专利名称：细胞培养生产新疆雪莲总黄酮的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过组织和细胞培养生产新疆雪莲总黄酮的方法。具体讲是以植物细胞培养技术为手段，通过在细胞生物反应器内进行的新疆雪莲大规模细胞培养生产总黄酮的方法。本发明属于生物制药领域。
背景技术：
由于新疆雪莲生长环境特异，天然生长缓慢，人工栽培困难，并且自然资源有限，难以满足临床上日益增长的需求，迫切需要采用新的手段来解决这一现实问题。植物细胞培养技术作为现代生物技术的一个重要分支，经过越来越多的学者的努力，已经呈现出良好的发展前景。进行新疆雪莲细胞的大规模培养，既可以解决天然资源匮乏的问题，又可以满足人们的健康要求。目前，我国已经有多家单位先后进行了雪莲细胞培养的研究，并取得了一些基础性的研究成果。
但是，在目前所能够见到的文献中，对新疆雪莲的研究大多数是集中在其化学成分、药理、生理功能、分析方法等方面上，在细胞培养方面罕有报导。印度有少数的学者进行了新疆雪莲保藏方法的研究，而中国科学院植物研究所的赵德修等人则对水母雪莲细胞培养的基础条件进行了较为系统的研究，并尝试在2升搅拌式生物反应器中进行了水母雪莲细胞的悬浮培养初步研究。
Arora R.等人发现，将雪莲种子放在含有0.5μmol/l NAA的MS培养基上诱导发芽时，其发芽比例可以达到90％。将诱导得到的雪莲芽在5℃的暗环境中储存12月并且不进行继代，其成活率为100％。如果将雪莲芽进行低温处理6个月或者更长的时间，然后将其放回培养间，会发现其生长速率比未经低温处理的芽的生长速率更快。
赵德修等人使雪莲种子萌发出幼苗，然后使用幼苗在MS、AG-7和B53种基本培养基上进行了愈伤组织的诱导，发现愈伤组织在MS外加0.2mg6-BA/l和2mg NAA/l的培养基上生长良好。在诱导得到的愈伤组织中，抗癌有效成分jaceosidin的含量为0.04mg/g干细胞，是天然水母雪莲原植物含量的25％。
赵德修等人在研究培养温度、苯丙氨酸对固体培养细胞的生长和黄酮形成的影响时发现，25℃有利于细胞的生长，苯丙氨酸对细胞的生长未见有促进作用，但是有利于细胞中黄酮的形成。经过高产细胞系的筛选，可以使细胞中总黄酮的含量达到1.9％，jaceosidin的含量为0.42％，分别是原始愈伤组织的2.6倍和4.2倍。
刑建民等人在2升搅拌式生物反应器中进行了水母雪莲细胞的悬浮培养。与摇瓶培养相比，雪莲细胞的生长速度明显下降，并且糖的利用也不充分，经过12天的培养，到结束时培养基中仍然在残留24.3g/l的糖。在培养的过程中，DO值变化很大，从培养开始的85％逐渐下降到第5--8天的30％左右，然后又开始回升，到第12天上升到50％。与摇瓶培养相比，雪莲细胞在反应器内的生物量和黄酮含量都发生了明显的降低，生物量从22.45g/l降到了10.35g/l，黄酮含量从占细胞干重的5.89％降到了4.14％，黄酮产率从1323.4mg/l降到了428.6mg/l。
分析上述已经进行的研究可以看出，它们都是单独从培养基成分或者培养条件着手来进行优化，而且所研究的试材均为水母雪莲。我们认为虽然基因型、外植体类型、培养基和培养条件都有各自不可忽视的作用，但是它们都是通过对愈伤组织或者培养的细胞的生理状态来起作用的，因而对培养的愈伤组织和细胞的生理状态进行调控才是最根本的手段。
我们经多年的时间，在分析、研究国内外雪莲研究成果的基础上，系统地研究了植物组织细胞培养技术应用到新疆雪莲有效成分总黄酮生产的理论、工艺及可行性，包括从材料选择、外植体诱导、高频细胞株的保存、悬浮培养系的建立到分离、纯化等过程，完成了实验室和中试研究，实现了一个培养周期可收获总黄酮4.12％(培养物干重)的结果，使下一步产业化更具有实际意义，并为此提供了可能与保障。
发明内容
本发明的目的，在于提供一种提高新疆雪莲细胞大规模培养生产总黄酮的方法，该方法不仅能明显提高新疆雪莲细胞培养液中总黄酮的含量，而且更有利于达到产业化水平。
本项目经多年研究，根据新疆雪莲培养细胞生产总黄酮的特殊机理，首创了采用气升式细胞悬浮培养技术，很好地控制了细胞的生长过程，缩短了缓慢生长期，延长了平稳生长期，进而缩短了培养周期，降低了成本，提高总黄酮产量。为了实现本发明的目的，本发明的技术路线如下将新疆雪莲的外植体进行离体培养，筛选高产细胞株，转入细胞种子培养，然后进行细胞大规模培养。细胞培养液经过分离，纯化等处理，得到总黄酮晶体。
