一种微流控芯片通道的修饰方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种微流控芯片通道的修饰方法及其应用。该方法包括将盐酸多巴胺溶液与微流控芯片的通道的内表面接触。根据本发明的方法，能够通过简单的表面修饰即可提高芯片亲水性，从而实现微流控芯片的自动进样，并且无需借助其他设备和复杂反应。
【专利说明】一种微流控芯片通道的修饰方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微流控芯片通道的修饰方法，以及该微流控芯片的修饰方法在免 疫检测方面的应用。
【背景技术】
[0002] 微流控芯片是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等基 本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小）的芯片上，由微通道形成网络， 以可控流体贯穿整个系统，用于取代常规生物或化学实验室的各种功能的一种技术。常见 的微流控芯片的主要材料为聚二甲基硅氧烷（PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA)以及玻璃 等。其中PDMS芯片以复型快速简单，被广泛应用于免疫分析领域。微流通道的通道宽度一 般为数百微米。由于PDMS或PMMA材料表面疏水，而芯片上通道的尺寸很小，进口处表面张 力比较大。因此传统的进样方式需要用注射泵连接聚乙烯管泵入，加样枪滴在微流通道一 端进样口后再用注射器从通道另一端抽出，或者是通过其他自动化系统控制完成。
[0003] 另外，也存在PDMS芯片的亲水处理方法，例如，等离子体处理，表面化学修饰亲水 基团等。其中，等离子体处理需要借助昂贵的设备，且修饰后亲水性不能持久。PDMS表面化 学修饰亲水基团，通常也需要借助等离子体或辐射产生活性基团发生反应，而通过层层自 组装修饰亲水的高分子在PDMS通道表面形成涂层，并不稳定。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于解决上述问题，提供一种通过简单的表面修饰即可提高芯片的 亲水性，从而实现自动进样，并且无需借助其他设备和复杂反应的微流控芯片通道的修饰 方法及其应用。
[0005] 为了实现上述目的，本发明提供一种微流控芯片通道的修饰方法，其中，该方法包 括将盐酸多巴胺溶液与微流控芯片的通道的内表面接触。
[0006] 本发明还提供上述修饰方法在免疫检测方面的应用。
[0007] 根据本发明的微流控芯片通道的修饰方法，具有步骤简单，且在修饰完毕后只需 将液体滴加到进样口，即可以自动流入并充满通道的优点。此外，修饰后稳定性好。
【专利附图】
【附图说明】
[0008] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0009] 图1为实施例1得到的修饰后的微流控芯片的照片；
[0010] 图2为实施例2得到的修饰后的微流控芯片的照片；
[0011] 图3为实施例3得到的修饰后的微流控芯片的照片；
[0012] 图4为实施例4中芯片进行免疫检测的结果图。
【具体实施方式】
[0013] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0014] 本发明提供的微流控芯片通道的修饰方法包括将盐酸多巴胺溶液与微流控芯片 的通道的内表面接触。
[0015] 根据本发明，优选情况下，在所述盐酸多巴胺溶液中，所述盐酸多巴胺的含量为 20-60mg/mL ;更优选在所述盐酸多巴胺溶液中，所述盐酸多巴胺的含量为30-50mg/mL。
[0016] 根据本发明，优选情况下，在所述盐酸多巴胺溶液中，溶剂为pH为8-9. 5的 Tris-HCl缓冲溶液；更优选在所述盐酸多巴胺溶液中，溶剂为pH为8. 3-8. 9的Tris-HCl缓 冲溶液。
[0017] 其中，Tris-HCl缓冲溶液为本领域技术人员所公知，为50ml0. lmol/L三羟甲基氨 基甲烧（Tris)溶液与X mlO. lmol/L盐酸混勻后，加水稀释至100ml。本领域技术人员能够 根据Tris-HCl缓冲溶液的pH值来适当地选择所述X的值。
