专利名称：一种天然植物来源的总黄酮的制备方法
技术领域：
本发明属于植物技术领域，具体为一种天然植物来源的总黄酮的制备方法。
背景技术：
天然黄酮类化合物是一类广泛存在于植物界的重要的生物活性物质，广泛存在于不同科属植物中，主要存在于芸香料、唇形科、豆科、伞形科、银杏科与菊科中。据研究，约有 20%的中草药中含有黄酮类化合物，可见其资源之丰富。黄酮类化合物可以直接从食物中获得，也可以从富含黄酮类化合物的植物中提取，它不仅能作为防治心脑血管疾病的药物， 而且有明显的抗脂质过氧化、抗衰老、清除自由基，降血脂、降低胆固醇、降血糖，抗癌防癌、 免疫调节等生理活性，是一种在人类的营养、健康和老年退行性疾病的防治上有着广阔应用前景的药物，也是应用前景广泛的天然抗氧剂，防腐剂，可用于研制多种保健食品和化妆品。因此具有很好的开发应用价值。近年来从天然植物中提取黄酮类化合物的方法多采用常规的超声提取法、回流提取法、冷浸提取法及渗漉提取法。这些方法同时具有溶剂用量大、提取时间长、操作麻烦、工作效率较低等缺点。而分离富集黄酮类成分多采用大孔树脂柱色谱，选用不同性能规格的树脂填料，以不同比例的含水溶剂梯度洗脱的方法。采用这些方法同样存在操作步骤较多、 收率低，生产成本较高的缺点，尤其是提取纯化过程中的加热浓缩环节较多，容易造成有效成分破坏或流失，总黄酮的提取率及转移率不高，同时黄酮提取物中常含有一些重金属杂质，且往往超标。红花芒毛苣苔为苦苣苔科芒毛苣苔属植物Aeschynanthus moningeriae (Merr.)，生于山谷林中或溪边石上，海拔800-1200米，为海南特有植物。据文献报道，苦苣苔科植物在全世界有120 140个属，在我国有M个属，其中药用植物有100多种。该科植物中所含的化学成分主要为黄酮类、苯乙醇类、醌类和萜类等，具有显著的抑菌、抗氧化、、 抗病毒、抗炎、祛痰止咳等作用，但对芒毛苣苔属植物一红花芒毛苣苔的研究，无论是基础还是开发应用研究均未见有报道。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种天然植物来源的总黄酮的制备方法的技术方案，其工艺简单、提取浓缩技术先进、操作方便、成本低，绿色高效，总黄酮提取物收率高。所述的一种天然植物来源的总黄酮的制备方法，其特征在于包括以下步骤
1)原料处理将红花芒毛苣苔药材切成1 2cm的小段；
2)破碎提取将切段的药材放入破碎提取容器中，每次用50% 80%的含水乙醇做溶剂破碎提取1-2次，若药材重量为Ikg则含水乙醇的用量为6 10升，破碎提取时间每次 2 5 min，抽滤，合并滤液；
3)闪蒸浓缩将滤液在水浴温度60°C 90°C，真空度为0.090 Mpa -0. 095Mpa，进液流速为200 350 mL · HiirT1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到浓缩液，ImL浓缩液含lg-2g药材；
4)大孔树脂纯化将得到的浓缩液通过大孔吸附树脂分离富集，色谱柱的径高比为 1 10 1 15，先用H2O洗脱，再依次用10% 80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为5 15 mL ^irT1,分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，收集合并20% 70% 含水乙醇各部位的洗脱液，将合并的洗脱液在50°C 80°C、真空度为0. 090 Mpa 0. 095 Mpa、进液流速为250 350 mL · mirT1的条件下进行真空薄膜浓缩、干燥，即得红花芒毛苣苔总黄酮提取物干粉。所述的一种天然植物来源的总黄酮的制备方法，其特征在于步骤2)中含水乙醇的浓度为55% 75%，优选60% 70% ；破碎提取时间每次3 4 min。所述的一种天然植物来源的总黄酮的制备方法，其特征在于步骤3)中水浴温度为651 851，优选70°C 80°C ；进液流速为230 320 mL · mirT1，优选250 300 mL · mirT1。所述的一种天然植物来源的总黄酮的制备方法，其特征在于步骤4)中色谱柱的径高比为1:12 1:13 ；洗脱流速为8 13 mL ^irT1,优选洗脱流速为10 12 mL -min"1 ； 真空薄膜浓缩的温度为65°C 70°C，进液流速为280 300 mL · mirT1。所述的一种天然植物来源的总黄酮的制备方法，其特征在于步骤4)中先用H2O 洗脱，再依次用10%含水乙醇、20%含水乙醇、40%含水乙醇、60%含水乙醇、75%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，收集合并20%含水乙醇、40%含水乙醇和60%含水乙醇各部位的洗脱液，将合并的洗脱液真空薄膜浓缩、干
