专利名称：基于微流控芯片快速检测分析阿米巴抗体的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，涉及ー种基于微流控芯片快速检测分析阿米巴抗体的方法及其应用，具体涉及ー种基于微流控芯片专门用于高通量快速阿米巴病血清学诊断方法及其应用。
背景技术：
溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica, E. h)是引起阿米巴性结肠炎和肠外脓肿的病原体，具有侵入宿主组织或器官、适应宿主免疫反应和表达致病因子的能力。 据统计，全世界约有五千多万人感染溶组织内阿米巴，毎年有10万患者死于阿米巴病(amoebiasis)，为仅次于疟疾的第二种致死性原虫病。我国的平均感染率为0. 949%，感染人数估计为1069万(1992年数据)。当前临床诊断阿米巴感染的传统方法是从粪便中检出溶组织内阿米巴滋养体或包囊，但此方法的检出率不高，实践显示，对于阿米巴肝脓肿病例也不易从脓液中检出滋养体；而血清学检验对于诊断侵袭性阿米巴病具有其高敏感性和无创伤性的特点，且大多数无症状包囊携带者和阿米巴结肠炎患者血清中存在抗溶组织内阿米巴抗体，因此，血清学诊断是重要的阿米巴病实验室诊断方法之一。目前血清学诊断主要采用酶联免疫分析；酶联免疫分析(ELISA)的原理是把抗原或抗体的固相化，同时也将抗原或抗体用酶标记，结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(測定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应；用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开，再加入酶标记的抗原或抗体，通过反应而结合在固相载体上，此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使測定方法达到很高的敏感度；但是ELISA常规免疫分析通常需要数小时甚至一天以上，操作过程复杂，需消耗大量昂贵的免疫试剂，且检测设备较大，并经常伴随着非特异性吸附等诸多缺点，难以满足现场检验要求。20世纪90年代发展起来的微流体学科是指操作微小网络通道(5-500微米)中流体的科学技术，是分子生物学技术、微加工技术、机械制造技术、计算机技术等多种现代技术的发展与融合，是基于大規模平行处理生物信息分子原理的微型装置，具有信息通量大、自动化、系统化的特点；其中微流体芯片用于操作、传输微升(10_6L)至毫微微升(10_15L)量级的流体，可将生化反应的若干步骤包括分析、洗涤、检测等集成在ー块或几块微流体芯片上，其微通道孔径只有微米级大小，具有浓缩和富集的作用，可加速反应缩短测试时间，从而大大降低了测试成本。与常规的实验技术相比，上述技术极大降低了试剂的消耗量(至少3个数量级)、同时分析产生的废液极少；在微小范围内的能量传递、物质分散更快更均匀，热能传导快，也更易实现各种操控，因此反应快、收率高，污染少、成本低。目前，微流控芯片已从分离检测发展为包括复杂试样前处理的高功能全分析系统，从分析工具发展到包括在线检测的微型化学反应与合成手段。在微流控芯片上进行免疫分析，将微流控芯片的分析能力和抗原-抗体反应的特异性相结合，能有效的克服常规免疫分析的缺点，使得反应效率提高，操作步骤简化，检验时间缩短，样品、试剂和能量消耗大大降低。微流控芯片多种功能结合与集成化的特点使微流控芯片上的免疫分析与常规免疫分析相比有很多潜在的优势，因此受到越来越多的关注。但目前还未见有关基于微流控芯片快速检测分析阿米巴抗体的方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷和不足，提供ー种基于微流控芯片快速检测分析阿米巴抗体的方法及其应用，尤其涉及一种基于微流控芯片专门用于高通量快速阿米巴病血清学诊断方法及其应用。具体而言，本发明以微流控芯片为基础，建立ー种基于微流控芯片快速检测分析阿米巴抗体的方法，其包括如下步骤
(1)将抗溶组织内阿米巴抗体泵入微流控芯片的分析室；
所述的微流控芯片的分析室为整体柱或聚合填料灌柱，其中，聚合填料为硅胶填料或其它有机聚合物，本发明优选有机聚合微球；
(2)泵入数个填料体积的溶组织内阿米巴蛋白溶液，通过特异性结合，使溶组织内阿米巴抗原与聚合微球填料结合；
(3)将含有5%牛白蛋白的磷酸盐缓冲液泵入微流控芯片分析室，对结合重组溶组织内阿米巴抗原的聚合微球进行封闭；
(4)待测血清经稀释后，泵入微流控芯片的分析室，血清中的抗溶组织内阿米巴抗体特异性与聚合微球上的重组溶组织内阿米巴蛋白结合；
