专利名称：一种用于细胞凋亡研究的集成化微流控芯片及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞凋亡研究技术,特别提供了一种用于细胞凋亡研究的集 成化微流控芯片及其应用。
背景技术：
细胞凋亡是一种由基因调控的细胞主动死亡过程，与多种人类重大疾 病发生密切相关，在正常胚胎和器官发育、免疫反应、肿瘤和神经退行性 变等疾病发生过程中具有重要作用。此外，细胞凋亡还是一个复杂的细胞 信号转导过程，受来自细胞内和细胞外诸多信号的调控，并通过生物信号 在细胞间的传递实现。这一过程中涉及多种细胞功能的变化，并产生多种 细胞凋亡相关事件，如细胞膜结构和功能异常，导致细胞质膜脂双层丧失 二侧不对称性，使细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)外翻；线粒体膜功能变化导 致线粒体跨膜电位(A Wm)下降，线粒体细胞色素C释放；以及胞内核糖核
酸酶激活出现核DNA片段化等。这些事件贯穿于细胞凋亡过程的不同时 期，彼此相互联系。对这些事件过程的研究有利于阐述不同细胞凋亡诱导 因子的作用机制，并对临床诊断、治疗和药物筛选具有重要作用。
目前，常规的细胞凋亡研究过程为配制不同浓度药物溶液，在多孔 板或多平皿上进行细胞培养、浓度梯度药物施加、细胞洗涤和标记等操作， 最后以流式细胞仪、普通光学或荧光显微镜等手段进行细胞凋亡检测。该 方法存在诸多局限，主要表现为细胞需求量大，样品前处理时间长，操 作繁琐，分析多为离线进行，不易捕捉瞬间发生的细胞凋亡事件各个过程 的相关信息，难以实现对细胞凋亡动力学过程的实时分析。
微流控芯片实验室又称芯片实验室(Lab-on-a-Chip)或微流控芯片 (Microfluidic)，指的是把化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、 分离、检测，细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成或基本集成到-块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿 整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术。微流 控芯片所具有的不同操作单元技术灵活组合，整体可控和规模集成的特点 在用于细胞研究的过程中主要表现在1)芯片通道尺寸(通常10-100 ii m)与典型哺乳类细胞直径大小(10-20 Pm)相适应，利于单细胞操纵、分 析；2)芯片的多维网络结构形成相对封闭的环境，与生理状态下细胞的空 间特征接近；3)芯片通道微尺度下传热、传质较快，可以提供有利的细胞 研究环境；4)芯片可以满足高通量细胞分析的需要，可同时获取火量的生 物学信息；5)芯片多种单元技术的灵活组合使集成化的细胞研究成为可能， 诸如细胞进样、培养、分选、裂解和分离检测等过程可在一块芯片上完成。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于细胞凋亡研究的集成化微流控芯片及 其应用。本发明集成了药物浓度梯度生成、芯片细胞培养、受激、洗涤、 标记等单元操作；大大简化了细胞接种、受激、洗涤和标记操作过程，显 著降低细胞和试剂耗量，此外， 一次运行还可获得多个实验相关参数。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为；
一种用于细胞凋亡研究的集成化微流控芯片，芯片主要由两个功能单 元构成，
第一个单元为一个树状的、从上至下逐层增加分支的浓度梯度生成单
元，在其最上端设有药物入口和培养基入口；每个分支的通道为迂回的折 线形；
k二个单元为阵列式细胞培养单元，细胞培养单元由一个或一个以上 的细胞培养室相互串联作为一列，三列或三列以上相互并联构成阵列式细 胞培养单元，每两列的出口逐级相互连接，最终连接成一个出口通道，该
出口通道的末端作为细胞入口 ，在出口通道上设有冲洗液入口和染料入口 ；
此外，在第一个单元和第二个单元之间有一排"几"字形的坝结构， 用于阻挡细胞流入第一个单元；所述"几"字形的坝结构的"几"字上端 通道深度小于"几"字下端两侧通道深度；位于芯片上游的第一个单元最 下层分支的每一个通道出口都通过一个"几"字形的坝结构与位于芯片下 游的第二个单元中的一列细胞培养室入口相连接。
第二个单元中的每一列细胞培养室的个数相同，并且每两列细胞培养 室由微通道相连接，这些微通道再每两个互相连接，最终连接成一个通道； 第一个单元生成的每一种浓度的药物溶液都作用于下游第二个单元中与其 相连接的一列细胞培养室中的细胞。
所述集成化微流控芯片的应用过程如下；
将细胞悬液加入第二个单元细胞入口的储液池中，施加压力，待细胞 流入细胞培养室后，移走储液池中的细胞悬液，并使芯片中溶液处于静止 状态；
芯片在细胞培养箱中放置，置于显微镜下观察细胞是否帖壁； 待细胞贴壁后向第一个单元处于药物入口和培养基入口上方的两个储 液池中分别加入含有凋亡诱导剂最低浓度和最高浓度的培养基溶液，并使 溶液始终保持从上游第一个单元流向下游第二个单元，芯片置于细胞培养 箱中.
