专利名称：一种红豆杉植物细胞种子稳定培养方法
技术领域：
本发明专利涉及一种细胞种子稳定培养方法，特别是指一种红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，属于种子培养技术领域。
背景技术：
紫杉醇(Taxol)是最早从红豆杉植物树皮中分离提取出来的一种二萜类生物碱，作为治疗晚期卵巢癌、乳腺癌的首选抗癌药，从1992年上市后，因资源缺乏，价格昂贵。目前紫杉醇原料药来源主要有三种途径一种是从红豆杉种植枝叶中提取后得到紫杉醇，但因红豆杉生长缓慢，生产周期长达3飞年，枝叶中紫杉醇含量低，导致紫杉醇的提取成本高。二是通过Baccatin III和1(TDAB等前体半合成紫杉醇，但所需要的半合成前 体也来源于种植枝叶，同样受到提取原料来源的限制，仍然不能满足临床和试验对紫杉醇的大量需求。三是各国科学家采用植物细胞培养技术来解决紫杉醇药源紧缺的问题，通过红豆杉植物细胞大规模培养技术生产紫杉醇被认为是目前替代种植和半合成紫杉醇原料药来源的最重要的途经之一，其特点是1、细胞生产培养周期短、紫杉醇含量高(通过对紫杉醇高产细胞优株筛选和条件优化后，可比原植物提高几十倍)、产量大，成本低；2、细胞培养得到的产物分布简单，杂质含量少，便于后续分离；3、用于提取紫杉醇的原料来源稳定可控，可在人为控制条件下按市场需求在反应器内进行无限、连续、均匀地大规模生产；4、没有化肥、农药或重金属带来的污染，也没有栽培植物所受到的病虫害和细菌的侵害，是真正无菌、无毒的绿色产品；5、不需大量砍伐、采挖植物，保护土地资源，保护了生态平衡；6、除提供紫杉醇外，还可生产各种紫杉烷类前体及其他有抗癌活性的新化合物。中国、美国、加拿大、韩国、日本等国对应用红豆杉植物细胞培养技术生产紫杉醇进行了大量研究，但是科学家的研究热点主要集中在紫杉醇高产上面，至今没有提出一套红豆杉细胞种子长期稳定继代培养的技术方案，因种子质量和生长状态差异太大，生长缓慢，生长过程中会不断产生红色或褐色类物质，种子继代培养时经常出现过敏变红或衰老死亡变褐而失败的技术难题，导致植物细胞培养生产紫杉醇时批次之间的紫杉醇含量稳定性差，是红豆杉植物细胞大规模培养产业化生产紫杉醇面临的共性技术难题，所以尽管从1992年开始进行红豆杉细胞培养产业化生产紫杉醇的技术攻关，至今很少研究团队能进入中试和产业化阶段，没有办法培养质量和生长状态稳定的红豆杉细胞种子是细胞培养失败的主要原因之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种经济可行、工艺简单可控、成本低并能够稳定培养红豆杉植物细胞种子的方法，得到质量和生长状态稳定的种子。本发明的技术方案是这样的该红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，依次包括下述步骤(I)对继代培养的种子进行取样，检测种子终生物量(以干重计，后面相同)、培养液终pH、培养液终电导率、培养液终糖度；(2)根据种子终生物量的大小，通过倒去培养液或加入水，将种子终生物量调整到5 10g/L ；(3)根据培养液终糖度大小，加入糖溶液将种子继代培养时培养液初始糖度提高到 15 25g/L ；(4)根据培养液终电导率大小,加入B5培养基或浓缩B5培养基将种子继代培养时培养液初始电导率提高到2. 5^3. 5mS/cm。(5)将初始生物量控制在2. 5^3. 5g/L，培养液初始pH控制在5. (Γ6. O，搅拌转速控制在l(Tl30rpm，罐压控制在O. 03、. 07Mpa，培养温度控制在25° C，调节通气量大小并通过溶氧电极控制培养液溶氧为20飞0%，在黑暗条件下进行种子继代培养；(6)当步骤(5)中的继代培养的种子，同时满足A、B、C三个条件时A、培养液终糖度大于8g/L ;B、培养液终电导率大于2. 0mS/cm;C、培养液终pH小于6.0 ;按步骤(I广(5)启动下一次种子继代培养。进一步的，上述的红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，种子继代培养时所述的种子初始生物量是3. Og/L，种子终生物量是7. 5g/L。进一步的，上述的红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，种子继代培养时所述的溶氧是20 60%ο进一步的，上述的红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，种子继代培养时所述的搅 拌转速是30rpm,罐压是O. 05Mpa。进一步的，上述的红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，种子继代培养时所述的培养液初始糖度是21g/L，种子培养液终糖度是大于8g/L。进一步的，上述的红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，所述的糖是蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉的其中一种糖或两种及两种以上的糖组合。进一步的，上述的红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，种子继代培养时所述的培养液初始电导率是3. Oms/cm,种子培养液终电导率是大于2. Oms/cm。