O所述的一种天然植物来源的总黄酮的制备方法，其特征在于步骤4)中先用H2O 洗脱，再依次用10%含水乙醇、30%含水乙醇、50%含水乙醇、70%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，收集合并30%含水乙醇、50%含水乙醇、70%含水乙醇各部位的洗脱液，将合并的洗脱液真空薄膜浓缩、干燥。所述的大孔吸附树脂为Diaion HP-20大孔吸附树脂。上述一种天然植物来源的总黄酮的制备方法，具有以下有益效果
1.对红花芒毛苣苔采用含水乙醇破碎提取，通过高速搅拌、振动、混合、渗透、浸渍的结合作用，使原料中的成分在极短的时间内从植物组织中溶出，实现了粉碎和提取过程的同时完成。同时室温提取避免热敏性成分破坏，具有提取快速、完全、高效节能，操作简便、工作效率较高等优势，提高了总黄酮的提取率。提取液采用真空闪蒸浓缩，具有浓缩液受热温度低、受热时间短、有效保护热敏性成分不被破坏，浓缩速度快、效率高，操作简单、使用方便、节能环保等优势。2.该制备方法工艺简单、提取浓缩技术先进、操作方便、成本低，绿色高效，总黄酮提取物收率高。采用紫外分光光度法测定所得到的总黄酮提取物，提取物中总黄酮的含量为32. 27% 43. 69，总黄酮的提取率为8. 56% 13. 56%，总黄酮的转移率高达72. 33% 84. 45%。经初步体外生物活性试验表明，红花芒毛苣苔总黄酮提取物具有一定的抗菌、抗氧化活性，可用作食品添加剂、抗氧剂、防腐剂、药物原料等。因此具有很好的开发应用价值。3.通过ICP-MS法测定总黄酮提取物中重金属的含量，发现制得的红花芒毛苣苔总黄酮中重金属含量很低，完全符合《药用植物及其制剂进出口绿色行业标准》的标准。4.红花芒毛苣苔总黄酮外观为浅黄色无定型粉末，将其少量用含水乙醇溶解后进行化学试管反应表明，遇三氯化铁-铁氰化钾试剂显蓝色，与盐酸-镁粉试剂反应显粉红色。经初步体外活性试验表明，红花芒毛苣苔总黄酮具有一定的抗菌及抗氧化活性，因此具有很好的开发应用价值。本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，液体的百分含量为体积比，固体的
百分含量为重量比。
图1为5-羟基-7，4' -二甲氧基黄酮的核磁共振氢谱图； 图2为5-羟基-7，4' -二甲氧基黄酮的核磁共振碳谱图1、图2中横坐标代表化学位移。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1
1)原料处理将红花芒毛苣苔药材切成Icrn的小段；
2)破碎提取将切段的药材放入破碎提取容器中，每次用60%的含水乙醇做溶剂破碎提取2次，若药材重量为Ikg则含水乙醇的用量为8升，破碎提取时间每次3 min，抽滤，合并滤液；
3)闪蒸浓缩将滤液在水浴温度70°C，真空度为0.095Mpa，进液流速为250mL · mirT1 的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到浓缩液，ImL浓缩液含2g药材；
4)大孔树脂纯化将得到的浓缩液通过DiaionHP-20大孔吸附树脂分离富集，色谱柱的径高比为1 12，先用H2O洗脱，再依次用10%含水乙醇、30%含水乙醇、50%含水乙醇、70% 含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为IOmL mirT1，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，收集合并30%含水乙醇、50%含水乙醇和70%含水乙醇各部位的洗脱液， 将合并的洗脱液在70°C、真空度为0. 095 Mpa、进液流速为300mL ^irT1的条件下进行真空薄膜浓缩、干燥，即得红花芒毛苣苔总黄酮提取物干粉。在本发明所述的工艺方法中
步骤1)中将红花芒毛苣苔药材切成1. 5,1. 8,2. Ocm的小段；