-一小时至三天后向第二个单元的洗涤液入口的储液池加入洗涤溶液，施 加压力，对细胞进行洗涤；
^m二个单元的标记液入口的储液池加入标记溶液，施加压力，对细胞 进行标记；
芯片置于荧光显微镜下，进行细胞凋亡检测。
本发明具有如下优点
1. 本发明只需向第一个单元的两个储液池内分别加入含有细胞凋亡诱 导剂最低浓度和最高浓度的培养基溶液就可以在第一个单元的出口处生成 浓度梯度并自动作用于第二个单元中的细胞。
2. 本发明只需向第二个单元的洗涤溶液储液池和标记溶液储液池中分
别加入洗涤液和标记液，就可进行细胞的洗涤和标记操作。
3. 本发明创造性的在芯片上集成了药物浓度梯度生成、芯片细胞培养、 受激、洗漆、标记及多种细胞响应的检测，并用于临床药物诱导肿瘤细胞 凋亡过程研究。该微流控芯片集细胞培养、药物浓度梯度自动生成、小分 子-细胞相互作用等单元操作于一体。
4. 与传统的多孔板技术相比，本发明省去了配制不同浓度药物溶液的 繁冗操作，并大大简化了细胞接种、受激、洗涤和标记操作过程，显著降 低细胞和试剂耗量，此外， 一次运行还可获得多个实验相关参数。
图1为集成化细胞凋亡研究微流控芯片的结构示意图，图中(1)为培养 基入口， (2)为药物入口， (3)为浓度梯度生成单元，(4)为细胞培养单 元，(5)为冲洗液入口， (6)为染料入口， (7)为细胞入口， (8)为坝形 结构的俯视图(a)和侧视图(b);
图2为不同浓度阿霉素作用后，典型的HepG2细胞凋亡形态学变化，(a) 光镜结果细胞皱縮，变圆，间距变大。(b)荧光结果凋亡细胞染色质 凝聚，表现橙-绿色斑点(图中箭头所指)，细胞形态改变程度随着药物作用 浓度升高而明显；
图3为不同浓度阿霉素作用后，HepG2细胞膜变化，凋亡早期，位于细 胞膜内侧的磷脂酰丝胺酸(PS)外翻，呈现绿色圆环( )，凋亡晚期细胞 膜通透性增加，表现为红色斑点外包裹绿色圆环(▲)，坏死细胞为红色(■)， 凋亡细胞比例随着药物作用浓度增加而明显增加；
图4为不同浓度阿霉素作用后，HepG2细胞线粒体膜电势(MMP)变 化，MMP耗散导致依赖MMP的Rh-123外泄，细胞荧光强度降低，其程度 随着药物作用剂量升高而增强。
具体实施例方式
一种用于细胞凋亡研究的集成化微流控芯片，芯片主要由两个功能单 元构成，
第一个单元为- -个树状的、从上至下逐层增加分支的浓度梯度生成单 元，在其最上端设有药物入口和培养基入口；每个分支的通道为迂回的折 线形；
第二个单元为阵列式细胞培养单元，细胞培养单元由一个或一个以上 的细胞培养室相互串联作为一列，三列或三列以上相互并联构成阵列式细 胞培养单元，每两列的出口逐级相互连接，最终连接成一个出口通道，该 出口通道的末端作为细胞入口 ，在出口通道上设有冲洗液入口和染料入口 ；
此外，在第一个单元和第二个单元之间有一排"几"字形的坝结构， 用于阻挡细胞流入第一个单元；所述"几"字形的坝结构的"几"字上端 通道深度小于"几"字下端两侧通道深度；位于芯片上游的第一个单元最 下层分支的每一个通道出口都通过-^个"几"字形的坝结构与位于芯片下 游的第二个单元中的--列细胞培养室入口相连接。
