效成分损失大，工序多，周期长，成本高等缺点。且常规提取方法难以破除蛹虫草坚硬的细胞壁，给提取过程带来很大的困难，造成很大的浪费与损失。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种蛹虫草腺苷的提取方法。为达到上述目的，本发明提供一种蛹虫草腺苷的提取方法，所述方法为超微粉碎、 反复冻融、微波提取和半仿生提取的组合，具体包括以下步骤
(1)蛹虫草的培养以蚕蛹为主要原料，大米为辅料对蛹虫草进行培养，包括如下步
骤
a.蛹虫草培养基的配制培养基配方为干蚕蛹粉13(Tl40g/L；大米粉6(T65g/L ；磷酸二氢钾1. 2 1. 5g/L ；磷酸二氢钠0. 8^1. 2 g/L ；加水先溶解KH2P04、NaH2PO4、充分混勻后再加入上述干蚕蛹粉、大米粉混合均勻，勻浆，分装，每瓶装50 ml，盖好盖子，于121°C，1. IMpa 的条件下湿热灭菌3(T45 min，冷却后备用；
b.接种于步骤a所得蛹虫草培养基中接种蛹虫草菌种(蛹虫草为Cordyc印s militarist.) Link)，其密度为3 5个菌球/mL，所述蛹虫草培养基与所述蛹虫草菌种的体积比为50:1，接种后于22°C、湿度75 85%的条件下避光培养3 5天，使虫草菌丝迅速长满培养基表面，然后进行以下光照培养；
第一阶段生长培养在生长期第5 20天内光照培养，白天12小时自然光光照，温度 20^220C (优选为22°C )、湿度80 85%，光照强度控制在100 150Lx ；晚上12小时闭光， 温度18 20°C (优选为18°C )、湿度75 85%，每天通风2次，早晚各一次，每次通风20 30分钟；
第二阶段生长培养在生长期第20 35天内，白天12小时自然光加日光灯光照，温度 20^220C (优选为22°C )、湿度75% 85%，光照强度控制在1000 1200 Lx ；晚上12小时闭光，温度18 20°C (优选为18°C )、湿度75 85%，每天通风2次，早晚各一次，每次通风时间为20 30分钟；
c.旋开培养瓶盖，镊子用75%酒精消毒后，将步骤b所得培养基上面的子实体取出，将取出的子实体置于干净的不锈钢盘中，挑选色泽均勻、粗壮、完整的子实体，去除残存的培养基后置于新的不锈钢盘中称重备用；培养瓶中剩余部分按第2(Γ35天的培养条件及方法继续培养后用于再次收获；
d.烘干将步骤c所得蛹虫草子实体置于垫有纱布的不锈钢盘中，均勻铺开，3(T37°C 热风循环烘干待用，水分含量最终控制在10%以下；
(2)低温超微粉碎
每次称取IOOg 200g烘干的蛹虫草子实体，放入超微粉碎机中粉碎3 10分钟，粉碎时用2V 10°C的水作为冷却液，降低粉碎温度，保护蛹虫草中的腺苷；
(3)反复冻融提取称取100g 150g的蛹虫草超微粉碎粉末，向蛹虫草超微粉碎粉末中加入5 30倍体积(按照Ig的物料加提取剂Iml计算)的超纯水后于-80°C的冰箱中冷冻2飞小时，以使细胞内迅速形成大的冰晶，充分破坏细胞结构；冷冻结束后于2(T60°C 的水浴锅中迅速解冻，加强细胞的损坏程度；如此反复冻融;Γ7次，反复冻融结束后以 8000g^l2000g的离心力在离心机中离心5 30分钟，收集上清，沉淀自然风干后继续提取；
(4)蛹虫草腺苷的半仿生微波加热提取包括
a.pH值为4. 5^5. 5的酸性水的配制用36°/Γ38%的盐酸溶液调节超纯水的ρΗ值为 4. 5、. 5即为酸性水；