(5)将标记的抗人抗体泵入微流控芯片的分析室；
(6)由信号采集模块采集数据，并采用软件分析阿米巴抗体。本发明方法的步骤(I)中，所述的抗溶组织内阿米巴抗体选自单克隆抗体或多克 隆抗体；所述的抗溶组织内阿米巴抗体能抗天然溶组织内阿米巴蛋白抗体、重组溶组织内阿米巴蛋白抗体或重组融合溶组织内阿米巴蛋白的标签的抗体，优选抗重组溶组织内阿米巴蛋白抗体；
本发明方法的步骤(I)中，所述的微流控芯片由样品富集及免疫分析模块、信号采集模块和芯片的系统控制模块组成；
其中，
所述的样品富集及免疫分析模块由并行的一个或几个单独的纳升体积的免疫色谱柱微分析室所组成，每个分析室连接有多个进样空和出样ロ，每个分析室通过聚合填料键合固定抗体蛋白或抗原，能够和样品混合物中的抗原发生特异性免疫反应，免疫分析信号由标记的反应物(抗体或抗原)实现，经过多次洗涤之后，免疫标记信号的产生的变化如荧光強度的变化可被信号采集模块采集分析；
所述的信号采集模块由紫外LED和荧光光敏器件阵列组成，血清中抗阿米巴特异性抗体与阿米巴抗原的特异性结合后，与标记的羊抗人ニ抗结合导致的光学信号都可被光敏器件阵列采集并传至到微处理器(计算机)中和数据库相比较，来分析检测血清中特异性抗阿米巴原虫抗原的抗体浓度；
所述的芯片的系统控制模块中，硬件部分主要由控制部分(计算机)，操作系统(集成化微流体芯片，数控界面)和数据采集、数据分析部分(计算机)组成，软件部分主要包括LABVIEff程序(控制)和ImagePro程序(数据分析)。本发明方法的步骤(I)中，所述的微流控芯片的材料为PDMS高分子聚合材料。本发明方法的步骤(I)中，所述的微流控芯片的分析室数量可由实际情况确定，如样品数及其中各成分的性质差别；在本发明的一个实施例中制备了ー个单样品的微流控芯片，可根据实际情况将该单通道以不同方式并联、串联。本发明方法的步骤(2)中，所述的重组溶组织内阿米巴蛋白不受特别限制，其选自 溶组织内阿米巴的260kDa Gal/GalNAc可抑制性凝集素、150kDa Gal/GalNAc可抑制性凝集素或上述两种分子的的多肽片段，优选150kDa Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段。本发明方法的步骤(2)中，所述的重组溶组织内阿米巴蛋白为标签融合蛋白，蛋白标签不受限制，选自组氨酸残基组成的融合标签、Flag标签、MBP (麦芽糖结合蛋白)标签、GST (谷胱甘肽巯基转移酶)标签、HA标签蛋白、C-Myc标签蛋白、AviTag标签、SNAP-Tag或HaloTag 标签，优选组氨酸残基组成的融合标签。本发明方法的步骤(5)中，所述的标记的抗人抗体不受物种来源限制，优选羊抗人抗体。本发明方法的步骤(5)中，所述的抗人抗体的标记是酶标抗体或荧光标记抗体。本发明方法的步骤(6)中，所述的信号采集模块由紫外LED和荧光光敏器件阵列组成，对免疫分析结果结合导致的光学信号都可进行采集并传至微处理器(计算机)分析。与现有技术相比，本发明具有如下优点在微流控芯片上进行阿米巴病血清学诊断，将微流控芯片的分析能力和抗原-抗体反应的特异性相结合，能有效的克服常规免疫分析的缺点，使得反应效率提高，操作步骤简化，检验时间缩短，能大量降低病人血清样本使用量，试剂和能量消耗大大降低，从降低整个检测成本，同时该方法自动化程度高，能防止标本间的污染，提高诊断准确性，可用于临床诊断阿米巴感染领域。
图I是本发明的微流控芯片设计图。图2是本发明酶联免疫吸附试验(ELISA)检测阿米巴病患者血清結果。图3是本发明间接免疫荧光(IFA)检测阿米巴病患者血清結果。图4是本发明以微流控芯片对阿米巴病患者进行血清学诊断結果。
具体实施例方式实施例I微流控芯片制备
将硅片放入Piranha溶液(98%浓硫酸30%双氧水=7 3)煮沸清洗15min。用去离子水冲洗5遍后用氮气吹干，并在200°C烘培30min ;将Microchem公司的SU-8胶倒在硅片中央，缓慢旋转，使SU-8覆盖住硅片大部分区域；用旋涂机以3000转/min旋涂60s，使胶分布较为均匀，静置IOmin缓解边缘突起效应；随后进行软供，软烘的目的是使SU-8光刻胶中的溶剂挥发，エ艺控制的关键是使溶剂挥发以可控的速率进行；在65°C、95°C和65°C分别保持3min、6min和3min。之后以0. 5 V /min的速率缓慢降至室温；采用接触式曝光机(波长365nm);曝光后烘培(PEB, post exposure bake);再热板上以5°C/min的速率由室温逐步升到95°C，期间在65°C和95°C分别保持Imin和5min，之后以0. 