首先将细胞悬液加入图l所示的细胞入口储液池中，施加一定压力， 待一定数量的细胞进入细胞培养室后移走储液池中的细胞悬液，并使芯片 中溶液处于静止状态。芯片在细胞培养箱中放置数小时后，置于显微镜下 观察细胞是否贴壁。待细胞贴壁后通过芯片上游的两个入口分别加入培养 基和最高浓度药物溶液，施加一定压力，两股液流经逐级混合、分流后， 生成具有药物浓度梯度特征的一系列溶液，并直接作用于下游培养室中的 细胞。芯片置于细胞培养箱中，溶液始终保持以较小流速从浓度梯度生成 单元流向细胞培养单元。待一定时间后加入洗涤溶液，施加一定压力，对 细胞进行洗涤。再加入标记溶液并施加一定压力，对细胞进行标记。最后， 将芯片置于荧光显微镜下，进行细胞凋亡检测。
实施例l
用图l所示的微流控芯片进行细胞凋亡形态学变化研究。芯片接种肝癌 细胞(human hepatocellular carcinoma, HepG2)后置于37。C， 5%C02培养 箱中6小时。待细胞贴壁后，加入阿霉素浓度为0pM和4.0 |JM的DMEM 培养基(高糖)，芯片置于细胞培养箱中24h，并使溶液始终保持以较小流速 从浓度梯度生成单元流向细胞培养单元。加入磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)洗涤细胞，芯片置于光学显微镜下观察。然后以lmgmL—' 的丫啶橙V溴化乙啶标记细胞，并立刻置于荧光显微镜下观察。如图2所示， 阿霉素诱导HepG2细胞发生凋亡，并呈现典型的细胞凋亡形态学变化细胞 皱縮，变圆，间距变大；凋亡细胞染色质凝聚，表现为橙-绿色斑点(图中 箭头所指)。此外，细胞形态改变程度随着药物作用浓度升高而明显。
实施例2
用图1所示的微流控芯片进行细胞凋亡时细胞膜变化研究。芯片接种 HepG2后置于37。C， 5%C02培养箱中6小时。待细胞贴壁后，加入阿霉素 浓度为0 pM和4.0 pM的DMEM培养基(高糖)，芯片置于细胞培养箱 中24h，并使溶液始终保持以较小流速从浓度梯度生成单元流向细胞培养单 元。加入PBS溶液洗涤细胞，加入标记液Annexin V / PI，芯片置于暗处 15min,最后芯片置于荧光显微镜下观察。如图3所示，阿霉素诱导HepG2 细胞膜呈现特征性改变凋亡早期，位于细胞膜内侧的磷脂酰丝胺酸(PS) 外翻，呈现绿色圆环( )；凋亡晚期细胞膜通透性增加，表现为红色斑 点外包裹绿色圆环(O;坏死细胞为红色(■)。此外，凋亡细胞比例随 药物浓度增加，而明显增加。
实施例3
用图1所示的微流控芯片进行细胞凋亡时线粒体膜电势(MMP)变化 研究。芯片接种HepG2后置于37。C， 5%C02培养箱中6小时。待细胞贴 壁后，加入阿霉素浓度为0|jM禾卩4.0 |JM的DMEM培养基(高糖)，芯 片置于细胞培养箱24h，并使溶液始终保持以较小流速从浓度梯度生成单元 流向细胞培养单元。加入PBS溶液洗涤细胞，加入标记液罗丹明-123 (5|jg mL—1)，芯片置于培养箱中30min，再加入PBS溶液洗涤细胞，最后芯片置 于荧光显微镜下观察。如图4所示，阿霉素导致依赖MMP的Rh-123外泄， HepG2细胞荧光强度降低，画P耗散，其程度随着药物作用剂量升高而增强。