进一步的，上述的红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，种子继代培养时所述的培养液初始PH是5. (Γ6. O,培养液终pH是小于6. O。进一步的，上述的红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，所述的种子继代时更换B5培养基或浓缩B5培养基占总体积的比例是50飞0%。现有植物细胞培养技术基本处于三角瓶小试规模，工艺控制操作不稳定，没有对继代培养时的种子初始生物量、培养液初始糖度、培养液初始电导率，培养液初始PH参数进行明确定义及相对准确的控制，也没有对继代培养结束后种子终生物量、培养液终糖度、培养液终电导率、培养液终PH参数进行明确定义及进行准确的控制，同时也没有控制种子继代培养时间，导致每次种子继代培养时条件变化太大，种子质量和生长状态难于控制，不断发生过敏变红和衰老死亡现象而培养失败；本发明通过对继代培养的种子质量和种子继代培养的条件进行控制，确保每一次种子继代培养后种子质量和生长状态的稳定。现有技术为了预防种子继代培养出现变红变褐色的现象，添加了维生素C、活性碳等抗褐化剂和氨基酸类营养，虽然可以减少变红变褐现象的发生，但增加了操作难度并增加了污染机会，本发明操作更简单，无须额外添加抗褐化剂和营养物质，培养成功率高。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
，对本发明的权利要求作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明权利要求范围内。
本发明方法的具体步骤如下I、对需要继代培养的种子进行取样，检测种子终生物量、培养液终pH、培养液终电导率、培养液终糖度；2、根据种子终生物量的大小，采用如表11所说的种子继代培养时初始生物量的控制方法，通过倒去培养液或加入水，将种子终生物量调整到5 10g/L ；3、采用如表9所说的培养液初始糖度和培养液终糖度的调控方法，根据培养液终糖度大小，加入糖溶液将种子继代培养时培养液初始糖度提高到15 25g/L ；4、采用如表8所说的培养液初始电导率和培养液终电导率的调控方法，根据培养液终电导率大小，加入B5培养基或浓缩B5培养基将种子继代培养时培养液初始电导率提高到 2. 5 3. 5ms/cm ；5、对种子进行继代培养将培养初始生物量控制在2. 5^3. 5g/L，培养液初始pH控制在5. (Γ6. O,搅拌转速控制在l(Tl30rpm，罐压调为O. 03、. 05Mpa, 25±2°C黑暗条件，灵活调节通气量大小并通过溶氧电极控制溶氧为20飞0%，进行种子继代培养；6、当步骤(5)中的继代培养的种子，当同时满足如下三个条件时A、培养液终糖度大于8g/L ;B、培养液终电导率大于2. Oms/cm ;C、培养液终pH小于6. O ;按步骤f 6方法启动下次种子继代培养。实施例I红豆杉植物细胞种子来源和种子继代培养条件I、材料和培养条件供试材料为本公司筛选实验室诱导筛选并继代培养的中国红豆杉细胞株，以B5为基本培养基，添加 lmg/L NAA、0.2mg/L 6 BA、30g/L 蔗糖、100mg/L Vc 和 292. 8mg/L L 谷氨酰胺作为继代培养基，继代时采用IOOOml的三角瓶内装400ml培养体积，按2:3比例接入红豆杉植物细胞种子和B5培养基，然后将三角瓶置于23 27°C恒温室内的摇床上，以120rpm摇床转速进行振荡培养，细胞继代培养扩14天后作为种子做正交优化试验。2、细胞培养物样品的检测方法①细胞鲜重的测定细胞培养物用120目尼龙筛网滤过，细胞用水冲洗三次后，再用干纱布吸干细胞表面水分，在电子天平上称其重量，用g/L表示。②细胞干重的测定，鲜细胞置于恒温烘箱中，60°C烘干至恒重，用电子天平称其重量，用g/L表示。③糖度测定用糖度仪(北京万成北增精密仪器有限公司)测定，用g/L表示。④pH测定用pHS 25型pH计(上海精密科学仪器有限公司)测定。⑤电导率测定用DDSllA型电导率仪(上海雷磁仪器有限公司)测定，用ms/cm表
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⑥溶氧测定采用梅特勒溶氧电极在线检测，用％表示。3、生长条件优化方法60ml B5培养基装入250ml三角瓶内，培养基根据选取的正交表配方配制，接入40ml中国红豆杉种子培养基中，在23 27°C、120rpm摇床转速及黑暗条件下进行生长试验。实施例2初始生物量、种子培养时间和培养液初始糖度对中国红豆杉细胞生长的影响60ml培养基装入250ml三角瓶内，以B5培养基为基础配方，添加lmg/L NAA和 0.2mg/L的6 BA，根据表I和表2的4因素3水平L9 (34)正交试验表配制成25g/L、16g/L、10g/L蔗糖浓度的不同培养基配方，接入40ml的细胞种子后使培养物中的初始生物量分别为I. 87 g/L、2. 81 g/L和3. 74 g/L，然后将摇瓶均匀置于25±2°C的恒温室内的摇床上，以120 rpm摇床转速进行振荡培养，细胞种子继代培养到第7、9、11天取样，检测培养物中的细胞终生物量和培养液终pH、培养液终电导率、培养液终糖度。从表I和表2正交试验可得到如下结论I、种子初始生物量在2. 81 g/L时，每升培养物中每克细胞每天鲜重和干重的增加速度都最快，而种子初始生物量在I. 87 g/L和3. 