5°C /min的速率缓慢降至室温，显影在通风厨中进行，显影液的主要成分是丙ニ醇甲醚醋酸酷；将模具放入显影液中显影7min，之后分别用异丙醇和去离子水清洗干净，并用氮气吹干，在热板上120°C加热5min, 180°C加热5min，200°C加热20min，在缓慢降至室温；将PDMS单体与固化剂按照5 1的质量配比混合均匀，除净气泡；倒在经三甲基氯硅烷处理过的SU-8模具上，在调整好的水平热板上80°C保持Ih固化，形成上层具有反应微通道层的基片；在硅片上甩涂光刻胶，经紫外曝光、显影，制成硅基光阳模，用三甲基氯硅烷在气相中熏蒸5min，使其表面硅烷化， 以防止在注塑过程中PDMS的粘附，并且具有控制通道的PDMS层单体与固化剂的比例为18 1，相对较软；在甩胶机上2000转/min甩涂35s，形成下层具有控制阀门通道的基片；键合及接ロ制作，将上层基片打孔，下层基片打孔用于控制通道；上下两片仔细对合，80°C过夜固化，整个芯片结构如图I所示。实施例2 .酶联免疫吸附试验(ELISA)检测阿米巴病患者血清
96孔酶标板姆孔加入含IOOng溶组织内阿米巴蛋白的Coating Buffer 100ml,4°C湿盒中过夜。PBS (含0.05% Tween20)洗板后每孔加入含3%脱脂奶的PBS 400ml，湿盒中室温封闭lh。每孔中分别加入IOOml健康人或病人血清(1:400稀释)，阴性对照为健康人血清(1:400稀释)湿盒中室温孵育lh。PBS (含0.05% Tween20)洗板后每孔中加入IOOml辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG (1:1000稀释)100ml，湿盒中室温孵育lh。PBS (含0. 05% Tween20)洗板后加入显色液200ml/孔，室温下避光反应30min，最后每孔加入2MH2SO4 50ml终止显色反应。酶标仪490nm测定吸光度。如图2所示，结果表明12名阿米巴病患者血清抗体均为阳性，其中I号病人的血清中抗体反应最強，12号最弱。实施例3间接免疫荧光(IFA)验证阿米巴病患者血清反应性
将阿米巴病患者血清分别按1:64稀释。以溶组织内阿米巴滋养体包被抗原片，用含5%脱脂奶的PBS，每孔50ml湿盒中封闭15分钟；吸去抗原孔中封闭液后加入稀释的血清标本，湿盒中室温孵育30分钟；PBS洗涤抗原片四次后加入异硫氰盐荧光素标记的山羊抗人IgG (1:50稀释)室温孵育30分钟，PBS洗涤四次，荧光显微镜观察結果。如图3所示，结果表明显示12名阿米巴病人的血清中抗体均可与溶组织内阿米巴滋养体表面特异性结合，反应强度与ELISA结果相一致。实施例4以微流控芯片对阿米巴病患者进行血清学诊断
经进样通道将聚合材料填料灌注装柱，闭合柱底阀门，控制阀门气压不超过20psi，同时控制装柱速度，待填料装满后进缓冲液平衡色谱柱，将抗溶组织内阿米巴抗体泵入微流控芯片的分析室后，经过数次PBS洗涤，泵入数个填料体积的溶组织内阿米巴蛋白溶液，通过特异性结合，使溶组织内阿米巴抗原与聚合微球填料结合；经数次PBS洗涤后，将含有有5%牛白蛋白的PBS泵入微流控芯片分析室，对结合了重组溶组织内阿米巴抗原的聚合微球进行封闭；随后将阿米巴病患者的血清经稀释后，泵入微流控芯片的分析室，血清中的抗溶组织内阿米巴抗体特异性与聚合微球上的重组溶组织内阿米巴蛋白结合；经数次PBS洗涤后，将标记的抗人抗体泵入微流控芯片的分析室，抗体的特异性结合导致的光学信号可被信号采集模块的光敏器件阵列采集并传至到微处理器(计算机)中和数据库相比较，来分析样品。整个测试系统控制硬件部分主要由控制部分(计算机)，操作系统(集成化微流体芯片，数控界面)和数据采集、数据分析部分(计算机);软件系统主要包括LABVIEW程序(控制)和ImagePro程序(数据分析)。如图4所示，结果表明12名阿米巴病患者血清中抗溶组织内阿米巴抗体均可被该微流控芯片检测出，其血清中抗溶组织内阿米巴特异性抗体的含量与ELISA和IFA结果相一致；1号病人血清中抗体含量最高，12号病人最低；这些结果显示基于微流控芯片专门用于高通量快速阿米巴病血清学诊断方法可用于阿米巴病患者的血清学诊断。上述实施例的结果表明，本发明与传统血清学诊断方法，如酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光进行对比和验证，证实基于微流控芯片的阿米巴病血清诊断方法与传统血清 学诊断结果相一致，具备血清标本使用量低、试剂和能量消耗低、检测成本低的特点，同时本方法自动化程度高，能防止标本间的污染，提高诊断准确性。