[0018] 根据本发明，将盐酸多巴胺溶液与微流控芯片通道的内表面进行接触的条件的可 选择范围较宽，优选情况下，将盐酸多巴胺溶液与微流控芯片通道的内表面进行接触的条 件包括：接触的温度为15-40°c，更优选所述接触温度为20-25°C。接触的时间只要保证盐 酸多巴胺溶液对微流控芯片通道的内表面充分接触，以实现提高芯片亲水性的效果，并可 以根据盐酸多巴胺溶液的浓度适当选择接触的时间，同样，盐酸多巴胺溶液的用量也只要 保证与所述微流控芯片通道的内表面充分覆盖、使之充分与其接触即可，通常情况下，采用 上述优选浓度的盐酸多巴胺溶液，接触的时间为20-400分钟，优选，接触的时间为30-360 分钟，更优选，接触的时间为30-60分钟。此外，所述接触的方式可以采用本领域技术人员 公知的方法进行，例如，用注射泵连接聚乙烯管泵入，加样枪滴在微流通道一端进样口后再 用注射器从通道另一端抽出。
[0019] 根据本发明，对所述微流控芯片的材料没有特别的要求，可以为本领域所常用的 各种用于制备微流控芯片的材料。但优选情况下，所述微流控芯片的材料为聚二甲基硅氧 烷或聚甲基丙烯酸甲酯。
[0020] 根据本发明，所述微流控芯片包括一条或多条通道，多条通道连通或不连通。若包 括多条不相互连通的通道，可以为平行排列的多条通道。
[0021] 在本发明中，对所述微流控芯片的通道的尺寸没有特别的要求，本领域技术人员 可以根据需要适当地选择。但优选情况下，为了更好地实现自动进样，所述微流控芯片中的 每条通道的宽度为100微米?1毫米，高度为100微米?1毫米，长度为3-5厘米；优选每 条通道的宽度为300微米?800微米毫米，高度为300微米?800微米，长度为3-5cm。
[0022] 根据本发明，对所述微流控芯片的通道形状没有特别的限定，可以是直线型或曲 线形等形状。
[0023] 根据本发明，优选情况下，所述微流控芯片的通道的进样口的孔直径为0. 5?2毫 米。
[0024] 根据本发明，在所述修饰完成后，优选还包括用水对通道进行清洗的步骤，在清洗 完成后，可直接使用。
[0025] 此外，在本发明中，对所述微流控芯片的制备方法没有特别的限定，可以根据所述 微流控芯片材料的不同，通过本领域技术人员公知的常规的方法进行制备。例如，当所述微 流控芯片的材料为PDMS时，微流控芯片的制备方法为浇注翻模；当所述微流控芯片的材料 为PMMA时，微流控芯片的制备方法为注塑法。所述注塑法及其条件为本领域所公知。
[0026] 本发明还提供上述修饰方法在免疫检测方面的应用。在使用本发明的修饰方法对 芯片进行修饰后，在免疫检测过程中，能够实现自动进样。
[0027] 根据本发明，通过上述修饰方法对所述微流控芯片进行修饰后，再利用上述修饰 过的微流控芯片进行免疫检测，例如利用上述修饰过的微流控芯片进行免疫检测如下：
[0028] 1)固定捕获抗体
[0029] 捕获抗体即包被抗体，是用来捕获抗原的单克隆抗体。
[0030] 将芯片具有图案的一面朝下贴合到在基底上(优选地，所述基底为玻璃片或者 PDMS片）上，然后将不同的捕获抗体溶液分别在微流控芯片（经过了修饰）的平行排列的多 条微流通道的各个进样口滴加，溶液自动充满所有微流通道，在20-25°C条件下进行孵育 0. 5-4小时。
[0031] 2)封闭
[0032] 将捕获抗体溶液从微流通道出样口抽出，基底上形成平行的抗原蛋白条带。将微 流通道芯片去掉，剩下基底，为防止非特异性吸附，将基底用牛血清白蛋白溶液进行封闭。
[0033] 3)通入待检样品
[0034] 将另一个微流控芯片（经过了修饰）放在捕获抗体条带的区域，通道方向与捕获抗 体条带方向垂直，分别在微流通道的各个进样口滴加不同的待检样品溶液，溶液自动充满 整个微流通道，在20-25°C条件下孵育20-60分钟，将待检样品溶液抽出。随后，揭去微流控 心/T 〇
[0035] 4)孵育检测抗体及检测
[0036] 加入检测抗体修饰有辣根过氧化物酶，在20_25°C条件下孵育20-60分钟后，加入 化学发光液，化学发光液为辣根过氧化物酶（HRP)发光底物。检测抗体上修饰有辣根过氧 化物酶（HRP)，当加入发光底物后，检测抗体上的HRP活性催化发光底物发光，在条带交叉 的地方就能清楚的显示反应情况。
[0037] 以下通过实施例来详细说明本发明，但本发明并不限于下述实施例。
[0038] 以下实施例中的微流控芯片采用以下方法进行制备：
[0039] 1、PDMS微流控芯片的制备
[0040] 1)聚二甲基硅氧烷芯片模板的制备，通过光刻，使用的设备为紫外光刻机，即利用 光刻胶在紫外线照射下可改变性质的特点制作与设计好的掩模上的图案完全一致的光刻 胶娃片模板，具体制备方法参考 Annual Review of Materials Science，1998, 28, 15。