b.pH值为6. 5^7. 5，浓度为0. lmol/L的磷酸钠缓冲液的配制准确称取Na2HPO4. 12H20 35. 814g，溶于30m广80ml的超纯水中，定容至100ml，配制成lmol/L的磷酸氢二钠溶液；准确称取NaH2PO4. 2H20 15. 601g溶于30m广80ml的超纯水中，定容至100ml，配制成lmol/L 的磷酸二氢钠溶液；将磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液按51:149 169:31的比例混勻至 IOOml后，稀释至1000ml，配制成pH值为6. 5 7. 5，浓度为0. ImoL/L的磷酸钠缓冲液；
c.pH值为8. (Γ8. 5的碱性水的配制用氢氧化钠溶液调节超纯水的pH至8. (Γ8. 5，配制成碱性水；
d.提取工艺按照料液比(每g物料加入Iml的提取剂)为5 30(m/v)的比例向反复冻融提取结束后风干的沉淀中加入酸性水，于微波炉中以609Γ80%的功率加热广5钟之后， 以8000g 12000g的离心力于室温下离心5 30分钟，收集上清液，沉淀自然风干；再按照料液比(每g物料加入Iml的提取剂)为5 30(m/v)的比例向上述酸性水提取结束后自然风干的沉淀中加入PH为6. 5^7. 5，浓度为0. lmol/L的磷酸钠缓冲溶液，于微波炉中60°/Γ80%的功率加热广5钟之后，以SOOOg 12000g的离心力于室温下离心5 30分钟，收集上清液，沉淀自然风干；最后向自然风干的沉淀中加入5 30倍体积(每g物料加入Iml的提取剂)的碱性水，于微波炉中以609Γ80%的功率加热提取广5分钟，提取结束后以8000g 12000g的离心力于室温下离心5 30分钟，收集上清液，弃去沉淀；合并三次上清液，过0. 45 μ m的水系膜后取100 μ 1加超纯水稀释至1000 μ 1，过0. 22 μ m的水系膜后于高效液相色谱仪中测定腺苷的含量。 酸碱不断变化的环境有利于腺苷形成盐，盐更易溶于水，故而腺苷的提取率也会有所提高。提取过程采用微波提取技术，在充分破碎蛹虫草细胞的同时，强化传质过程，使腺苷更大量的溶出，从而提高腺苷提取率。提取结束后应用高效液相色谱仪测定提取液中腺苷的含量。上述步骤中除用微波提法提取外，还可应用超声波法提取，震荡提取，回流加热等提取方法强化传质过程，以提高腺苷的溶出率。本方法采用低温超温粉碎技术破除蛹虫草坚硬的细胞壁，采用反复冻融法进一步破坏细胞结构，再联合以半仿生提取方法和微波提取技术增加腺苷溶出，强化传质过程。不仅操作简单，提取周期短，成本低，而且腺苷提取率高。本发明具有以下有益效果
1.该方法模拟人体胃肠道酸碱环境进行蛹虫草腺苷的提取，所获得的腺苷易于加工成各种类型的药剂；在生产加工成口服液或其他类型的剂型之后，可确保蛹虫草有效成分的直接吸收，减轻肠胃负担；
2.该方法提取蛹虫草腺苷含量高，腺苷的含量可达到每g原药材提取得到2.^599mg的量，最终活性成分的提取率可高达0. 227%。比其他的常规提取方法提取以固体培养基培养得到的蛹虫草子实体所得到的活性组分的提取率都高，且质量可控，料损少，成本低，生产周期短，适合大规模生产，市场潜力巨大；
3.低温超微粉碎技术破除了蛹虫草坚硬的细胞壁，有利于细胞内容物的溶出，有利于提取过程的顺利进行，在保证腺苷的生物活性的同时，提高腺苷的提取率，减少浪费；反复冻融则可进一步破坏细胞尤其是细胞壁的结构；以水作为溶剂对蛹虫草子实体中的腺苷进行三次连续提取不仅有利于更加充分的提取腺苷，还避开了有害溶剂的污染，使最终所获得的提取物安全无毒；
4.应用该方法提取得到的腺苷，不仅提取率高，易于后续的分离纯化，而且易于吸收， 能够充分发挥腺苷在体内的功效。
