一种葛根总黄酮的纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中草药检测技术领域，具体是指一种葛根总黄酮的纯化方法。
【背景技术】
[0002] 葛根，中药名。为豆科植物野葛的干燥根，习称野葛。秋、冬二季采挖，趁鲜切成厚 片或小块；干燥。甘、辛，凉。有解肌退热，透疹，生津止渴，升阳止泻之功。常用于表证发 热，项背强痛，麻疹不透，热病口渴，阴虚消渴，热泻热痢，脾虚泄泻。
[0003] 目前已经对葛根的化学和药理作用进行了许多研究，主要有效成分三萜皂苷和黄 酮类化合物。其中，黄酮类成分具有明显的抗溃疡、解痉、抗炎、降血脂、镇痛和雌性激素样 作用。近年来还发现葛根黄酮对艾滋病毒有很强的抑制增殖作用，对葛根黄酮的研究应用 已引起了人们的重视，葛根中黄酮，主要以二氢黄酮类化合物为主。
[0004] 从葛根中提取纯化总黄酮，主要有经典醋酸乙酯萃取法，大孔吸附树脂法，聚酰胺 分离纯化总黄酮也有应用，但未见详细报道。由于萃取法需使用大量的有机溶剂，在实际生 产中，受到一定限制。另外，葛根中总黄酮中含有大量的脂溶性成分，其提取物的水分散液 中有大量难以分散的沉淀，也限制了大孔吸附树脂在葛根黄酮纯化上的应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于：提供一种葛根总黄酮的纯化方法。
[0006] 本发明通过下述技术方案实现：一种葛根总黄酮的纯化方法，具体技术方案如下： 包括以下步骤： 1)葛根提取液的制备 取葛根总黄酮提取物〇.20g，精密称定，至100mL容量瓶中，加甲醇80ml，超声处理，放 冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过即得。
[0007] 2)葛根总黄酮提取 取葛根饮片，用6倍量的95%乙醇回流提取2次，I. 5h -次，过滤，回收乙醇至含药材 lg/ml ； 3) 预处理聚酰胺 称取聚酰胺细粉60-100目，用乙醇回流至少1次，Ih/次，湿法装柱，用2BV95%乙醇 过柱，再用水洗至无醇味； 4) 确定葛根中药材与聚酰胺的上样比 5) 确定径高比 6)选择洗脱剂 取上述葛根提取液10ml7份，聚酰胺拌样上柱，用水洗至洗脱液无色，在分别用40%、 50%、60%、70%、80%、90%和95%乙醇洗脱，收集IOBV洗脱液，测定洗脱液中总黄酮的含量。
[0008] 进一步地，为了更好的实现本发明，还包括以下技术特征，所述步骤5)确定径高比 的方法为，取预先处理过的聚酰胺树脂，分别装于1 :4、1:7、1 :10的三根层析柱中，取葛根 提取液，聚酰胺拌样上柱，用水洗脱至洗脱液无色，然后用95%乙醇洗脱，收集BV洗脱液中 总黄酮含量。
[0009] 进一步地，为了更好的实现本发明，还包括以下技术特征，所述确定葛根中药材与 聚酰胺的上样比的方法为：取2、5、5、7、5、10、15、20ml上述提取液加入步骤3)预处理过的 聚酰胺混合均匀，挥干，上聚酰胺柱，用水洗至洗脱液无色，然后用乙醇洗脱，收集IOBV洗 脱液，测定洗脱液中总黄酮含量。
[0010] 进一步地，为了更好的实现本发明，还包括以下技术特征，所述葛根中药材与聚酰 胺酯的上样量比为3:1。
[0011] 进一步地，为了更好的实现本发明，还包括以下技术特征，所述树脂径高比不超过 1 :7。
[0012] 进一步地，为了更好的实现本发明，还包括以下技术特征，所述洗脱剂为70%乙 醇。
[0013] 进一步地，为了更好的实现本发明，还包括以下技术特征，所述洗脱速度为2BV/h。
[0014] 进一步地，为了更好的实现本发明，还包括以下技术特征，所述洗脱液用量为5BV。