74 g/L时细胞生长速度明显要慢，特别是在I. 87 g/L较低初始生物量时生长最慢，证明细胞生长有一最低密度效应，和现有文献研究结果相同，因此将合适的细胞种子初始生物量定在2. 5^3. 5g/L之间。2、种子培养时间对细胞生长的影响在细胞生长的前期7、天，有利于鲜重的增力口，而后期扩11天有利于干重的增加，综合鲜干重数据，在第扩11天进行细胞种子继代培养比较合适。3、培养液初始糖度对细胞生长的影响培养液初始糖度10g/L时，细胞生长速度明显要快，培养液初始糖度为16g/L和25g/L时细胞生长要慢，过高的培养液初始糖度减慢了细胞的生长速度，结合2的结论种子在第911天进行继代培养比较合适，按糖度平均消耗为O. 26g/L/d/g为依据，为了确保种子生长状态和质量能维持稳定，将合适的培养液初始糖度定在15 25g/L。表I L9 (34)正交试验设计表
权利要求
1.一种红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，其特征在于，依次包括下述步骤 (1)对继代的种子进行取样，检测种子终生物量、培养液终pH、培养液终电导率、培养液终糖度； (2)根据种子终生物量的大小，通过倒去培养液或加入水，将种子终生物量调整到5 10g/L ； (3)根据种子培养液终糖度大小，加入糖溶液将种子继代培养时培养液初始糖度提高到 15 25 g/L ； (4)根据种子培养液终电导率大小,加入B5培养基或浓缩B5培养基将种子继代培养时培养液初始电导率提高到2. 5^3. 5 ms/cm ； (5)将培养初始生物量控制在2.5^3. 5g/L，种子继代培养时培养液初始pH控制在5.0 6. O，搅拌转速控制在l(Tl30rpm，罐压控制在0. 03 0. 07Mpa，25±2°C黑暗条件，调节通气量大小并通过溶氧电极控制溶氧为20飞0%，进行种子继代培养； (6)当步骤(5)中的继代培养的种子，同时满足A、B、C三个条件时A、培养液终糖度大于8g/L ;B、培养液终电导率大于2. Oms/cm ;C、培养液终pH小于6. 0 ;按步骤(1) (5)启动下一次种子继代培养。
2.根据权利要求I所述的红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，其特征在于，种子继代培养时所述的种子初始生物量控制在3. Og/L，种子终生物量控制在7. 5g/L。
3.根据权利要求I所述的红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，其特征在于，种子继代培养时所述的溶氧控制在30 50%。
4.根据权利要求I所述的红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，其特征在于，种子继代培养时所述的搅拌转速控制在30rpm，罐压控制在0. 05Mpa，培养温度控制在25° C，在黑暗条件下进行培养。
5.根据权利要求I所述的红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，其特征在于，种子继代培养时所述的培养液初始糖度是21g/L，种子培养液终糖度大于8g/L。
6.根据权利要求I所述的红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，其特征在于，所述的糖是蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉的其中一种糖或两种及两种以上的糖组合。
7.根据权利要求I所述的红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，其特征在于，种子继代培养时所述的培养液初始电导率是3. Oms/cm,种子培养液终电导率大于2. Oms/cm。
8.根据权利要求I所述的红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，其特征在于，种子继代培养时的培养液初始PH范围是5. (T6. 0，培养液终pH小于6. O。
9.根据权利要求I所述的红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，所述的种子继代培养时更换B5培养基或浓缩B5培养基体积占总体积的比例是5(T60%。
全文摘要
本发明公开一种红豆杉植物细胞种子稳定培养方法，旨在提供一种经济可行、工艺简单可控、成本低并能够稳定培养红豆杉植物细胞种子的方法；该方法是1)对继代种子取样检测；2)种子终生物量调整到5~10 g/L；3)培养液初始糖度提高到15~25 g/L；4)培养液初始电导率提高到2.5~3.5ms/cm；5)培养初始生物量控制在2.5~3.5g/L，初始pH控制在5.0~6.0，搅拌进行种子继代培养；6)当步骤5)中的继代培养的种子满足A、培养液终糖度大于8g/L或B、培养液终电导率大于2.0ms/cm或C、培养液终pH小于6.0；按步骤1)~5)启动下一次种子继代培养；属于种子培养技术领域。
文档编号C12N5/04GK102965329SQ20121050620
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者李干雄, 侯云屏, 古志渊, 骆雪兰, 曾腾锋, 吴永艳, 肖华 申请人:广东科伦药业有限公司