步骤2)中每次含水乙醇浓度为50%,65^^70%或80%，破碎提取1次，若药材重量为 Ikg则含水乙醇的用量为6升、7升、9升或10升，破碎提取时间每次2 mindmin或5 min ； 步骤3)中闪蒸浓缩的水浴温度60°〇、751、801或901，真空度为0. 090 Mpa，进液流速为 200 mL ‘ min"\280 mL · mirT1、300 mL · mirT1 或 350 mL · mirT1，ImL 浓缩液含 1. 0g、 1. 5g药材；
步骤4)中色谱柱的径高比为1:10、1:13或1:15，洗脱流速为5 HiI^mirT1A mL -min"1, 12 mL · min"1或15 mL · min"1 ；真空薄膜浓缩的温度为60°C、65°C、75°C或80°C ；进液流速为 250mL · mirT1、280 mL · min"\320 mL · mirT1 或；350 mL · mirT1。先用 H2O 洗脱，再依次用 10%含水乙醇、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、65%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，收集合并25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、65%含水乙醇各部位的洗脱液，将合并的洗脱液真空薄膜浓缩、干燥。或者先用H2O洗脱，再依次用10%含水乙醇、30%含水乙醇、55%含水乙醇、60% 含水乙醇、70%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，收集合并30%含水乙醇、55%含水乙醇、60%含水乙醇和70%含水乙醇各部位的洗脱液，将合并的洗脱液真空薄膜浓缩、干燥。其它同实施例1，也能取得本发明所述的有益效果。以下通过相应的试验对通过本发明制备的总黄酮提取物进行总黄酮的含量测定及重金属元素的含量测定，同时进行体外抗菌及抗氧化活性试验。试验1 红花芒毛苣苔提取物中总黄酮的含量测定
测定条件UV-2102PCS紫外可见分光光度计(上海龙尼柯仪器有限公司)；芦丁对照品 (中国药品生物制品检定所提供)，芦丁的最大吸收波长510 nm。标准曲线的绘制准确称取干燥恒重的芦丁对照品17. 75 mg,加入70%乙醇溶解并定容至100 mL的量瓶中，摇勻得浓度为0. 1775 mg · mL—1的对照品溶液。分别取上述芦丁标准溶液0，0. 5，1. 5，2. 5，3. 5，4. 5 ml于6只10 mL量瓶中，用70%乙醇补充至5 mL，各加入0.4 mL 5%亚硝酸钠，摇勻，放置5 min后再各加入10%硝酸铝0. 4 mL，摇勻。5 min后再加入1 mol · L—1的氢氧化钠溶液4 mL，混勻，用70%乙醇稀释至刻度。10 min后于510 nm 处测吸光度，试剂为空白参比，以芦丁质量浓度为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线， 用最小二乘法进行线性回归，得芦丁含量与吸光度之间的回归方程A=O. 0057C-0. 0266, R2=O. 9990。样品的含量测定精密称定干燥的红花芒毛苣苔提取物干粉(实施例1)适量，用 70%乙醇溶解并定容至25 mL量瓶中。吸取一定量的上述溶液于10 mL量瓶中，添加70% 乙醇溶液使体积约为5 mL，按照上述绘制芦丁标准曲线的方法，依次加入亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠溶液，混勻，用70%乙醇稀释至刻度。静置20 min后测定吸光度。重复3次测定，并根据标准曲线换算出样品中总黄酮的含量，计算出红花芒毛苣苔提取物中总黄酮的平均含量为32. 27% 43. 69%，总黄酮的提取率为8. 56% 13. 56%，总黄酮的转移率高达 72. 33% 84. 45%ο经系统提取分离，从红花芒毛苣苔70%乙醇提取物的不同萃取部位得到了若干个黄酮单体，经过理化鉴别及光谱技术鉴定了它们的结构。其中在乙酸乙酯萃取部位分离鉴定出的5-羟基_7，4' - 二甲氧基黄酮的量非常大。经HPLC含量测定，红花芒毛苣苔总黄酮提取物中5-羟基-7，4' -二甲氧基黄酮的含量达16. 37%，该化合物可以作为生产药物的原料。试验2 红花芒毛苣苔总黄酮提取物中重金属元素的含量测定
