专利名称：：一种微流控芯片装置及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测装置，尤其涉及一种能一次并行检测样品多种肿瘤标志物的便携式快速检测微流控芯片装置及其应用。技术背景癌症是一种威胁全人类的疾病。2007年癌症死亡人数达7，900，000，其中大约80%发生在低、中等收入国家。据08年卫生部发布的第三次全国死因调査报告显示，我国城乡居民由恶性肿瘤导致的死亡人数占总人数的22.32%,位居我国死亡原因的第二位。我国恶性肿瘤死亡率属于世界较高水平，而且呈持续的增长趋势。癌症虽然可怕，但随着现代医学的发展，它己经不再是"不治之症"。据世界卫生组织报道，30%的癌症是可以预防的，30%的癌症如能早发现、早诊断、早治疗是可以痊愈的；30%的癌症如能得到正确的治疗可以减轻痛苦，延长寿命。因此，早期发现和诊断对肿瘤的治疗与预防至关重要。但是像我国这样人口众多、医疗资源紧缺、癌症病患大多数在农村乡镇的发展中国家，要想实现全民的肿瘤与疾病的普査和监控，迫切需要一种低成本、脱离专业的医护人员和昂贵的仪器、高通量、诊断结果准确快速的检测手段。肿瘤标志物是指在恶性肿瘤发生和增值过程中，由肿瘤细胞的基因表达而合成、分泌的，或因机体对肿瘤反应而异常产生和升高的、反映肿瘤存在和生长的一类物质。这类物质有的只见于胚胎中，有的在肿瘤患者体内的含量超过正常人体的含量。通过对肿瘤标志物的分析，能够帮助从正常组织中区分肿瘤细胞，经过对肿瘤细胞核、细胞质以及细胞膜上的特性进行分析，作为肿瘤诊断、分类、预后判断、指导治疗和检测转移的临床检测手段。尤其是血清肿瘤标志物，由于样本采集方便、经济，更利于做为普适性的肿瘤检测手段。但是由于癌症基因的复杂性，现在发现的肿瘤标志物并不理想，大多数有敏感度偏低，特异性不高，不具有器官特异性等缺点。为提高肿瘤标志物检测的特异性和减少假阴性，对肿瘤的诊断多采用多种肿瘤标志物联合检测的方法。微流控芯片技术已被列入21世纪最为重要的前沿技术的行列，它是通过分析化学、微机电加工、计算机、电子学、材料科学及生物学、医学等的交叉实现从样品处理到检测的整体微型化、自动化、集成化与便携化。这样通常需要在一个实验室中，多种仪器辅助下才能完成的实验在一个芯片系统上就可以完成，这样不仅大大提高了实验速度，减少实验成本，最为重要的是减少了所需实验的样品剂量和反应时间。充分体现了当今分析设备的微型化、集成化、便携化的发展趋势，在高通量、低消耗、和大规模平行处理方面具有极大的优势。
发明内容本发明的目的是提供一种微流控芯片装置，由注射泵、并联串口、螺母、卡具、微流控芯片组件、废液槽组成，其中微流控芯片组件是由多个微流控芯片经过并联串口连接而成，卡具通过螺母固定微流控芯片组件，微流控芯片组件由并联串口连接的一端为进样端，其与注射泵连接，微流控芯片组件的另一端为出样端，其与废液槽连接。所述的微流控组件由多个微流控芯片组成，微流控芯片中构建有结构特殊的微通道。微流控芯片选用硅、高聚物等不同材质材料制作，高聚物包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧垸(PDMA，)、环氧树脂。微流控芯片中的微通道有多种设计方式，均是以尽量增加目的细胞与通道表面积的接触为原则。可以在微通道中设计排列紧密的微柱，来增加样品与表面的接触；可以在面积有限的芯片上设计多种环路，以增加通道两壁表面与样品的接触；可以在芯片的前端部分设计不同间距排列的微柱或者改变通道内径，达到按细胞大小进行分选的目的，再将分选出的细胞通过连接有特异性的配体的微通道进行目的细胞的捕获等。本发明的另一个目的是提供的一种微流控芯片装置在检测体液中肿瘤标志物中应用，通过以下步骤实现为实现目的肿瘤细胞的捕获，需要对微流控芯片进行表面功能化修饰。由于高聚物自身的缺陷，需要对其微通道表面进行修饰，改善其疏水特性，并对其功能化，连接特异性的配体分子。