[0041] 2)聚二甲基硅氧烷芯片的制备，方法为软刻蚀技术，制备材料为聚二甲基硅氧烷 (PDMS，购自道康宁)，其在通常状态下为透明而粘稠的液体，经与固化剂反应（184有机硅胶 固化剂，购自道康宁）并加热到80°C后可固化（固化剂相对于聚二甲基硅氧烷的用量为10 重量％)。利用PDMS可以将硅片模板上的突起图形转换为对应的凹型图形，从而得到一块与 所述凸型条微结构相对应的聚二甲基硅氧烷芯片。通常在芯片上形成的凹形通道为多条平 行排列的通道，每条通道的宽度为100微米?500微米，高度为100微米?500微米，长度 为 3_5cm。
[0042] 3)用打孔器在通道的上方开设进样口和出样口，进样口和出样口位于通道的两 端。进样口和出样口的孔直径为0.5?2毫米。
[0043] 4)将PDMS芯片有图案的一面朝下贴合到玻璃片上完成组装。
[0044] 2、PMMA微流控芯片的制备
[0045] 1)通过注塑的方法制得PMMA芯片。芯片上形成的凹形通道为多条平行排列的通 道，每条通道的宽度为500微米?1毫米，高度为500微米?1毫米，长度为3-5cm。进样口 和出样口的孔直径为0. 5?2毫米。
[0046] 2)将PMMA芯片有图案的一面朝下贴合到PDMS片上完成组装。
[0047] 实施例1
[0048] 盐酸多巴胺溶液的制备：将40mg盐酸多巴胺溶于lmL的Tri s-HCl缓冲溶液 (pH8. 5)中，混匀即得盐酸多巴胺溶液A。将盐酸多巴胺溶液A注入到上述制备的PDMS微流 控芯片的通道中（为10条平行排列的通道，每条通道的宽度为300微米，高度为300微米， 长度为3cm)，室温（25°C)静置3小时。然后使用纯水清洗，得到修饰后的微流控芯片。修 饰后照片如图1。
[0049] 实施例2
[0050] 盐酸多巴胺溶液的制备：将30mg盐酸多巴胺溶于lmL的Tris-HCl缓冲溶液 (pH8. 3)中，混匀即得盐酸多巴胺溶液B。将盐酸多巴胺溶液B注入到上述制备的PMMA微流 控芯片的通道中（为7条平行排列的通道，每条通道的宽度为500微米，高度为500微米，长 度为5cm)，室温（25°C)静置0.5小时。然后使用纯水清洗，得到修饰后的微流控芯片。修 饰后照片如图2。
[0051] 实施例3
[0052] 盐酸多巴胺溶液的制备：将50mg盐酸多巴胺溶于lmL的Tris-HCl缓冲溶液 (pH8. 9)中，混匀即得盐酸多巴胺溶液C。将盐酸多巴胺溶液C注入到上述制备的PMMA微 流控芯片的通道中（为7条平行排列的通道，每条通道的宽度为800微米，高度为800微米， 长度为5cm)，室温（25°C)静置小时6小时。然后使用纯水清洗，得到修饰后的微流控芯片。 修饰后照片如图3。
[0053] 实施例4
[0054] 利用修饰过的微流控芯片进行免疫检测实验
[0055] 1、包被抗体
[0056] 将实施例2中制备得到的修饰后的微流控芯片具有图案的一面朝下贴合到玻璃 片上，将50 μ g/mL的甲胎蛋白（以下简称AFP)包被抗体滴入微流控芯片的通道进样口， 溶液自动充满整个微流通道，25 °C孵育40分钟，之后吸除通道内液体，将PBS缓冲溶液 (0. 01M、pH7. 4,以下相同）滴入微流控芯片的通道进样口，溶液自动充满整个微流通道，在 出样口吸出，清洗通道3次。
[0057] 2、封闭
[0058] 揭去芯片，在与步骤1芯片的铺设的垂直方向上铺微流控芯片（实施例3中制备得 到的修饰后的微流控芯片)，将含有3重量％的BSA的PBS缓冲溶液滴入通道进样口，溶液 自动充满整个微流通道，封闭20分钟后，吸除通道内液体，将PBS缓冲溶液滴入微流控芯片 的通道进样口，溶液自动充满整个微流通道，在出样口吸出，清洗通道3次。
[0059] 3、加样
[0060] 将 400 μ g/mL、200 μ g/mL、100 μ g/mL、50 μ g/mL、25 μ g/mL、5 μ g/mL 的 AFP 抗原溶 液分别滴入通道(将其编号为A-G)的进样口，溶液自动充满整个微流通道，同时作空白对 照，25°C孵育20分钟后，吸除通道内液体，将PBS缓冲溶液滴入微流控芯片的通道进样口， 溶液自动充满整个微流通道，在出样口吸出，清洗通道3次。
[0061] 4、加二抗