图1为采用普通破碎方法破碎蛹虫草后的扫描电镜图； 图2为超微低温粉碎后的扫描电镜图3为腺苷的标准曲线图。
具体实施例方式应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。本发明所述的方法先将蛹虫草子实体用超微粉碎机于低温下超微粉碎，以破除其坚硬的细胞壁，使蛹虫草子实体细胞内溶物充分溶出，以利于提取过程的顺利进行；采用反复冻融法进一步破坏细胞结构，使细胞内溶物更容易溶出细胞；最后运用半仿生方法联合微波提取技术进行三次连续提取，通过酸碱不断变化的环境模拟人体胃肠道环境，应用微波所释放出来的能量强化传质过程，以此来模拟人体胃肠蠕动。腺苷最终的提取率可高达 0.227%。下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容。实施例1 蛹虫草的培养
6以蚕蛹为主要原料，大米为辅料，加入磷酸盐及水配制成培养基对蛹虫草进行培养。a.培养基的配置本发明的蛹虫草培养基为水溶液，由如下浓度的成分构成 干蚕蛹粉140 g/L ；
大米粉60 g/L ；
磷酸二氢钾1. 2 g/L ；
磷酸二氢钠1. 2 g/L ；
优选的具体制备方法如下
准确称取干蚕蛹粉2. 1kg，大米粉900g，磷酸二氢钾18g，磷酸二氢钠18g后，加纯净水 12 L，先溶解KH2PCVNaH2PO4、充分混勻后得到体积为15L的培养基溶液，再加入上述干蚕蛹粉、大米粉混合均勻，勻浆，分装，每瓶装50 ml，盖好盖子，于121°C，1. IMpa的条件下湿热灭菌30 min，冷却后备用。b.接种于超净台中接种蛹虫草(Cordyc印s militaris(L) Link)菌种(菌种来自于苏州蚕桑专科学校，贡成良教授赠送)，液体菌种密度控制在3-5个菌球/mL，每瓶接种 1 mL,接种后于22°C、湿度75 85%的条件下避光培养3 5天，使虫草菌丝迅速长满培养基表面，然后进行以下光照培养；
第一阶段生长培养在第5 20天光照培养，白天12小时光照(用自然光即可)，温度22°C、湿度80 85%，光照强度控制在100 150Lx ；晚上12小时闭光，温度18°C、湿度 75 85%。每天通风2次，早晚各一次，每次通风20 30分钟；
第二阶段生长培养在第20 35天白天12小时光照(自然光加日光灯)，温度22°C、 湿度75% 85%，光照强度控制在1000 Lx ；晚上12小时闭光，温度18°C、湿度75 85%，每天通风2次，早晚各一次，每次通风时间为20 30分钟。注意事项
①光照时要用散射光，而不能用直射光，虫草的生长有向光性，处于光照均勻的地方的瓶子要注意转瓶，以促进子实体向上生长；
②在培养过程中要严格控制温度和湿度。若车间没有温控装置，可通过地面洒水的方式来控制培养室的温度。培养室的温度不能超过25°C ；
③注意通风换气的次数和时间；
④污染的瓶子要及时拿出处理，以避免污染的扩大。c.收获及再培养旋开培养瓶盖，镊子用75%酒精消毒后，将子实体取出(只取出培养基上面的部分)，将取出的子实体置于干净的不锈钢盘中，挑选色泽均勻、粗壮、完整的子实体，去除残存的培养基后置于新的不锈钢盘中称重备用；培养瓶中剩余部分按第 20^35天的培养条件及方法继续培养后可再次收获。d.烘干将蛹虫草子实体置于垫有纱布的不锈钢盘中，均勻铺开，37°C热风循环烘干待用，水分含量最终控制在10%以下。实施例2 蛹虫草的低温超微粉碎