可以根据芯片材质、微通道功能不同而采用不同的修饰方法，如用紫外曝光、等离子体处理、化学修饰、硅烷化处理等方法来改变其疏水表面；使用静电吸附、受配体结合和共价修饰等方法，在微通道表面连接不同的特异性的配体分子。将血样收集到含有抗凝集素的离心管中4t:震荡混合，用缓冲液通过微流控芯片中的微通道，血样转到注射泵的注射器中，控制流速通过微流控芯片中的微通道；缓冲液冲洗非特异性结合的细胞，细胞经固定后，依次用荧光标记的抗角蛋白抗体、抗CD45抗体和DAPI对细胞进行染色，缓冲液冲洗去多余的染色液，荧光显微镜成像，应用荧光显微镜中的软件进行图像处理和统计分析，判断细胞的形态特征和含量，对捕获的肿瘤细胞进行定量和定性分析，从而实现肿瘤的检测。微流控芯片中捕获的肿瘤细胞进行计数，与健康人的血样和患各个分期肿瘤的病人的血样捕获的肿瘤细胞数进行对比，来进行是否患有肿瘤、肿瘤分期的判断。或者直接在微流控芯片中将捕获的细胞进行裂解后，对细胞中的肿瘤标志物的进行PCR(聚合酶链式反应)分析，也是与健康人的血样和患各个分期肿瘤的病人的血样进行相同的比较，以肿瘤标志物有无表达、表达含量高低程度等结果，对样品进行分析。免疫荧光检测原理用荧光标记的抗角蛋白抗体、抗CD45抗体和DAPI依次进入芯片对细胞进行染色。抗角蛋白抗体特异性标记表皮细胞，抗CD45抗体特异性标记白细胞，DAPI标记活细胞的核酸。抗角蛋白抗体呈阳性、抗CD45抗体呈阴性和DAPI呈阳性的细胞为脱落到体液中肿瘤细胞。用荧光显微镜进行成像，直接即可判断结果。PCR检测可以利用反转录PCR、荧光定量PCR、巢式PCR等多种方法，对捕获细胞的肿瘤标志物的表达水平进行分析。本发明的有益之处是由于微流控芯片的材质多为硅、高聚化物，价格便宜，利于推广；利用微流控芯片中的特殊构造的通道，尽量增加特异性配体与样品的接触面积，有利于从复杂的样品中筛选到目的细胞，并进行有效的富集，增加检出率；该微流控芯片实现了"一步法"从体液中直接进行目的细胞的检测，步骤简单，操作便捷；由于采用了多种肿瘤标志物联合检测的方法，一次可同时检测多种肿瘤标志物，不仅大大增加了肿瘤细胞检出的阳性率，而且需样量少，20-30mL的血液即可完成检测；由于微流控芯片组件是有多个微流控芯片独立组成，可自主制定多种肿瘤标志物组合方案，不仅可就一种组织特异性的肿瘤进行检测，还可就肿瘤的普筛进行检测；该检测装置设计合理，制作成本低、检测快速、携带便捷，尤其在临床检测中对肿瘤的检测和鉴定方面具有广阔的应用前景。图1是本发明微流控装置的结构示意图。图2是微流控组件示意图。具体实施方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1一种微流控芯片装置参见图l、图2，一种微流控芯片装置由注射泵1、并联串口2、螺母3、卡具4、微流控芯片组件5、废液槽6组成，其中微流控芯片组件5是由多个微流控芯片7经过并联串口2连接而成，卡具4通过螺母3固定微流控芯片组件5，微流控芯片组件5由并联串口2连接的一端为进样端，其与注射泵l连接，微流控芯片组件5的出样端即为微流控芯片7的出样端，分别直接与废液槽6连接。所述微流控芯片7的微通道表面根据检测要求连接有不同的特异性的、可结合肿瘤细胞的配体。微流控芯片7选用硅、高聚物(PMMA、PDMA)、环氧树脂等不同材质材料制作。实施例2结肠癌的检测选取三种肿瘤标志物作为结肠癌的检测CEA:癌胚抗原，一种酸性糖蛋白。主要存在于胎儿消化到上皮组织、姨脏和肝脏。正常成人血清中CEA的含量极低，但发生肿瘤时可重新表达，并随肿瘤分期的进展、爱细胞恶性程度的升高而逐渐升高。其中以结肠癌升高为甚，约有70%~90%显示阳性。但是CEA不是结、直肠癌的特异性抗原，它是一种较光谱的肿瘤标志物。CK19:细胞角蛋白，对非小细胞肺癌的诊断、病情监测及治疗判断有较高的临床价值。CK20:细胞角蛋白，仅在结直肠癌等细胞表达，可作为结肠癌患者血液或骨髓中肿瘤细胞转移标志物。