专利名称：一种细胞培养微流控芯片及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微流控芯片，具体地说是涉及一种用于细胞微环境研究的细胞培养微流控芯片，以及其制备方法和在细胞微环境研究中的应用。
背景技术：
细胞微环境是一个多因素组成的复杂集合，其对细胞增殖、分化、迁移和代谢等行为和功能都起着重要作用。而细胞的这些行为与胚胎发育、血管新生、组织修复、免疫防御、 以及肿瘤发生等重要生理病理过程都密切相关。近年来对细胞微环境的研究已成为研究热点和难点。细胞所处的微环境十分复杂，其复杂性可概括为:细胞所处的三维微尺度空间对细胞行为的影响；不同细胞类型间细胞相互作用；胞外基质与细胞间相互作用；可溶性生化因子浓度及其浓度梯度分布的作用；各种力学因素，包括细胞外基质材料的硬度、机械力刺激(如间隙流引起的剪切力和液压差引起的压力分布)等的作用。而传统的细胞体外培养只能提供一种二维的、静态的细胞生长环境，很难为细胞提供一个近似在体的生长环境， 从而导致许多体外研究结果与在体情况相差甚远。为了克服传统方法中的不足，使细胞体外研究结果更好地反映细胞的在体行为，亟需构建一种新的研究系统，能够为细胞的生长提供一个近似于在体的生存环境，并能对其生存环境的关键参数进行精确控制，同时还能实时考察细胞对其变化的响应。
近年发展起来的微流控技术为体外细胞微环境对细胞行为影响的研究提供了可能。20世纪90年代初基于微机电系统(MEMS)加工技术发展起来的微流控芯片，由于其分析速度快、试剂消耗少、便于集成和高通量分析等诸多优点，在生化分析等领域逐步得到应用，已经成为目前研究热点和前沿。近年来，有报道将微流控芯片技术应用于细胞研究，给细胞研究提供了新的方法和平台。目前国内外关于这方面的报道已有五千多篇，并呈现出快速增长的趋势。
微流体芯片可通过集成在细胞培养腔体内的微结构阵列或者是利用微流体层流性质形成的细胞凝胶结构等方法可实现细胞的立体培养，建立细胞研究的基础平台，结合芯片内微流体形成的化学物质的浓度梯度，精细控制细胞外基质，建立浓度依赖的分析法， 实现细胞响应的高通量检测；微流体产生的剪切力施加于细胞，可模拟其在体内环境的受力情况，可使细胞的活性较常规培养有很大提高，为利用微芯片进行组织研究奠定良好基础。微流体器件集成性能优良，在细胞培养芯片内可以集成微阀等器件，实现培养基以及刺激液的自动进样，可以建立细胞分析的自动化平台。
聚二甲基娃氧烧(Polydimethylsiloxane, PDMS)是一种广泛应用于微流控等领域的聚合物材料。其是一种高分子有机硅化合物，具有无毒性、高透气性、透光性良好、生物相容性佳、易与多种材质室温接合等特点。此外，其成本低，使用简单，且有极佳的可塑性、 热稳定性和化学惰性。由于以上显著优点，使其成为目前微流控芯片制作使用最多的聚合物材料，也常用于芯片封装、微流道、微混合器、微泵浦、微阀门等元件制作等领域。
现在有微流控芯 片大多是利用软光刻法加工制作微流控芯片，其制作过程较为繁复且需要借助一些昂贵、高精度的仪器来完成。例如:其掩膜的制作需借助高精度胶片打印机来完成；利用SU-8负性光刻胶光刻制作阳模的过程相当复杂、繁琐；大多数的芯片必须借助等离子表面处理器键合来完成封装；芯片灌胶必须借助精密仪器来完成等。而且此类芯片清洗困难，往往只能一次性使用，在一定程度上增加了实验成本。这些都使微流控芯片在普通实验的应用受到了很大范围的限制。此外，由于需借助等离子表面处理器键合来完成封装，必须使用较厚的载玻片来作为底面基底，不利于激光共聚焦等的观察。因此，设计、 制作一种可实现多细胞的三维共培养，生化因子浓度梯度生成以及力学刺激加载同时制作简便，又易于观察的微流控芯片，对于细胞微环境的研究，无疑有着重要的意义。发明内容
针对上述现状，本发明提供了一种用于细胞微环境研究的细胞培养微流控芯片及其制备方法。该微流控芯片结构简单、微型化，制备方法易于操作，制备成本低，仅需PDMS 及常规标准玻片即可。该微流控芯片可以实现多种细胞的三维共培养，实现胞外基质硬度可调、生化因子浓度及浓度梯度生成、压力及压力梯度的加载，用来研究细胞微环境对细胞行为和功能的影响。