[0015] 本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果： 本发明所采用的葛根总黄酮的纯化方法，与现有技术比较，操作更方便，且消耗的有机 溶剂少，工业生产中的纯化成本低，利于工业生产。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0017] 实施例1 : 1、仪器与试剂 FA2004N电子天平，生产厂家：上海精密科学科技有限公司；SB2200超声波清洗器，生 产厂家：上海科导超声仪器有限公司，DZF型真空干燥箱，生产厂家：上海精密实验设备有 限公司，Angilent :型号8453型紫外分光光度计，Buchi R-200型旋转蒸发器，柚皮苷对照 品，来源：中国药品生物制品检定所，葛根药材，生产厂家上海华宇药业有限公司。
[0018] 2、实验方法 葛根黄酮提取物样品液的制备：取葛根黄酮提取物约〇. 20g，精密成定，至100mL容量 瓶中，加甲醇80ml，超声处理90min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过即得。
[0019] 3、葛根总黄酮提取 取葛根饮片，用6倍量的95%乙醇回流提取至少1次，I. 5h/次，过滤，回收乙醇至含药 材 lg/ml〇
[0020] 聚酰胺的预处理 取聚酰胺细粉60- 100目，用5倍量乙醇回流2次，Ih/次，湿法装柱，用2BV95%乙醇 洗脱，再用水洗至无醇味。
[0021]葛根中药材与聚酰胺的上样量比 取2、5、5、7、5、10、15、20ml上述葛根黄酮提取物样品液，加入适量预处理过的聚酰胺 混合均勾，挥干，上聚酰胺柱，规格为I. 6cmxl0cm，用水洗至洗脱液无色，然后用95%乙醇细 脱，收集IOBV洗脱液，测定洗脱液中总黄酮的含量，计算收率。结果如下表， 葛根总黄酮收率=(洗脱液中葛根总黄酮量X100)/上样总黄酮量
随着葛根中药材/聚酰胺的比值增大，葛根总黄酮收率有下降趋势，当超过2 :1时，葛 根总黄酮损失20%以上，因此，葛根中药材与聚酰胺的比值不大于2 :1。
[0022] 确定径高比： 取预先处理过的聚酰胺树脂，分别装于径高比1:4、1:7、1:10的三根层析柱中，取 上述葛根提取液适量，聚酰胺拌样上柱，用水洗至洗脱液无色，然后用95%乙醇洗脱，收集 IOBV洗脱液，测定洗脱液中总黄酮含量，计算收率。结果如下表：
随着径高比的增加，总黄酮收率下降，确定树脂径高比应不超过1 :7。
[0023] 确定洗脱剂： 取上述葛根提取液10ml7份，聚酰胺拌样上柱（I. 6cmX IOcm)，用水洗至洗脱液无色， 再分别用40%、50%、60%、70%、80%、90%和95%乙醇洗脱，收集IOBV洗脱液，测定洗脱液中总 黄酮的含量，计算总黄酮的收率。减压挥干乙醇，恒重，计算提取物纯度。结果如下表：
随着洗脱溶剂乙醇浓度的降低，提取物纯度提高，但收率下降，综合考虑纯度和收率， 确定70%乙醇为洗脱溶剂。
[0024] 流出曲线， 取上述葛根提取液l〇ml，聚酰胺拌样上柱（I. 6cmX 10cm)，用水洗至洗脱液无色，再用 70%乙醇为洗脱剂洗脱，洗脱流速分别为0. 5BV/h、lBV/h、2BV/h，分段手机洗脱液。每1一 2BV收集1份，共收集10份，测定。
[0025] 洗脱流速分别为0. 5BV/h，lBV/h，2BV/h，流出曲线无明显差异，洗脱剂用量为5BV 时，已基本洗脱完全，故确定用洗脱流速2BV/h，洗脱剂用量为5BV，合并前5BV洗脱液，测定 收率为89. 06% 以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本 发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围 之内。