[0062] 将1 :200 (体积比，稀释液为含有5重量％的BSA的PBS缓冲溶液)稀释的AFP检 测抗体滴入通道进样口，溶液自动充满整个微流通道，25 °C孵育20分钟后，吸除通道内液 体，揭去微流控芯片。用30ml的PBS缓冲溶液冲淋清洗基底1次。
[0063] 5、加底物液显色：在反应区浇盖辣根过氧化物酶（HRP)发光底物，室温（25°C)反 应1分钟。
[0064] 6、检测：使用突光及化学发光成像系统（Bioshine ChemiQ2550)进行检测，检测结 果如图4所示。在图4中，A通道依次通入5重量％BSA溶液，400ng/mL的AFP抗原溶液，1 : 200 (体积比，稀释液为含有5重量％的BSA的PBS缓冲溶液）稀释的AFP检测抗体溶液；B 通道依次通入5重量％BSA溶液，200ng/mL的AFP抗原溶液，1 :200 (体积比，稀释液为含有 5重量％的BSA的PBS缓冲溶液)稀释的AFP检测抗体溶液；C通道依次通入5重量％BSA溶 液，100ng/mL的AFP抗原溶液，1 :200(体积比，稀释液为含有5重量％的BSA的PBS缓冲溶 液)稀释的AFP检测抗体溶液；D通道依次通入5重量％BSA溶液，50ng/mL的AFP抗原溶液， 1 :200 (体积比，稀释液为含有5重量％的BSA的PBS缓冲溶液)稀释的AFP检测抗体溶液； E通道依次通入5重量％BSA溶液，25ng/mL的AFP抗原溶液，1 :200 (体积比，稀释液为含有 5重量％的BSA的PBS缓冲溶液)稀释的AFP检测抗体溶液；F通道依次通入5重量％BSA溶 液，12. 5ng/mL的AFP抗原溶液，1 :200 (体积比，稀释液为含有5重量％的BSA的PBS缓冲 溶液)稀释的AFP检测抗体溶液；G通道依次通入5重量％BSA溶液，空白溶液，1 :200 (体积 t匕，稀释液为含有5重量％的BSA的PBS缓冲溶液)稀释的AFP检测抗体溶液。通过图4可 知，随着抗原浓度的增加，交叉点的灰度值逐渐升高，从而对AFP的浓度进行定量检测。
[0065] 通过上述实施例可知，经过本发明的修饰方法修饰过的芯片，在进行免疫检测时， 无需借助其他设备，即可实现自动进样。
[0066] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这 些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0067] 另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0068] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【权利要求】
1. 一种微流控芯片通道的修饰方法，其特征在于，该方法包括将盐酸多巴胺溶液与微 流控芯片的通道的内表面接触。
2. 根据权利要求1所述的修饰方法，其中，在所述盐酸多巴胺溶液中，所述盐酸多巴胺 的含量为20-60mg/mL。
3. 根据权利要求2所述的修饰方法，其中，在所述盐酸多巴胺溶液中，所述盐酸多巴胺 的含量为30-50mg/mL。
4. 根据权利要求1-3中任意一项所述的修饰方法，其中，在所述盐酸多巴胺溶液中，溶 剂为pH为8-9. 5的Tris-HCl缓冲溶液。
5. 根据权利要求4所述的修饰方法，其中，在所述盐酸多巴胺溶液中，溶剂为pH为 8. 3-8. 9 的 Tris-HCl 缓冲溶液。
6. 根据权利要求1-3中任意一项所述的修饰方法，其中，将盐酸多巴胺溶液与微流控 芯片通道的内表面进行接触的条件包括：接触的温度为15-40°C，接触的时间为20-400分 钟。
7. 根据权利要求6所述的修饰方法，其中，将盐酸多巴胺溶液与微流控芯片通道的内 表面进行接触的条件包括：接触的温度为20-25°C，接触的时间为30-360分钟。
8. 根据权利要求1所述的修饰方法，其中，所述微流控芯片的材料为聚二甲基硅氧烷 或聚甲基丙烯酸甲酯。
9. 根据权利要求1所述的修饰方法，其中，所述微流控芯片包括一条或多条通道，多条 通道连通或不连通，每条通道的宽度为100微米?1毫米，高度为100微米?1毫米，长度 为3-5厘米。
10. 权利要求1-9中任意一项所述修饰方法在免疫检测方面的应用。
【文档编号】G01N33/50GK104140548SQ201310173588
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2013年5月10日 优先权日:2013年5月10日
【发明者】蒋兴宇, 沈海滢 申请人:国家纳米科学中心