每次称取150 g烘干的蛹虫草子实体，放入超微粉碎机中，超微粉碎6 min，破碎全过程用Γ Ο 的水作为冷却液，以确保有效成分的生物活性，粉碎后取样用扫描电镜检测破碎效果。普通破碎和超微破碎后的效果分别见图1和图2。通过比较图1和图2可以明显看出，普通破碎后蛹虫草子实体的细胞壁完整，细胞仍旧成团块聚集。超微粉碎后的细胞壁不完整，内容物隐约可见，故超微粉碎后的蛹虫草孢子彻底破碎，营养成分得到了有效的释放。实施例3 反复冻融提取
称取IOOg士0. Ig的蛹虫草超微粉碎粉末，向蛹虫草超微粉碎粉末中加入10倍体积的超纯水1000ml，混勻后于-80°c的冰箱中冷冻4小时，以使细胞内迅速形成大的冰晶，充分破坏细胞结构；冷冻结束后于37°C的水浴锅中迅速解冻，加强细胞的损坏程度。如此反复冻融5次。反复冻融结束后以IOOOOg的离心力在离心机中离心20分钟，收集上清。沉淀自然风干后继续提取。实施例4 腺苷的半仿生提取
半仿生提取是从生物药剂学的角度将整体药物研究法与分子药物研究法相结合，模仿口服药物在胃肠道中的转运过程，采用选定PH值的酸性水、中性磷酸钠盐缓冲液和碱性水，依次连续提取得到含高指标成分的活性混合物的中药药效物质提取新技术。本发明通过设计不同的酸碱环境，对蛹虫草进行3次连续水提，腺苷含量用高效液相色谱仪进行测定。(1)提取用溶液的配制
PH值为5. 0的酸性水的配制用38%的盐酸溶液调节超纯水的pH值为5. 0即为酸性水。pH值为7. 0，浓度为0. lmol/L的磷酸钠缓冲液的配制准确称取Na2HPO4. 12H20 35. 814g，溶于70ml的超纯水中，定容至100ml，配制成lmol/L的磷酸氢二钠溶液；准确称取NaH2PO4. 2H20 15. 601g溶于70ml的超纯水中，定容至100ml，配制成lmol/L的磷酸二氢钠溶液；取磷酸氢二钠溶液57. 7ml和磷酸二氢钠溶液42. 3ml混勻后，稀释至1000ml，配制成PH值为7. 0，浓度为0. ImoL/L的磷酸钠缓冲液。pH值为8. 0的碱性水的配制用氢氧化钠溶液调节超纯水的pH至8. 0，配制成碱性水。按照料液比(每g物料加入Iml的提取剂)为1 :10(m/v)的比例向反复冻融提取结束后风干的沉淀中加入1000ml，pH值为5. 0的酸性水，于微波炉中以60%的功率加热提取 2分钟后，以IOOOOg的离心力于室温下离心20分钟，收集上清液，沉淀自然风干；再按照料液比(每g物料加入Iml的提取剂)为1 :10(m/v)的比例向酸性水提取结束后自然风干的沉淀中加入IOOOml的pH为7. 0，浓度为0. lmol/L的磷酸钠缓冲溶液，以60%的功率微波加热提取2分钟后，以IOOOOg的离心力于室温下离心20分钟，收集上清液，沉淀自然风干；最后向自然风干的沉淀中加入1 :10倍的碱性水1000ml，以60%的功率微波加热提取2分钟， 提取结束后以IOOOOg的离心力于室温下离心20分钟，收集上清液，弃去沉淀；三次连续提取结束后，合并三次上清液，过0. 45 μ m的水系膜后于4°C冰箱中贮存备用。(2)色谱条件
Appolo C18柱Q50 mmX4. 6 mm, 5 Mm)，柱温30°C，检测波长洸Onm，流动相甲醇(色谱级 100%) —0. 01mol/L 磷酸钠缓冲液(ρΗ6· 6) 15 :85，流速 0. 700ml/min，进样量 10 μ 1。(3)样品溶液的制备
取100 μ 1过0. 45 μ m水系膜后的提取液加超纯水稀释至1000 μ 1，过0. 22 μ m的水系膜后即为样品溶液。
(4)腺苷标准品溶液的制备