【主权项】
1. 一种葛根总黄酮的纯化方法，其特征在于步骤如下： 1) 葛根提取液的制备 取葛根总黄酮提取物〇.20g，精密称定，至100mL容量瓶中，加甲醇80ml，超声处理，放 冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过即得； 2) 葛根总黄酮提取 取葛根饮片，用6倍量的95%乙醇回流提取2次，I. 5h -次，过滤，回收乙醇至含药材 lg/ml ； 3) 预处理聚酰胺 称取聚酰胺细粉60-100目，用乙醇回流至少1次，Ih/次，湿法装柱，用2BV95%乙醇 过柱，再用水洗至无醇味； 4) 确定葛根中药材与聚酰胺的上样比 5) 确定径高比 6) 选择洗脱剂 取上述葛根提取液10ml7份，聚酰胺拌样上柱，用水洗至洗脱液无色，在分别用40%、 50%、60%、70%、80%、90%和95%乙醇洗脱，收集IOBV洗脱液，测定洗脱液中总黄酮的含量。2. 根据权利要求1所述的一种葛根总黄酮的纯化方法，其特征在于：所述步骤5)确定 径高比的方法为，取预先处理过的聚酰胺树脂，分别装于1 :4、1:7、1 :10的三根层析柱中， 取葛根提取液，聚酰胺拌样上柱，用水洗脱至洗脱液无色，然后用95%乙醇洗脱，收集BV洗 脱液中总黄酮含量。3. 根据权利要求1所述的一种葛根总黄酮的纯化方法，其特征在于：所述确定葛根中 药材与聚酰胺的上样比的方法为：取2、5、5、7、5、10、15、20ml上述提取液加入步骤3)预 处理过的聚酰胺混合均匀，挥干，上聚酰胺柱，用水洗至洗脱液无色，然后用乙醇洗脱，收集 IOBV洗脱液，测定洗脱液中总黄酮含量。4. 根据权利要求3所述的一种葛根总黄酮的纯化方法，其特征在于：所述葛根中药材 与聚酰胺酯的上样量比为3:1。5. 根据权利要求3所述的一种葛根总黄酮的纯化方法，其特征在于：所述树脂径高比 不超过1 :7。6. 根据权利要求5所述的一种葛根总黄酮的纯化方法，其特征在于：所述洗脱剂为70% 乙醇。7. 根据权利要求6所述的一种葛根总黄酮的纯化方法，其特征在于：所述洗脱速度为 2BV/h〇8. 根据权利要求7所述的一种葛根总黄酮的纯化方法，其特征在于：所述洗脱液用量 为 5BV。
【专利摘要】本发明公开了一种葛根总黄酮的纯化方法，包括如下步骤：葛根提取液的制备，取葛根黄酮提取物约0.20g，精密称定，至100ml容量瓶中，加甲醇80ml，超声处理，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过即得；葛根总黄酮提取，取葛根饮片，用6倍量的95%乙醇回流提取2次，1.5h一次，过滤，回收乙醇至含药材1g/ml；预处理聚酰胺；称取聚酰胺细粉60—100目，用5倍量乙醇回流2次，1h/次，湿法装柱，用2BV95%乙醇过柱，再用水洗至无醇味；确定葛根中药材与聚酰胺的上样比；确定径高比；选择洗脱剂；该方法纯化得到的总黄酮成分及种类损失小，总黄酮收率高。
【IPC分类】A61K36/488, A61P3/06, A61P21/02, A61P25/00, A61P15/00, A61P31/18, A61P1/04, A61P29/00, A61P1/06
【公开号】CN105079088
【申请号】CN201510486758
【发明人】周洁
【申请人】成都易创思生物科技有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月11日