具体步骤(1)选取特定的芯片(分别是连接抗CEA、CK19、CK20三种肿瘤标志物抗体的芯片)；(2)微流控芯片装置的连接采用实施例1的装置，其中微流控芯片组件是由3个微流控芯片经过并联串口连接而成；(3)肿瘤标志物的检测采集20例患结肠癌的患者的血样，各取15mL，将血样收集到含有抗凝剂素EDTA的离心管中，4。c震荡混合至少5min。用2-3mLPBS(磷酸缓冲液)冲洗芯片的微通道；将15mL血样转移到注射泵中的注射器里，控制流速，使血样缓慢通过微通道；PBS用〉6mL/min的速度冲洗微通道，以洗去非特异性结合的细胞。直接原位裂解细胞，收集裂解液，分别从3个芯片中收集的液体，Trizol抽提制备总的RNA，使用MBIFermentas公司的反转录试剂盒进行cDNA的合成，42。C50min，70°C15min进行逆转录；使用CEA、CK19、CK20的上下游引物进行反应，使用SYBRPremixEXTaq试剂盒进行定量PCR，反应条件93。C3min，93。Clmin,50。Clmin,72。Clmin，共40个循环。经荧光定量PCR扩增后，由仪器软件自动绘制标准曲线，得出个检测品的浓度。以浓度>500拷贝数/mL为阳性结果，浓度<500拷贝数/mL为阴性结果。所用CEA的上游引物:5'-AACTTCTCCTGGTCTCCAGCT-3，，下游引物5，隱GCAAATGCTTTAAGGAAGAAG腸3，；所用CK19的上游引物5'-AATAAATAGGATCCATGCAGGACTGTGGAAAAGA-3'，下游引物5'-TTTTAATGAATTCAGTAGATAGTAATCTCCTCCTC-3';所用CK20的上游引物5'-GAACAGGCTCAGGACTATCT-3，，下游引物5，-CCACTGTAATATGCGGTAAG-3'。表1;CEA、CK19、CK20三种肿瘤标志物联合检测20例结肠癌的阳性比例<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例3循环肿瘤细胞(CTC)的检测肿瘤细胞间的黏附力非常弱，肿瘤细胞有可能从瘤体脱落，如果脱落的细胞进入了血液或淋巴循环，循环的肿瘤细胞绝大多数在短期内死亡。只有极少具有高度活力、高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中存活下来，相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展成转移灶，因此，检测血中单个或少量循环肿瘤细胞，对推测个体患者预后的准确性和评估治疗反应的有效性具有重要意义。但是循环肿瘤细胞在代谢肿瘤病患的血中的比例是1个细胞/109个血细胞，含量极低，不易进行准确的分析和检测。但通过设计合理的微流控芯片，可以极大地增加了与循环患肿瘤细胞接触的表面积，而对其进行有效的捕获。如对前列腺癌患者进行循环肿瘤细胞的检测，一般可使用EpCAM、PSA、细胞角蛋白19(CK19)等三种肿瘤标志物进行检测。EpCAM:是一类细胞粘附分子。广泛表达于上皮来源的组织中。在很多恶性上皮肿瘤中，EpCAM的表达远远超过正常组织的表达水平，EpCAM阳性细胞的数量和阳性程度都与肿瘤发展的程度密切相关。其特异性单抗可以区分上皮和非上皮来源的组织，可作为上皮型肿瘤的可靠诊断标志物。PSA:前列腺特异性抗原，是糖蛋白类物质。存在于前列腺内质网和前列腺上皮细胞及分泌物中，通常血液中不含或知有极微量的PSA。绝大多数前列腺癌患者血清PSA水平增高。是目前前列腺癌中最敏感的肿瘤标志物。PMSA:前列腺特异膜抗原。是一种确定高分级前列腺癌的肿瘤标志物。具体步骤(1)选取特定的芯片(分别是连接EpCAM、PSA、细胞角蛋白19(CK19)三种肿瘤标志物相关配体的芯片)；(2)微流控芯片装置的连接采用实施例1的装置，其中微流控芯片组件是由3个微流控芯片经过并联串口连接而成；(3)肿瘤标志物的测定取10例前列腺癌患者的血样，各取15mL，将血样收集到含有抗凝剂素EDTA的离心管中，4X:震荡混合至少5min。