本发明所筛选的高产细胞株已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为CGMCC 0610，保藏日期是2001年8月7日。
在上述基础上的新疆雪莲愈伤组织继代保存15天为一周期，细胞种子培养10天为一继代周期，细胞反应器培养10-15天为一周期。
本发明所用的培养基为MS培养基，培养基中添加萘乙酸(NAA)和6-苄基嘌呤(6-BA)，添加用量为NAA 0-3.5mg/L、6-BA 0-3.0mg/L。
上述的培养基中需添加蔗糖1.5-2.5％，并调PH值4.5-7.5。
上述的培养条件为8h/d光照，2000Lx光照强度，温度24℃±1。
培养结束后采用｀H-NMR，13C-NMR，HMQC，HMBC以及CD谱对总黄酮平面和立体机构进行测定。
本发明的最佳离体培养条件是MS培养基附加NAA3mg/l+6-BA0.3mg/l+蔗糖30％本发明提出的新疆雪莲大规模培养的方法是采用2L气升式细胞反应器(中国科学院生化中心有售)作种子罐，培养10-15天，培养条件为温度22-26℃，最佳为24±1℃，光照最佳时间为8小时/天，光照强度800-2000LX，最佳为1000LX。以20L气升式细胞反应器作为生产罐。培养条件为培养温度24±1℃，光照8h/d，光照强度1000LX，培养时间10-15天。
经过上述发酵培养之后，进行分离纯化，本发明雪莲总黄酮的分离和纯化过程如下细胞培养液下罐后，在60℃以下烘干培养物，通过HPLC过柱。具体方法是，将雪莲培养品60℃减压干燥至恒重，研磨成粉，取本品粉末1.0g，精密称定(AH1.0003g)，置100ml量瓶，加100ml甲醇，放置24hr，超声萃取40min，滤过，回收甲醇，残渣加适量水(3～5ml)使溶解(难溶部分超声溶解)，放冷，通过聚酰胺层析柱(60～85目，约10g，内径1cm，长度15cm，湿法装柱)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用50％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，并定容至100ml，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液，上色谱柱，甲醇∶水∶冰醋酸(V∶V∶V＝40∶60∶1.0)为流动相；检测波长257nm，流量1.0ml/min，灵敏度0.02AUFS，柱温室温，进样量10μl，进行分离，收集获得总黄酮晶体。结果见附图检测图谱(图1)。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇∶水∶冰醋酸(40∶60∶1.0)为流动相；检测波长257nm。
对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品适量，用甲醇制成每1ml含3.8。
经过本发明培养方法获得的培养物与其他培养方法获得培养物在雪莲总黄酮含量方面存在较大差异，本发明方法获得的培养物总黄酮含量明显提高。通过3种培养方式获得培养物的总黄酮产量差异结果见下表。
三种不同培养方式对细胞总黄酮产量的影响培养方式细胞成活率(％)总黄酮产量(mg/l)摇瓶培养 70.2 1295搅拌培养(5L) 88.3 1944气升式培养 98.6 3137从表中可以看到，气升式细胞反应器培养的雪莲细胞聚集体的比生长速率和黄酮类化合物的含量都明显高于摇瓶培养和搅拌培养时的对应值，表明细胞聚集体在堆积培养时处于较好的生长状态。在培养时，0.08m3/h的通气量能够使细胞较好地生长并合成黄酮类化合物。由于摇瓶培养存在大量的细胞聚集在一起，通气不畅造成细胞生长不利。而搅拌培养则存在明显的细胞剪切力问题。因为新疆雪莲细胞对剪切力很敏感。气升式细胞反应器则无上述两种情况。
图1是从本发明培养的新疆雪莲获得的总黄酮的色谱检测图谱。
实施例将保藏的新疆雪莲细胞株在2L气升式细胞反应器(中国科学院生化中心有售)中进行种子培养，培养15天，培养条件为MS培养基，附加NAA3mng/l，6-BA0.3mg/l，蔗糖30％，PH值6，温度24±1℃，光照时间为8小时/天，光照强度1000LX。将种子培养15天后，按20％接种量接种至20L气升式细胞反应器细胞罐中，在无菌条件下培养，培养条件为培养温度24±1℃，光照8h/d，光照强度1000LX，培养时间15天。细胞培养的培养基组成与上述种子液培养基组成相同，通气量200ml/min。
