提高蛹虫草固体培养基中虫草菌素含量的方法

专利名称：提高蛹虫草固体培养基中虫草菌素含量的方法
技术领域：
本发明涉及真菌发酵工程，具体而言涉及蛹虫草固体培养高产医药原料 虫草菌素。
背景技术：
虫草菌素的分子式为C10H13N503，分子量251,碱性，针状或片状结晶， 熔点230°C~23rC，溶于水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，蒽酮 反应阳性，紫外光最大吸收波长为259nm 。虫草菌素的结构式如下
Cordycepin (3'-deoxyadenosine)
蛹虫草产生的虫草菌素具有多种生物学活性，比如抑菌作用，抗肿瘤 作用，抑制人体免疫缺陷病毒HIVI型病毒的作用，减肥作用，免疫调节作 用和明显降血糖、降血脂作用。其中，降血脂方面的效果尤为明显，与巿售 的非诺贝特(法国力博福尼制药公司生产)效果相当或优于非诺贝特；在治 疗白血病方面也在美国由FDA批准进入了临床研究(1997年11月美国癌症 研究所，2008年7月美国OncoVista公司)。
目前蛹虫草已实现了大规模固体培养，但虫草子实体中虫草菌素含量占 培养物中总的虫草菌素的量较低(约30%)。要充分利用这一有价值的资源就必须寻求提高虫草菌素产量的有效途径，也即提高培养基中虫草菌素的单 位产量。据报道，人工蛹虫草培养基中虫草菌素的含量偏低，仅为0.2%左 右。故提高培养基中虫草菌素的含量具有重要的意义。
近年来，人们渐渐关注提高虫草菌素含量的技术，涉及虫草菌素的专利
申请有01124109.8号"发酵培养生产虫草素的方法(液体培养)"、 200810068734. 8号"红曲协同发酵提高蛹虫草子实体和虫草素产量的方法"、 200310101650. 7号"3'-脱氧腺苷在制备降血脂药物中的应用"等。然而，
目前关于蛹虫草固体发酵的专利主要集中在子实体生产工艺研究方面，很少
涉及固体培养基大规模生产虫草菌素的报道。

发明内容
本发明的目的在于提供一种提高蛹虫草固体培养基中虫草菌素含量的 方法，从而大幅度提高其中虫草菌素的含量。 发明人指出，蛹虫草传统固体发酵的方法是
1. 菌种活化
(1) 配PDA培养基马铃薯200g,水煮30min，用4层纱布过滤，取滤液， 葡萄糖20g，琼脂15 20g,加水至1000mL;
(2) 将配好的PDA培养基分装到试管，包扎，12rC灭菌30mim;
(3) 灭好菌的试管培养基凝固前摆斜面，冷却；
(4) 将原始菌种从4'C冰箱中取出，室温下在超净搡作台上无菌接种；
(5) 接种蛹虫草的斜面置26'C下黑暗恒温培养；
(6) 3~5天后，等菌种长满斜面，用无菌水洗斜面制成孢子悬液(在超净 搡作台上无菌操作)。
2. 液体菌种制作
将蛹虫草孢子悬液稀释到合适浓度，然后将孢子悬液接入液体母种培养基中，于20。C 28。C下摇床以150r/min的转速培养4d。
上述液体母种培养基的配方为蛋白胨2%,蔗糖2%， MgS04'7H20 0.05 %， KH2P04 0.1 %,水1000mL， pH自然；装液量为100mL/500mL三角瓶。
1蛹虫草培养
350ml无色玻璃罐头瓶中装入20g大米，按l: 1. 6的料水比加入32mL 营养液；用耐高温单层聚丙烯塑料膜封口， 12rC， 30min条件下高压灭菌， 冷却后，接种蛹虫草液体菌种，置25'C下黑暗恒温培养10d;从ll天起每 天散射光光照不少于10h，温度保持25匸，相对湿度提高至80%左右；蛹虫 草子座长出后，每天散射光光照不少于15h,且增大光照强度，保持温度22 'C左右，空气湿度85%左右；待蛹虫草培养50天后，除去少量橙黄色的子实 体，检测干燥后的培养基中虫草菌素的含量。
发明人指出，虫草菌素的检测方法如下虫草菌素含量通过HPLC检测， HPLC测定用PC2000型HPLC分析仪(Scientific systems Inc., PA, USA); 色谱柱釆用K醒asil C18 (4. 6 mm x 250 mm, 5 Mm particle size, Scientific systems Inc., PA， USA);紫夕卜检测仪(model: Labal 1 iance 525, Scientific systems Inc., PA， USA);检测波长为254nm;柱温30°C;流动相为10mMKH2PO4 溶于甲醇/双蒸水(15:85),流速为lmL/min;进样量为2(^L。先精密称取干 样品0. 2g置于具塞试管中，加入双蒸水l(kL,超声处理30min,然后在5000g 下离心15min，最后经0.45 Mm滤膜过滤除杂后检测其中虫草菌素的含量。 若测定前样品经过稀释，则乘以稀释倍数。
本发明的方法是在蛹虫草传统固体发酵的基础上，通过改变培养基颗粒 度和营养液工艺优化来实现的。具体来说，取大米颗粒度为20目和14目按照 1 : 2的质量比配合作为培养基基质；釆用葡萄糖3%，蛋白胨3.5%， K2HP04 0.05%, MgS04 , 7H20 0.05 %, VB, (2mg/L)，水1000mL, pH自然的配方配制营养液，按照前述的传统固体发酵方法对蛹虫草进行培养，蛹虫草子座长出
后，增加光照强度和时间；最有利于固体培养基中虫草菌素的高产。