权利要求
1.ー种基于微流控芯片快速检测分析阿米巴抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)将抗溶组织内阿米巴抗体泵入微流控芯片的分析室； (2)泵入填料体积的溶组织内阿米巴蛋白溶液，溶组织内阿米巴抗原与聚合微球填料结合； (3)将含有5%牛白蛋白的磷酸盐缓冲液泵入微流控芯片分析室； (4)待检血清经稀释后，泵入微流控芯片的分析室，血清中的抗溶组织内阿米巴抗体特异性与聚合微球上的重组溶组织内阿米巴蛋白结合； (5)将标记的抗人抗体泵入微流控芯片的分析室； (6)由信号采集模块采集数据，并采用软件分析阿米巴抗体。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)的抗溶组织内阿米巴抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述的抗溶组织内阿米巴抗体抗天然溶组织内阿米巴蛋白抗体、重组溶组织内阿米巴蛋白抗体或重组融合溶组织内阿米巴蛋白的标签的抗体。
4.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述的抗溶组织内阿米巴抗体抗重组溶组织内阿米巴蛋白抗体。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)的微流控芯片由样品富集及免疫分析模块、信号采集模块和芯片的系统控制模块组成； 其中， 所述的样品富集及免疫分析模块由并行的一个或几个单独的纳升体积的免疫色谱柱微分析室组成，每个分析室连接有多个进样空和出样ロ，每个分析室通过聚合填料键合固定抗体蛋白或抗原； 所述的信号采集模块由紫外LED和荧光光敏器件阵列组成； 所述的芯片的系统控制模块中，硬件部分主要由控制部分、操作系统和数据采集、数据分析部分组成，软件部分主要包括LABVIEW程序和ImagePro程序。
6.根据权利要求I或5所述的方法，其特征在于，所述的微流控芯片采用PDMS高分子聚合材料制备。
7.根据权利要求I或5所述的方法，其特征在于，所述的微流控芯片的分析室为整体柱或聚合填料灌柱。
8.根据权利要求I或5所述的方法，其特征在于，所述的聚合填料为硅胶填料或有机聚合微球。
9.根据权利要求I或5所述方法，其特征在于，所述的微流控芯片的分析室単独或连接使用。
10.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的重组溶组织内阿米巴蛋白选自溶组织内阿米巴的260kDa Gal/GalNAc可抑制性凝集素、150kDa Gal/GalNAc可抑制性凝集素，或上述两种分子的多肽片段。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的重组溶组织内阿米巴蛋白为150kDa Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段。
12.根据权利要求I所述方法，其特征在于，所述步骤(2)的重组溶组织内阿米巴蛋白为标签融合蛋白，其选自组氨酸残基组成的融合标签、Flag标签、MBP标签、GST标签、HA标签蛋白、C-Myc标签蛋白、AviTag标签、SNAP-Tag或HaloTag 标签。
13.根据权利要求12所述方法，其特征在于，所述步骤(2)的重组溶组织内阿米巴蛋白为组氨酸残基组成的融合标签。
14.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)的标记的抗人抗体为羊抗人抗体。
15.根据权利要求I所述方法，其特征在于，所述的抗人抗体的标记为酶标抗体或荧光标记抗体。
全文摘要
本发明属于生物医学领域，涉及一种基于微流控芯片快速检测分析阿米巴抗体的方法及其应用。本发明以微流控芯片为基础，建立一种基于微流控芯片快速检测分析阿米巴抗体的方法，本发明方法在微流控芯片上进行阿米巴病血清学诊断，将微流控芯片的分析能力和抗原-抗体反应的特异性相结合，能有效的克服常规免疫分析的缺点，使得反应效率提高，操作步骤简化，检验时间缩短，能大量降低病人血清样本使用量，试剂和能量消耗大大降低，从降低整个检测成本，同时该方法自动化程度高，能防止标本间的污染，提高诊断准确性，可用于临床诊断阿米巴感染领域。
文档编号G01N35/00GK102645543SQ20111004160
公开日2012年8月22日 申请日期2011年2月21日 优先权日2011年2月21日
发明者付永锋, 刘思秀, 程训佳, 章黎, 赵望, 隋国栋 申请人:复旦大学