本发明通过以下技术方案解决上述问题:
本发明提供了一种用于细胞培养的微流控芯片，包括细胞培养层、基底层和夹持层，所述细胞培养层和夹持层之间三边密封成夹套结构，所述基底层以可取出的方式插接在夹套结构中，基底层与细胞培养层之间的接触面密封，所述细胞培养层上分布设置有至少两个孔，孔与基底层共同形成细胞培养小室。
进一步，所述夹持层设有观测孔。
进一步，所述细胞培养小室填充有凝胶，每个细胞培养小室通过凝胶贯通。
更进一步,所述微流控芯片为透明材质制成,长3_5cm,宽l_3cm,高0.4_lcm,设有 3-6个细胞培养小室。
现在有微流控芯片大多是利用软光刻法加工制作微流控芯片，其制作过程较为繁复且需要借助一些昂贵、高精度的仪器来完成。而且此类芯片清洗困难，往往只能一次性使用，在一定程度上增加了实验成本。这些都使微流控芯片在普通实验的应用受到了很大范围的限制。
因此，本发明提供了一种细胞培养微流控芯片的简易制作方法，制作原料仅需实验室各种常规标准的玻片及PDMS，制作成本低，简单易行。该方法制作的细胞培养微流控芯片可以重复利用。细胞培养微流控芯片的简易制作方法包括如下进行的步骤:
a排布玻片
在玻璃容器中放置5片直径为18mm的圆形玻片，将I片长60mmX宽24mm的长方形盖玻片覆盖在圆形盖玻片上面，然后将7片IOmmX IOmm的方形盖玻片放置在长方形盖玻片的上面相对于圆形盖玻片的中间，在IOmmX IOmm的方形盖玻片的一个边或多个边旁边相对中间的位置分别紧靠放置5片8_X8_的方形盖玻片。在这一步骤中，玻片的排布方式可以根据需要自行调整，也可以选择其他规格的玻片来排布；另一方面，微流控芯片细胞培养小室的尺寸，长宽高都可以根据不同需求做相应的调整，如可以通过选择不同规格的玻片及玻片数量来 控制，比如可以选择5mmX 5mm的方形盖玻片来排布，也可以将上述5片8_X8_的方形盖玻片换成4片8_X8_的方形盖玻片等，可根据具体需要便捷的更改芯片尺寸，这更加体现了本发明的细胞培养微流控芯片的制作方法简便易行。一般在制作过程中，要使中间的细胞培养小室的高度要高于其他的细胞培养小室，这样可以利用表面张力的作用使得基质、胶原或细胞与三维培养基质的混合物注入细胞培养小室时不会泄漏到其他的细胞培养小室中；
b PDMS预聚液的配制
PDMS主剂与固化剂按10: I的质量比混合并充分搅拌混匀，制成PDMS预聚液，用真空泵进行脱泡处理以去除搅拌过程中产生的气泡；
c 倒模
将PDMS预聚液小心注入步骤a中已排布好玻片的玻璃容器中，厚度在0.4至1cm， 再次用真空泵进行脱泡处理，然后放于80°C烘箱中固化24h ；
d微流控芯片成形
待步骤c中PDMS充分固化后,将其从玻璃容器中剥尚下来,切割边缘部分成型 (修剪成合适的大小)，然后用酒精浸泡芯片IOmin (利于剥离底部玻片)，小心将底部的所有玻片取出，注意保持PDMS完整性，用打孔器在芯片上侧和下侧分别打孔；上侧打孔是在每个细胞培养小室上端的位置，方便向细胞培养小室中加入胶原或基质胶或细胞悬液或培养基。孔的大小也可以根据不同需求使用不同的打孔器来做相应调整。
e 封装
将步骤d中成形的微流控芯片用清水反复冲洗，待芯片冲洗干净，将经酒精、无菌水清洗的大小合适的玻片插入步骤d中长方形玻片的位置即形成基底层，完成对芯片的封装。基底层是可以从芯片夹套中取出，使得本发明的微流控芯片易于清洗、灭菌，可反复 使用。本发明的微流控芯片实验室可选择75%酒精灭菌或者高温高压灭菌。
在上述制作方法中作为基底层的玻片的材料也可以是聚二甲基硅氧烷PDMS或聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚碳酸酯PC或聚丙乙烯PS ；PDMS材料也可以用聚甲基丙烯酸甲酯 PMMA或聚碳酸酯PC或聚丙乙烯PS来代替。