腺苷标准品购自于天津西恩思公司，纯度为99. 9%，将IOmg的腺苷标准品溶于IOml的无菌超纯水中，制备成lmg/ml的储备液。取12 μ 1的标准贮备液，用超纯水稀释成30μ g/ml的标准品溶液，然后再依次稀释成10 μ g/ml, 5 μ g/ml, 1 μ g/ml的标准品溶液。每个浓度的标准品溶液测试3次。按照 (2)色谱条件进样，以峰面积Y对浓度Χ( μ g/ml)做标准曲线，得线性回归方程。3、提取结果
(1)腺苷标准品的测定结果见下表1。表1
权利要求
1.一种蛹虫草腺苷的提取方法，其特征在于，所述方法为超微粉碎、反复冻融、微波提取和半仿生提取多种工艺的组合，具体包括以下步骤(1)蛹虫草的培养以蚕蛹为主要原料，大米为辅料对蛹虫草进行培养；(2)低温超微粉碎通过低温超微粉碎技术破除蛹虫草子实体坚硬的细胞壁；(3)反复冻融提取反复冻融超微粉碎粉末3 7次，以使蛹虫草细胞壁破除更充分，同时损坏胞质内的细胞器结构，以利于蛹虫草中腺苷的溶出；(4)半仿生微波加热提取分别在PH值为4.5^5. 5的酸性水，pH值为6. 5^7. 5的中性磷酸钠缓冲液和PH值为8. (Γ8. 5的碱性水中对蛹虫草中的腺苷进行3次连续提取。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括a.蛹虫草培养基的配制培养基配方为干蚕蛹粉13(T140g/L;大米粉6(T65 g/L ；磷酸二氢钾1. 2 1. 5g/L ；磷酸二氢钠0. 8^1. 2 g/L ；加水先溶解KH2P04、NaH2PO4、充分混勻后再加入上述干蚕蛹粉、大米粉混合均勻，勻浆，分装，每瓶装50 ml，盖好盖子，于121°C， 1. IMpa的条件下湿热灭菌3(T45 min，冷却后备用；b.接种于步骤a所得蛹虫草培养基中接种蛹虫草菌种，其密度为3 5个菌球/mL， 所述蛹虫草培养基与所述蛹虫草菌种的体积比为50:1，接种后于22°C、湿度75 85%的条件下避光培养3 5天，使虫草菌丝迅速长满培养基表面，然后进行以下光照培养；第一阶段生长培养在生长期第5 20天内光照培养，白天12小时自然光光照，温度 20 22°C、湿度80 85%，光照强度控制在100 150Lx ；晚上12小时闭光，温度18 20°C、 湿度75 85%，每天通风2次，早晚各一次，每次通风20 30分钟；第二阶段生长培养在生长期第20 35天内，白天12小时自然光加日光灯光照，温度 20 22°C、湿度75% 85%，光照强度控制在1000 1200 Lx ；晚上12小时闭光，温度18 20°C、 湿度75 85%，每天通风2次，早晚各一次，每次通风时间为20 30分钟；c.收获及再培养旋开培养瓶盖，镊子用75%酒精消毒后，将步骤b所得培养基上面的子实体取出，将取出的子实体置于干净的不锈钢盘中，挑选色泽均勻、粗壮、完整的子实体， 去除残存的培养基后置于新的不锈钢盘中称重备用；培养瓶中剩余部分按第2(Γ35天的培养条件及方法继续培养后用于再次收获；d.烘干将步骤c所得蛹虫草子实体置于垫有纱布的不锈钢盘中，均勻铺开，3(T37°C 热风循环烘干待用，水分含量最终控制在10%以下。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤b中的蛹虫草为Cordyc印s militarist.) Link.，蛹虫草菌种为蛹虫草液体菌种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤( 包括每次称取10(T200 g烘干的蛹虫草子实体，放入超微粉碎机中粉碎;TlO min，粉碎时用 2 10°C的水作为冷却液，以降低粉碎温度，保护蛹虫草中腺苷的活性。