(1)仪器与工作参数采用微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定红花芒毛苣苔总黄酮提取物中重金属元素的含量。X-Series型电感耦合等离子体质谱仪(美国热电公司)； MARS-5型微波消解仪(美国CEM公司)，附RTP-300 Plus温控；MiIli-Q Academic超纯水处理器(美国Millipore公司)。硝酸为优级纯，其他试剂均为分析纯。仪器工作参数如下表。ICP-MS工作参数
权利要求
1.一种天然植物来源的总黄酮的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)原料处理将红花芒毛苣苔药材切成1 2cm的小段；2)破碎提取将切段的药材放入破碎提取容器中，每次用50% 80%的含水乙醇做溶剂破碎提取1-2次，若药材重量为Ikg则含水乙醇的用量为6 10升，破碎提取时间每次 2 5 min，抽滤，合并滤液；3)闪蒸浓缩将滤液在水浴温度60°C 90°C，真空度为0.090 Mpa -0. 095Mpa，进液流速为200 350 mL · HiirT1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到浓缩液，ImL浓缩液含lg-2g药材；4)大孔树脂纯化将得到的浓缩液通过大孔吸附树脂分离富集，色谱柱的径高比为 1 10 1 15，先用H2O洗脱，再依次用10% 80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为5 15 mL ^irT1,分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，收集合并20% 70% 含水乙醇各部位的洗脱液，将合并的洗脱液在50°C 80°C、真空度为0. 090 Mpa 0. 095 Mpa、进液流速为250 350 mL · mirT1的条件下进行真空薄膜浓缩、干燥，即得红花芒毛苣苔总黄酮提取物干粉。
2.如权利要求1所述的一种天然植物来源的总黄酮的制备方法，其特征在于步骤2) 中含水乙醇的浓度为55% 75%，优选60% 70% ；破碎提取时间每次3 4 min。
3.如权利要求1所述的一种天然植物来源的总黄酮的制备方法，其特征在于步骤3) 中水浴温度为65°C 85°C，优选70°C 80°C ；进液流速为230 320 mL · mirT1，优选 250 300 mL · mirT1。
4.如权利要求1所述的一种天然植物来源的总黄酮的制备方法，其特征在于步骤4) 中色谱柱的径高比为1 12 1 13 ；洗脱流速为8 13 mL · mirT1，优选洗脱流速为10 12 mL · mirT1 ；真空薄膜浓缩的温度为65°C 70°C，进液流速为280 300 mL · mirT1。
5.如权利要求1所述的一种天然植物来源的总黄酮的制备方法，其特征在于步骤4) 中先用H2O洗脱，再依次用10%含水乙醇、20%含水乙醇、40%含水乙醇、60%含水乙醇、75% 含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，收集合并20%含水乙醇、40%含水乙醇和60%含水乙醇各部位的洗脱液，将合并的洗脱液真空薄膜浓缩、干燥。
6.如权利要求1所述的一种天然植物来源的总黄酮的制备方法，其特征在于步骤4) 中先用H2O洗脱，再依次用10%含水乙醇、30%含水乙醇、50%含水乙醇、70%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集4倍柱体积的各部位洗脱液，收集合并30%含水乙醇、50%含水乙醇、70%含水乙醇各部位的洗脱液，将合并的洗脱液真空薄膜浓缩、干燥。
全文摘要
一种天然植物来源的总黄酮的制备方法，属于植物技术领域。以红花芒毛苣苔为原料，用含水乙醇做溶剂进行组织破碎提取；抽滤，合并滤液，进行闪蒸浓缩回收溶剂；得到的浓缩液通过大孔吸附树脂分离富集，用含水溶剂进行梯度洗脱，合并一定比例的含水溶剂洗脱液进行闪蒸浓缩回收溶剂，继续真空干燥成干粉，即得红花芒毛苣苔总黄酮提取物。其工艺简单、提取浓缩技术先进、操作方便、成本低，绿色高效，提取物中总黄酮的含量为32.27％～43.69％，提取率为8.56％～13.56%，转移率高达72.33％～84.45%。经初步体外生物活性试验表明，红花芒毛具体总黄酮提取物具有一定的抗菌、抗氧化活性。
文档编号A61P39/06GK102151292SQ201110080148
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者刘辉鑫, 袁珂 申请人:浙江农林大学