细胞所处的微环境十分复杂，在细胞微环境研究领域，传统的细胞体外培养只能提供一种二维的、静态的细胞生长环境，很难为细胞提供一个近似在体的生长环境，从而导致许多体外研究结果与在体情况相差甚远。细胞的三维培养能够为细胞的生长提供一个近似于在体的生存环境，并能对其生存环境的关键参数进行精确控制，同时还能实时考察细胞对其变化的响应。
因此，本发明还提供了一种基于上述用于细胞培养的微流控芯片的细胞培养方法。
细胞二维培养的方法为:将胶原或基质胶灌入细胞培养小室中，待成胶后，直接将细胞悬液再加入细胞培养小室中，进行二维培养；
细胞三维培养的方法为:细胞与胶原或基质胶混合后灌入细胞培养小室中，待成胶后，再向细胞培养小室中加入培养基进行培养；细胞的三维培养能够为细胞提供一个近似在体的生长环境，并能对其生存环境的关键参数进行精确控制，实时考察细胞对其变化的响应，使细胞体外研究结果更好地反映细胞的在体行为。
细胞贴壁三维培养的方法为:胶原或者基质胶混合后灌入一个细胞培养小室中，待成胶后，直接将细胞悬液加入到另外的任一个细胞培养小室中，竖直放置30min，在上述加入细胞悬液的细胞培养小室中加入培养基后进行培养；
多种细胞的三维共培养的方法为:将细胞A与胶原或者基质胶混合后灌入一个细胞培养小室中，待成胶后，加入培养基后孵育30min，细胞B与胶原或基质胶混合后灌入另外的任一个或多个细胞培养小室，成胶后，在上述加入细胞B的细胞培养小室中加入培养基进行培养。多种细胞的三维共培养有助于考察不同细胞类型间细胞之间的相互作用。
本发明的有益效果:综上所述，本发明的有益效果在于提供了一种新型、简便的微流控芯片，其制作简单，制作成本低，仅需实验室常规玻片及PDMS即可，本发明无需借助昂贵的仪器即可实现微流控芯片的制作，可根据具体需要便捷的更改芯片尺寸，芯片易于清洗、灭菌，可反复使用，可根据具体需要实现多种方式的细胞培养，可用于研究细胞微环境对细胞行为的影响，该微流控芯片通过巧妙的构型设计和微流体控制技术，能够精确地调控细胞所处的微环境中的几大重要参数，包括:胞外基质理化特性、生化因子浓 度梯度、压力梯度等，有助于考察不同细胞类型间细胞之间的相互作用，有助于考察胞外基质理化特性对细胞生物行为的影响，有助于发现影响细胞生物行为的调控因素，以获得特定的细胞反应，得到较为可靠的结果，并为生物芯片领域的微流控芯片简易制作提供了新思路。
以下将结合附图对本发明作进一步的详细描述。
图1为微流控芯片细胞培养层示意图2为微流控芯片玻片插入一侧侧视图3为微流控芯片夹套层示意图4为基于常规玻片及PDMS的细胞培养微流控芯片的制备步骤a中玻片排布示意图5为微流控芯片灌胶后实物图6为基于微流控芯片，内皮细胞二维培养条件下成管腔样结构；
图7为基于微流控芯片，内皮细胞三维培养条件下的血管出芽图8为基于微流控芯片，内皮细胞三维培养条件下，用共聚焦显微镜考察内皮细胞的血管出芽三维重构图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下通过实施例结合附图对本发明做进一步的说明。
若无特殊说明，所用实验方法为常规实验方法；所使用的试剂和材料等均可通过商业途径获得。
实施例1 一种细胞培养微流控芯片的结构
用于细胞培养的微流控芯片，包括细胞培养层1、基底层2和夹持层3 (图2所示)， 所述细胞培养层I和夹持层3之间三边密封成夹套结构，所述基底层2以可取出的方式套于夹套结构内，基底层与细胞培养层之间密封，所述细胞培养层上分布设置有5个孔，中间 I个孔，在其四周分布4个孔，每个孔与基底层共同形成细胞培养小室4 (图1所示)。另外在所述夹持层设有观测孔5，便于显微镜下的可视观察(图3所示)。
所述微流控芯片为PDMS材料制成，长3cm，宽2cm，高0.5cm,设有5个细胞培养小室，每个细胞培养小室通过填充凝胶贯通，如图5所示的实物图。
另外中间细胞培养小室的高度比4个周边细胞培养小室的高度高出0.3mm，这样可以利用表面张力作用使得细胞和三维培养基质的混合物注入中间细胞培养小室时不会泄漏到细胞培养小室中。
所述观测孔5是显微镜观察的可视窗口，利用基底材料具有高透明度的性质，使得该微流控装芯片可以有较好的可视窗口以便于观察细胞培养腔中所培养细胞的形态及行为变化。