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤C3)包括称取100g 150g的蛹虫草超微粉碎粉末，向该蛹虫草超微粉碎粉末中加入5 30倍体积的超纯水后于-80°C的冰箱中冷冻2飞小时，以使细胞内迅速形成大的冰晶，冷冻结束后于 20^600C的水浴锅中迅速解冻，如此反复冻融3 7次；反复冻融结束后以8000g 12000g的离心力在离心机中离心5 30分钟，收集上清，沉淀自然风干后继续提取。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)包括a.pH值为4. 5^5. 5的酸性水的配制用36%_38%的盐酸溶液调节超纯水的pH值为 4. 5、. 5即为酸性水；b.pH值为6. 5^7. 5，浓度为0. lmol/L的的中性磷酸钠缓冲液的配制准确称取 Na2HPO4. 12H20 35. 814g，溶于30m广80ml的超纯水中，定容至100ml，配制成lmol/L的磷酸氢二钠溶液；准确称取NaH2PO4. 2H20 15. 601g溶于30m广80ml的超纯水中，定容至100ml，配制成lmol/L的磷酸二氢钠溶液；将磷酸氢二钠溶液磷酸二氢钠溶液按51 149^169 31的比例混勻至IOOml后，稀释至1000ml，配制成pH值为6. 5 7. 5，浓度为0. ImoL/L的磷酸钠缓冲液；c.pH值为8. (Γ8. 5的碱性水的配制用氢氧化钠溶液调节超纯水的pH至8. (Γ8. 5，配制成碱性水。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)还包括按照料液比为5 30(m/v)的比例向反复冻融提取结束后风干的沉淀中加入酸性水，于微波炉中以60% 80%的功率加热广5钟之后，以SOOOg 12000g的离心力于室温下离心5 30 分钟，收集上清液，沉淀自然风干；再按照料液比为5 30(m/v)的比例向酸性水提取结束后自然风干的沉淀中加入PH为6. 5^7. 5的中性磷酸钠缓冲液，于微波炉中以609Γ80%的功率加热广5钟之后，以SOOOg 12000g的离心力于室温下离心5 30分钟，收集上清液，沉淀自然风干；最后向自然风干的沉淀中加入5 30倍体积的碱性水，于微波炉中以609Γ80%的功率加热提取广5分钟，提取结束后以SOOOg 12000g的离心力于室温下离心5 30分钟，收集上清液，弃去沉淀；合并三次上清液，过0. 45 μ m的水系膜后取100 μ 1加超纯水稀释至 1000 μ 1，过0. 22 μ m的水系膜后于高效液相色谱仪中测定腺苷的含量。
全文摘要
本发明涉及一种蛹虫草腺苷的提取方法，属于生物制品加工技术领域。本发明主要是将蛹虫草子实体经低温超微粉碎后先进行反复冻融3~7次，以破坏细胞内部成分，并进一步损坏蛹虫草细胞壁；再模拟人体胃肠道酸碱环境，应用半仿生提取工艺对蛹虫草中的腺苷进行3次连续微波加热提取，最后用高效液相色谱仪测定提取液中腺苷的含量。本发明模拟人体胃肠道酸碱环境进行蛹虫草腺苷的提取，酸碱环境不仅有利于腺苷形成盐，促进其溶出，而且，所获得的腺苷提取率高，易于后续的分离纯化工艺的进行，也易于加工成各种类型的药剂；在生产加工成口服液或其他类型的剂型之后，可确保蛹虫草有效成分的直接吸收，减轻肠胃负担。
文档编号C07H19/167GK102558265SQ20121000082
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月4日 优先权日2012年1月4日
发明者卢丽丽, 张耀洲, 舒特俊, 陈剑清 申请人:正源堂(天津)生物科技有限公司