专利名称：一种用于同时检测5种猪病病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒及引物和探针的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种用于检测猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒及引物和探针，可实现一次采样，一次分析，同时检测5种猪病的目的，属于检验检疫领域。
背景技术：
猪流感病毒(SIV)、猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、口蹄疫病毒(FMDV)是引起猪呼吸道疾病、繁殖障碍和消化道疾病的主要常见病原，是危害养猪业最为严重的几种病原，被世界动物卫生组织规定为跨界传播病原，也是我国动物及动物产品国际贸易中重要的检疫对象。
目前，针对上述5种猪病病原建立了多种分子检测技术，如PCR和荧光PCR技术等，在这些疫病的诊断和防控中发挥了重要的作用。但目前所建立的方法多是针对一种病原的单独检测技术，在实际检测中需要重复多次完成检测不同病原的目的，检测工作量大且时间长，不能满足大批量动物检疫快速通关的实际需要。且难以实现现地样品中大量存在的混合感染以及症状相似疫病的鉴别诊断。在建立单独疫病检测技术的同时，各国兽医机构也相继研制了可同时检测猪常见病毒的多重PCR及多重荧光PCR，但传统PCR技术灵敏度低、结果不易判定等缺点限制了其在多重检测中的应用，而荧光PCR由于不同探针采用的突光集团所发射的突光存在相互干扰，且突光PCR仪对不同波长突光分辨的局限性也限制了荧光PCR多重检测技术的发展。多重连接探针扩增技术(Multiplexligation-dependent probeamplification, MLPA)由荷兰的Schouten博士首先发明，是一种操作简便、成本低廉的新型技术，目前在遗传疾病、基因甲基化分析等多个领域中得到了广泛应用。MLPA的原理是将核酸的杂交检测和PCR链式扩增相结合，从而实现靶分子的高效特异性分析。其核心技术是合成序列特异的长探针和短探针。短探针由两段核苷酸组成，一段是PCR扩增的通用引物，一段是病毒特异性序列。长探针由三段核苷酸组成，除了 PCR扩增的通用引物和病毒特异性序列外，在两者之间还加入特定大小的填充序列(指纹序列)。当MLPA的两种探针结合到彼此相邻的靶序列上的时候，在连接反应时，长探针就和短探针发生连接，生成一条两端分别含有上下游通用引物的全长探针，并在通用引物的扩增之下，使模板成链式放大，实现靶分子的高灵敏度检测，其检测极限可达3000-6000个靶分子拷贝。MLPA并不是扩增病毒特异的靶序列，而是扩增与病毒靶序列结合的探针，换句话说，首先是给每种病毒的长探针加入特定大小的指纹序列，然后通过通用引物将不同的“指纹”扩增表现出来，最后通过对“指纹”的分析，实现多种核酸的检测，同时序列特异的两段探针确保了每种病原的指纹具有高度的特异性。MLPA在扩增灵敏性、特异性等方面是对传统PCR方法的显著改进，同时其良好的多重性能，一次反应可以实现45种以上靶分子的检测，也突破了实时荧光PCR在多重性方面的“瓶颈”。
本研究利用多重连接探针扩增技术(MLPA)在核酸检测方面具有的特异、敏感，适合多重检测等优点，建立了 SIV、PRRSV, PRV、TGEV, FMDV五种猪病病原的MLPA检测方法并组装成试剂盒，在国内外首次实现一次采样，一次分析，检测5种重要猪病的目的，不仅减少了检测的工作量和成本，且能在最短的时间内完成疫病的检测，为疾病防制争得时间。
发明内容
本发明的第一个目的是提供特异性强、灵敏度高的同时检测猪流感病毒(SIV)、猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和口蹄疫病毒(FMDV)的多重连接探针及一对通用引物。本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的同时检测猪流感病毒(SIV)、猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和
口蹄疫病毒(FMDV)的多重连接探针扩增检测试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案在序列比对分析的基础上，针对猪流感病毒M基因、猪繁殖与呼吸道综合征病毒N基因、伪狂犬病病毒gB基因、猪传染性胃肠炎病毒S基因、口蹄疫病毒3D基因，分别设计一对长探针和短探针(序列见表I )，同时设计一对PCR扩增的通用引物(序列见表2)。短探针由两段核苷酸组成，一段是PCR扩增的通用引物，一段是病毒特异性序列；长探针由三段核苷酸组成，除了 PCR扩增的通用引物和病毒特异性序列外，在两者之间还加入特定大小的填充序列；且位于右侧的探针5'端进行磷酸化处理。通过在上述5种病毒的长探针中加入不同长度的填充序列，然后通过病毒模板变性、探针杂交、连接及通用引物PCR扩增得到不同大小的PCR产物，通过毛细管电泳分析后实现对5种病毒的同时检测。表I 猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒短探针和长探针名称和序列
权利要求
1.用于同时检测猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒和口蹄疫病毒的引物和多重连接探针，其特征在于，所述多重连接探针如序列表SEQ ID NO :1 至 SEQ ID NO : 10 所示，所述引物如序列表 SEQ ID ΝΟ:11 至 SEQ ID NO:12 所/Jn ο
2.根据权利要求I所述的引物和多重连接探针，其特征在于，所述序列SEQID ΝΟ1和SEQ ID NO 2分别为检测猪流感病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO 3和SEQID NO :4分别为检测猪繁殖与呼吸道综合征病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO5和SEQ ID NO 6分别为检测伪狂犬病病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO 7和SEQ ID NO :8分别为检测猪传染性胃肠炎病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO 9和SEQ ID NO: 10分别为检测口蹄疫病毒的短探针和长探针，其中，所述SEQ ID NO :2，SEQID NO :3，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO 8 和 SEQ IDNO 10 的 5’ 端进行磷酸化处理。
3.—种检测猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒和口蹄疫病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒，其包括以下组分 (1)MLPA缓冲液； (2)探针混合物，其包括如序列表SEQID NO: I至SEQ ID NO :10所示的用于检测猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒和口蹄疫病毒的多重连接探针，其中，所述 SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO :8 和 SEQID NO : 10的5’端进行磷酸化处理； (3)连接反应液，其包括Ligase-65缓冲液A和Ligase-65缓冲液B； (4)Ligase_65连接酶； (5)PCR反应液，其包括如序列表SEQ ID NO: 11至SEQ ID N0:12所示的引物； (6)SALSA聚合酶； (7)无RNA酶的灭菌纯化水； (8)阴性对照； (9)阳性对照。
4.根据权利要求3所述的多重连接探针扩增检测试剂盒，其特征在于，所述序列SEQID NO 1和SEQ ID NO 2分别为检测猪流感病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :4分别为检测猪繁殖与呼吸道综合征病毒的短探针和长探针；所述序列SEQID NO :5和SEQ ID NO :6分别为检测伪狂犬病病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ IDNO :7和SEQ ID NO :8分别为检测猪传染性胃肠炎病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ IDNO 9和SEQ ID NO 10分别为检测口蹄疫病毒的短探针和长探针。
全文摘要
本发明公开了一种用于同时检测5种猪病病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒及引物和探针。所述多重连接探针如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO10所示，所述引物如序列表SEQ ID NO11至SEQ ID NO12所示。使用本发明所述的引物、探针，和/或包含该引物和探针的多重连接探针扩增检测试剂盒可同时检测猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒5种重要猪病病原，节约了检测时间和成本，有利于疫病的及时确诊。
文档编号C12Q1/70GK102943129SQ20121050596
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者马贵平, 史喜菊, 乔彩霞, 郭志红, 张伟 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局