所述微流控芯片的基底层2材料为玻璃，细胞培养层I和夹套层3的材料为聚二甲基硅氧烷PDMS。
实施例2实施例1中细胞培养微流控芯片的玻片的排布方式
先放置5片直径为18mm的圆形玻片7,将I片长60mmX宽24mm的长方形盖玻片 8覆盖在圆形盖玻片上面，然后将7片IOmmX IOmm的方形盖玻片9 (总厚度为1.05mm)放置在长方形盖玻片8的上面相对于圆形盖玻片7的中间，在方形盖玻片9的一个边或多个边旁边相对中间的位置分别紧靠放置5片8mmX8mm的方形盖玻片10 (总厚度为0.75mm),这样中间的细胞培养小室就比其他的细胞培养小室高0.3mm。图4为玻片的排布示意图。
实施例3实施例1的细胞培养微流控芯片的简易制备方法
一种细胞培养微流控芯片的简易制备方法是利用实验室常规标准玻片及聚二甲基硅氧烷PDMS两种材料来制备的，具体方法如下:
a排布玻片
将玻片按图2所示的设计排布，在玻璃容器6中放置5片直径为18mm的圆形玻片7，将I片长60mmX宽24mm的长方形盖玻片8覆盖在圆形盖玻片上面，然后将7片 IOmmX IOmm的方形盖玻片9(总厚度为1.05mm)放置在长方形盖玻片8的上面相对于圆形盖玻片7的中间，在方形盖玻片9的一个边或多个边旁边相对中间的位置分别紧靠放置5 片8mmX8mm的方形盖玻片10 (总厚度为0.75mm)，这样中间的细胞培养小室就比其他的细胞培养小室高0.3mm。
b PDMS预聚液的配制
PDMS主剂与固化剂按质量比10: I的比例混合并充分搅拌混匀，制成PDMS预聚液，用真空泵分多次进行脱泡处理以去除搅拌过程中产生的气泡。
c 倒模
将PDMS预聚液小心注入步骤a中已排布好玻片的培养皿中，厚度为0.5cm，再次用真空泵进行脱泡处理，最后将培养皿于80°C烘箱中固化24h ；
d微流控芯片成形
待步骤c中PDMS充 分固化后，将其从一次性培养皿中剥离下来，切割边缘部分成型，然后用酒精浸泡芯片IOmin以利于剥离底部玻片，小心将底部的所有玻片取出，注意保持PDMS完整性，用打孔器在芯片的上侧和下侧打孔。成形芯片中间的细胞培养小室的尺寸为:10mmX10mmXl.05mm，4个周边的细胞培养小室的尺寸为:8mmX8mmX0.75mm。上侧打孔是在每个细胞培养小室上端的位置，方便向细胞培养小室中加入胶原或基质胶或细胞悬液或培养基。在本实施例中，中间细胞培养小室上端的孔开的比较小，直径为3mm，主要是为了使基质、胶原或细胞与三维培养基质的混合物注入中间的细胞培养小室时不会泄漏到其他的细胞培养小室中。
e清洗、封装
将步骤d中成形的微流控芯片用清水反复冲洗，待芯片冲洗干净，将经酒精、无菌水清洗的一张60_X 24_玻片插入步骤d中长方形玻片的位置即形成基底层，完成对芯片的封装。
实施例4人脐静脉内皮细胞的二维培养
将胶原或基质胶灌入细胞培养小室4中，待成胶后，直接将人脐静脉内皮细胞株悬液再加入细胞培养小室4中，使用DMEM完全培养基进行培养，进行二维培养，观察细胞形态，如图6所示。
实施例5人脐静脉内皮细胞的三维培养
将人脐静脉内皮细胞与胶原或基质胶混合后灌入中间的细胞培养小室4中，待成胶后，再向中间的细胞培养小室4中加入使用DMEM完全培养基进行培养进行培养，观察细胞形态及行为，如图7所示。
实施例6人脐静脉内皮细胞的贴壁三维培养
将胶原或者基质胶混合后灌入中间的细胞培养小室4中，待成胶后，直接将人脐静脉内皮细胞株悬液加入到其周围的一个细胞培养小室中，竖直放置30min，在上述加入人脐静脉内皮细胞株悬液的细胞培养小室中加入内皮细胞培养基后(DMEM完全培养基)进行培养，观察内皮细胞形态和行为，如图8所示。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本 发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.用于细胞培养的微流控芯片，其特征在于，包括细胞培养层(I)、基底层(2)和夹持层(3)，所述细胞培养层⑴和夹持层(3)之间三边密封成夹套结构，所述基底层(2)以可取出的方式插接在夹套结构中，基底层(2)与细胞培养层(I)之间的接触面密封，所述细胞培养层(I)上分布设置有至少2个孔，孔与基底层(2)共同形成细胞培养小室(4)。