用2-3mLPBS(磷酸缓冲液)冲洗芯片的微通道；将15mL血样转移到注射泵中的注射器里，控制流速，使血样缓慢通过微通道；PBS用〉6mL/min的速度冲洗微通道，以洗去非特异性结合的细胞。用多聚甲醛固定细胞，使用TritonX-100通透细胞后，进行捕获细胞的荧光染色。依次通过用荧光标记的抗角蛋白抗体、抗CD45抗体和DAPI对细胞进行染色。经荧光显微镜成像，抗角蛋白抗体呈阳性、抗CD45抗体呈阴性和DAPI呈阳性的细胞为肿瘤细胞。表2:利用EpCAM、PSA、CK19三种肿瘤标志物的特异性抗体从血样中捕获的CTC数目<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>根据捕获的CTCs细胞的数目的多少可以肿瘤分期进行辅助判断。本发明涉及的序列-<210>1<211〉21<212>DNA<213>人工序列<220><221>上游引物<222〉G)."(21)<223>根据CEA基因序列设计的上游引物，<400〉15，-AACTTCTCCTGGTCTCCAGCT-35<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>下游引物<222>(1)...(21)<223>根据CEA基因序列设计的下游引物<400〉25，-GCAAATGCTTTAAGGAAGAAG-3'<210>3<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><221>上游引物<222〉(1)…(34)<223>根据CK19基因序列设计的上游引物<400〉35'-AATAAATAGGATCCATGCAGGACTGTGGAAAAGA-3'<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><221>下游引物<222>(1)…(35)<223>根据CK19基因序列设计的下游引物<400>45'-TTTTAATGAATTCAGTAGATAGTAATCTCCTCCTC-3'<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>上游引物<222>(1)…(20)<223>根据CK20基因序列设计的上游引物<400>55'-GAACAGGCTCAGGACTATCT-3，<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>下游引物<222>(1)…(20)<223>根据CK20基因序列设计的下游引物<400>65'-CCACTGTAATATGCGGTAAG-3'权利要求1.一种微流控芯片装置，其特征是由注射泵(1)、并联串口(2)、螺母(3)、卡具(4)、微流控芯片组件(5)和废液槽(6)组成，其中微流控芯片组件(5)由微流控芯片(7)经过并联串口(2)连接而成，用卡具(4)通过螺母(3)固定微流控芯片组件(5)，微流控芯片组件(5)由并联串口(2)连接的一端为进样端，其与注射泵(1)连接，微流控芯片组件(5)的另一端为出样端，其与废液槽(6)连接。2.根据权利要求1所述的一种微流控芯片装置，其特征是微流控芯片(7)的材质选用硅、高聚物或环氧树脂中的一种。3.权利要求1所述的一种微流控芯片装置在检测体液中肿瘤标志物中应用。全文摘要本发明提供一种微流控芯片装置，由注射泵、并联串口、螺母、卡具、微流控芯片组件、废液槽组成，微流控芯片组件由微流控芯片经过并联串口连接而成，卡具通过螺母固定微流控芯片组件，微流控芯片组件的一端与注射泵连接，另一端与废液槽连接。本发明设计合理，制作成本低、操作便捷、检测快速、携带便捷。实现了“一步法”从体液中直接进行目的细胞的检测，可在检测体液中多种肿瘤标志物中应用。本发明装置对肿瘤的检测和鉴定具有广阔的应用前景。文档编号G01N33/50GK101403745SQ200810122080公开日2009年4月8日申请日期2008年10月31日优先权日2008年10月31日发明者颖牟,王琳琳,伟金,金钦汉申请人:浙江大学