细胞培养液下罐后，在60℃以下烘干培养物，将雪莲培养品60℃减压干燥至恒重，研磨成粉，取本品粉末1.0g，精密称定(AH1.0003g)，置100ml量瓶，加100ml甲醇，放置24hr，超声萃取40min，滤过，回收甲醇，残渣加适量水(3～5ml)使溶解(难溶部分超声溶解)，放冷，通过聚酰胺层析柱(60～85目，约10g，内径1cm，长度15cm，湿法装柱)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用50％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，并定容至100ml，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液，上色谱柱，甲醇∶水∶冰醋酸(V∶V∶V＝40∶60∶1.0)为流动相；检测波长257nm，流量1.0ml/min，灵敏度0.02AUFS，柱温室温，进样量10μl，进行分离，收集获得总黄酮晶体。
权利要求
1.一种通过微生物发酵生产新疆雪莲总黄酮的方法，其特征在于该方法包括在MS培养基上进行种子培养和大规模发酵培养，干燥培养物，并分离和纯化得到新疆雪莲总黄酮，所说种子的保藏号是CGMCC0610。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于种子培养10天为一周期，发酵培养10-15天为一周期。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于种子培养条件为温度24±1℃，光照时间为8小时/天，光照强度800-2000LX。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于发酵培养的培养条件为培养温度24±1℃，光照8h/d，光照强度1000LX-2000Lx，培养时间10-15天。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于培养基采用MS培养基，并添加萘乙酸-3.5mg/L，6-苄基嘌呤0-3.0mg/L，蔗糖1.5-2.5％，并调PH值4.5-7.5。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于细胞培养液下罐后，通过HPLC过柱，分离获得雪莲总黄酮晶体。
7.根据权利要求7的方法，其特征在于细胞培养液下罐后，60℃减压干燥，研磨成粉，取本品粉末1.0g，置100ml量瓶，加100ml甲醇，放置24hr，超声萃取40min，滤过，回收甲醇，残渣加水3～5ml使溶解，放冷，通过聚酰胺层析柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用50％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，并定容至100ml，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液，上色谱柱，分离，收集获得总黄酮晶体。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于聚酰胺层析柱的装柱为60～85目，约10g，内径1cm，长度15cm，湿法装柱。
9.根据权利要求7的方法，其特征在于高效液相色谱柱的条件为甲醇水∶冰醋酸V∶V∶V＝40∶60∶1.0为流动相；检测波长257nm，流量1.0ml/min，灵敏度0.02AUFS，柱温室温，进样量10μl。
10.根据权利要求1的方法，其特征在于所说的大规模细胞培养采用气升式细胞反应器进行深层细胞培养。
全文摘要
本发明提供了一种采用气升式生物反应器大规模培养新疆雪莲,从培养液中分离提取新疆雪莲总黄酮的方法。该方法是在MS培养基上培养发酵的种子,再将种子转移到20L生物反应器中进行大规模培养。然后对反应器中的培养液进行分离、纯化获取新疆雪莲总黄酮7.1%,纯度99%,本发明方法生产成本低,不污染环境,达到了产业化水平。
文档编号C12N5/04GK1337467SQ01124108
公开日2002年2月27日 申请日期2001年8月13日 优先权日2001年8月13日
发明者贾景明, 张剑侠, 吴立军 申请人:贾景明, 张剑侠, 吴立军