注在以上三个实例中，所用的一些相同的条件为 接种时，细胞悬液浓度为2-5X10fi cell mL' o
权利要求
1、一种用于细胞凋亡研究的集成化微流控芯片，其特征在于；芯片主要由两个功能单元构成，第一个单元为一个树状的、从上至下逐层增加分支的浓度梯度生成单元，在其最上端设有药物入口和培养基入口；每个分支的通道为迂回的折线形；第二个单元为阵列式细胞培养单元，细胞培养单元由一个或一个以上的细胞培养室相互串联作为一列，三列或三列以上相互并联构成阵列式细胞培养单元，每两列的出口逐级相互连接，最终连接成一个出口通道，该出口通道的末端作为细胞入口，在出口通道上设有冲洗液入口和染料入口；此外，在第一个单元和第二个单元之间有一排“几”字形的坝结构，用于阻挡细胞流入第一个单元；所述“几”字形的坝结构的“几”字上端通道深度小于“几”字下端两侧通道深度；位于芯片上游的第一个单元最下层分支的每一个通道出口都通过一个“几”字形的坝结构与位于芯片下游的第二个单元中的一列细胞培养室入口相连接。
2、 按照权利要求l所述用于细胞凋亡研究的集成化微流控芯片，其特 征在于第二个单元中的每一列细胞培养室的个数相同，并且每两列细胞 培养室由微通道相连接，这些微通道再每两个互相连接，最终连接成一个 通道。
3、 --种用于细胞凋亡研究的集成化微流控芯片的应用，其特征在于 使用权利要求l所述集成化微流控芯片，过程如下，将细胞悬液加入第二个单元细胞入口的储液池中，施加压力，待细胞 流入细胞培养室后，移走储液池中的细胞悬液，并使芯片中溶液处于静止 状态；芯片在细胞培养箱中放置，置于显微镜下观察细胞是否帖壁； 待细胞贴壁后向第一个单元处于药物入口和培养基入口上方的两个储 液池中分别加入含有凋亡诱导剂最低浓度和最高浓度的培养基溶液，并使 溶液始终保持从上游第一个单元流向下游第二个单元，芯片置于细胞培养 箱中；一小时至三天后向第二个单元的洗涤液入口的储液池加入洗涤溶液，施 加压力，对细胞进行洗涤；在第二个单元的标记液入口的储液池加入标记溶液，施加压力，对细胞 进行标记；芯片置于荧光显微镜下，进行细胞凋亡检测。
全文摘要
一种用于细胞凋亡研究的集成化微流控芯片及其应用，其主要由浓度梯度生成单元和阵列化细胞培养单元构成，位于芯片上游的浓度梯度生成单元的每一个出口都通过一个坝形结构与位于芯片下游的一列细胞培养室相连接。本发明创造性的在芯片上集成了药物浓度梯度生成、芯片细胞培养、受激、洗涤、标记及多种细胞响应的检测，并用于临床药物诱导肿瘤细胞凋亡过程研究。与传统的多孔板技术相比，省去了配制不同浓度药物溶液的繁冗操作，并大大简化细胞接种、受激、洗涤和标记操作过程，显著降低细胞和试剂耗量，并可一次运行获得多个实验相关参数。
文档编号C12M1/00GK101168717SQ20061013402
公开日2008年4月30日 申请日期2006年10月25日 优先权日2006年10月25日
发明者欣 刘, 叶囡楠, 林炳承, 秦建华 申请人:中国科学院大连化学物理研究所