本发明所使用的菌株为蛹虫草菌株(6bnZ/ce/w肌7/"r")的无性型 蛹草拟青霉(; aec/7咖.「c" PM-71菌株，此菌株已于2008年4月17
曰在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记入册编 号CGMCCNo. 2459;地址北京巿朝阳区大屯路(中国科学院微生物研究所)。 上述大米颗粒度组合是分别以整米、10目米、14目米、20目米、40目 米以及它们的两两组合(按照不同的质量比组合)为培养基基质，基质营 养液按l : 1.6质量比配比，加入营养液；灭菌后接种蛹虫草培养50d,收获
培养基，对虫草菌素含量测定而优选出来的。
上述营养液的配方是将固体培养基营养液单因子优化得到的最佳碳源 (葡萄糖)、氮源(蛋白胨)、无机盐(UlP04和MgS04 '7H20)和生长因子(VB,) 按照五因素、四水平进行正交实验优选出来的。
上述方法中，蛹虫草子座长出后，每天散射光光照不少于15h，增加光 照强度至3500LX。
经过对培养基生产虫草菌素的最佳工艺进行验证，证明此工艺使培养基 中虫草菌素的含量达到0.76%，比优化前的0.26%提高了 192.31%。
.本发明的提高蛹虫草固体培养基中虫草菌素含量的方法，可以大幅度提 高培养基中虫草菌素的含量，对提高蛹虫草固体发酵生产虫草菌素的效率具
有重要意义；本发明具有方便快捷的优点，适用于蛹虫草固体发酵大规模生
产虫草菌素。
具体实施例方式
实施例1:在IO个容积为350ml、内径为6. 2cm、高度为15cm的圆柱形 无色玻璃瓶中分别装入20目的大米和l4目的大米组合(按照1 : 2的质量比配比)，按1 : 1. 6的料水比加入32mL营养液(釆用葡萄糖3 %,蛋白胨3. 5 %, K肌O. 05%, MgS04 . 7H20 0.05 %， VB! (2mg/L)，水lOOOrnL， pH自然的配 方配制而成的营养液)，用耐高温单层聚丙烯塑料膜封口后121°C, 30min高 压灭菌，冷却后接种蛹虫草(CGMCCNo.2459 )液体母种，置25'C下黑暗恒温 培养10夭。从第11天起每天散射光光照不少于10h,温度保持25'C,相对 湿度提高至80%左右；蛹虫草子座长出后，每天散射光光照不少于15h,且 增加光照强度至3500LX,温度保持22。C左右，空气湿度85%左右；待蛹虫草 培养50天后，除去少量橙黄色的子实体，检测千燥后的培养基中虫草菌素的 含量。
实施例2:在IO个容积为350ml、内径为6. 2cm、高度为15cm的圆柱形 无色玻璃瓶中分别装入20目的大米和14目的大米组合(按照1 : 2的质量比 配比)，按1 : 1. 6的料水比加入40mL营养液(釆用葡萄糖3%，蛋白胨3.5%， K2HPO40. 05%， MgS04 . 7H20 0.05 %， VB, (2mg/L)，水lOOOmL, pH自然的配 方配制而成的营养液)，用耐高温单层聚丙烯塑料膜封口后12rC, 30min高 压灭菌，冷却后接种蛹虫草(CGMCCNo.2459 )液体母种，置25。C下黑暗恒温 培养10天。从第11天起每天散射光光照不少于10h，温度保持25。C,相对 湿度提高至80%左右；蛹虫草子座长出后，每天散射光光照不少于15h，且增 加光照强度至3500LX,温度保持22i:左右，空气湿度85%左右。待蛹虫草培 养"天后，除去少量橙黄色的子实体，检测干燥后的培养基中虫草菌素的含 量。
权利要求
1. 提高蛹虫草固体培养基中虫草菌素含量的方法，该方法包括菌种活化、液体菌种制作、蛹虫草培养3个步骤，其特征在于该方法中取大米粒度为20目和14目按照1∶2的质量比配比作为培养基基质；采用葡萄糖3％，蛋白胨3.5％，K2HPO4 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，2mg/L VB1，水1000mL，pH自然的配方配制营养液，按照传统的固体发酵方法对蛹虫草进行培养。
2.按照权利要求l所述的方法，其特征在于所述的蛹虫草培养过程中， 所使用的菌株为蛹虫草的无性型蛹草拟青霉CGMCCNo.2459菌株。
3. 按照权利要求l所述的方法，其特征在于所述的蛹虫草培养过程中， 蛹虫草子座长出后，每天散射光光照不少于15h,所用光照强度为3500LX。
全文摘要
本发明公开了提高蛹虫草固体培养基中虫草菌素含量的方法，该方法包括菌种活化、液体菌种制作、蛹虫草培养3个步骤，其特征在于该方法中取大米粒度为20目和14目按照1∶2的质量比配合作为培养基；采用葡萄糖3％，蛋白胨3.5％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，2mg/L VB₁，水1000mL的配方配制营养液，按照传统的固体发酵方法对蛹虫草进行培养，蛹虫草子座长出后，增加光照强度和时间。本发明的提高蛹虫草固体培养基中虫草菌素含量的方法，可以大幅度提高培养基中虫草菌素的含量(达到0.76％以上)。对提高蛹虫草固体发酵生产虫草菌素的产量和效率具有重要意义；本发明具有方便快捷的优点，适用于蛹虫草固体发酵大规模生产虫草菌素。
文档编号C12P19/40GK101440389SQ200810068949
公开日2009年5月27日 申请日期2008年10月23日 优先权日2008年10月23日
发明者劲 何, 康冀川, 文庭池, 雷帮星 申请人:贵州大学