2.根据权利要求I所述的用于细胞培养的微流控芯片，其特征在于所述夹持层(3) 设有观测孔(5)。
3.根据权利要求I所述的用于细胞培养的微流控芯片，其特征在于细胞培养小室(4) 填充有凝胶，每个细胞培养小室(4)通过凝胶贯通。
4.根据权利要求I所述的用于细胞培养的微流控芯片所述微流控芯片为透明材质制成，长3-5cm,宽l-3cm,高O. 4-lcm,设有3-6个细胞培养小室(4)。
5.权利要求4所述的细胞培养微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述微流控芯片的制备材料仅用玻片和PDMS，包括如下进行的步骤a排布玻片在玻璃容器(6)中放置5片直径为18mm的圆形玻片(7)，将I片长60mmX宽24mm的长方形盖玻片(8)覆盖在圆形盖玻片上面，然后将7片IOmmX IOmm的方形盖玻片(9)放置在长方形盖玻片(8)的上面相对于圆形盖玻片(7)的中间，在方形盖玻片(9)的一个边或多个边旁边相对中间的位置分别紧靠放置5片8_X8mm的方形盖玻片(10)； b PDMS预聚液的配制PDMS主剂与固化剂按10 I的质量比混合并充分搅拌混匀，制成PDMS预聚液； c倒模将PDMS预聚液小心注入步骤a中已排布好玻片的玻璃容器中，厚度在O. 4-lcm,然后放于80°C烘箱中固化24h ； d微流控芯片成形待步骤c中PDMS充分固化后,将其从玻璃容器中剥尚下来,切割边缘部分成型，将底部的所有玻片取出，用打孔器在芯片上侧和下侧分别打孔； e封装将一张玻片插入步骤d中长方形玻片的位置即形成基底层，完成对芯片的封装。
6.基于权利要求1-5任一项所述的微流控芯片的细胞培养方法。
7.根据权利要求6所述的细胞培养方法，其特征在于，细胞二维培养的方法为将胶原或基质胶灌入细胞培养小室(4)中，待成胶后，直接将细胞悬液再加入细胞培养小室(4) 中，进行二维培养。
8.根据权利要求6所述的细胞培养方法，其特征在于，细胞三维培养的方法为细胞与胶原或基质胶混合后灌入细胞培养小室(4)中，待成胶后，再向细胞培养小室(4)中加入培养基进行培养。
9.根据权利要求6所述的细胞培养方法，其特征在于，细胞贴壁三维培养的方法为胶原或者基质胶混合后灌入一个细胞培养小室(4)中，待成胶后，直接将细胞悬液加入到另外的任一个细胞培养小室中，竖直放置30min，在上述加入细胞悬液的细胞培养小室中加入培养基后进行培养。
10.根据权利要求6所述的细胞培养方法，其特征在于，多种细胞的三维共培养的方法为将细胞A与胶原或者基质胶混合后灌入一个细胞培养小室(4)中，待成胶后，加入培养基后孵育30min，细胞B与胶原或基质胶混合后灌入另外的任一个或多个细胞培养小室，成胶后，在上述加入细胞B的细胞培养小室中加入培养基进行培养。
全文摘要
本发明涉及生物芯片领域，特别涉及一种细胞培养微流控芯片及其制作方法和应用，所述微流控芯片包括细胞培养层(1)、基底层(2)和夹持层(3)；所述微流控芯片的制备所需材料是实验室常规玻片和PDMS，通过排布玻片、PDMS预聚液的配制、倒模、成形及封装五个步骤制得的；本发明的微流控芯片制作简单、制作成本低，无需借助昂贵的仪器即可实现微流控芯片的制作，本发明提供的微流控芯片可实现多种方式的细胞培养，并通过巧妙的构型设计和微流体控制技术，能够精确地调控细胞所处的微环境中的参数，考察细胞微环境对细胞行为的影响。
文档编号C12N5/00GK103255057SQ20131016667
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月8日 优先权日2013年5月8日
发明者陈斯佳, 蔡绍皙, 张利光, 邹米莎, 赵毅, 何腾龙, 陈龙聪, 李博, 柯明 申请人:重庆大学