Xho I单酶 切、BamHI和XhoI双酶切鉴定该重组质粒，其酶切体系如表6所示：
[0105]表6亚克隆酶切体系中各组分含量
[0108] 经过酶切和PCR鉴定，获得重组原核表达质粒pET32a-〇mpHM。
[0109] 2. 2. 2重组表达质粒pET32a-〇mpHM的诱导表达
[0110] a重组质粒pET32a-〇mpHM的提取：挑取已鉴定含阳性重组质粒pET32a-〇mpHM的 DH5 a菌种划线接种于含Amp的LB琼脂平板上，37°C培养过夜，次日取单个菌落接种于含 Amp的LB液体培养基中，剧烈振荡培养10~16小时，离心收集菌液，按OMEGA质粒DNA小 量提取试剂盒说明进行重组质粒的提取与纯化。
[0111] b重组质粒pET32a-〇mpHM转化表达菌：采用氯化钙法制备E. coli BL21 (DE3)感受 态细胞，并将上述提取的重组质粒pET32a-〇mpHM转化到表达宿主菌E. coli BL21(DE3)中。
[0112] c重组质粒pET32a-〇mpHM的诱导表达：从上述LB固体培养基上，挑取阳性克隆 菌，接种LB液体培养基，37°C培养过夜，次日取菌液按1:50的比例接入含Amp的LB液体 培养基中，剧烈振荡培养至0D600=0. 4时，分别加入IPTG诱导培养，收集lmL培养菌液， 4°C 13000r/min离心2min，弃上清，沉淀中加入40 y 1超纯水和10 y 1 10XSDS上样缓冲 液，100°C水浴加热变性lOmin，进行12% SDS-PAGE凝胶电泳，观察表达结果。
[0113] d重组质粒pET32a-〇mpHM表达产物的可溶性分析：将37°C下IPTG = 0. 4mmol/ L诱导表达过夜的菌液和空载体菌液各200ml，分别按下步骤处理：4°C，10000r/min离心 5min，菌体沉淀用20mL 20mmol Tris-HCl(pH8. 0)悬浮；置-20°C过夜后，超声波（冰浴）间 歇破碎菌体（600w，30sec/次，10次），4°C，10000r/min离心10min，取上清备用①；沉淀用 10mL 尿素液（10mmol/L PBS+2mol/L 尿素）悬浮，4°C，10000r/min 离心 10min 后，沉淀再次 用10mL洗液悬浮，重复洗涤三次后，用适量尿素溶液（10mm〇l/L PBS+8mol/L尿素）溶解沉 淀②，低温保存备用。分别取适量的上清①和尿素溶液溶解的沉淀②，向其中加入40 y 1超 纯水和10 y 1 10XSDS上样缓冲液，100°C水浴加热变性10min，进行12% SDS-PAGE凝胶电 泳，将凝胶用考马斯亮蓝染色后，观察结果。
[0114] 2. 2. 3重组质粒pET32a-〇mpHM表达条件的优化
[0115] a诱导剂IPTG的浓度优化：取含重组质粒pET32a-〇mpHM的表达宿主菌 BL21 (DE3)，接种于含Amp的LB液体培养基中，37°C振摇培养过夜。次日按1:50转接种于 含Amp的LB液体培养基中，37°C培养培养至0D600值约0. 4时，取其中4只50ml锥形瓶， 分别加入 IPTG 至终浓度为 0mmol/L、0. 4mmol/L、0. 8mmol/L、l. 2mmol/L 37°C诱导 4h 后，按 上述方法对样品进行处理，12% SDS-PAGE电泳，观察结果。
[0116] b温度条件优化：取含重组质粒pET32a-〇mpHM的表达宿主菌BL21 (DE3)，接种于 含Amp的5mL LB液体培养基中，37°C振摇培养过夜。次日按1:50转接种于含Amp的LB液 体培养基中，37°C培养培养至0D600值约0. 4时，取其中3只试管，分别加入IPTG至终浓 度为0. 4mmol/L，分别置于25°C、30°C、37°C诱导4h，按上述常规方法对样品进行处理，12% SDS-PAGE电泳，观察结果。
[0117] c诱导时间优化：取含重组质粒pET32a-〇mpHM的表达宿主菌BL21 (DE3)，接种于含 Amp的LB液体培养基中，37°C振摇培养过夜。次日按1:50转接种于含Amp的LB液体培养 基中，继续培养至0D600值约0. 4时，加入IPTG至终浓度为0. 4mmol/L，37°C分别诱导0、5、 7、9h，吸取lmL培养液，按上述方法对样品进行处理，12% SDS-PAGE电泳，观察结果。
[0118] 2. 3鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的大量制备与纯化
[0119] 2.3.1鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的大量制备（上清处理）
[0120] 将诱导表达的500mL菌液于4 °C 10000r/min离心10min，将菌体沉淀用 40mL20mmolTris-HCl (pH8. 0)悬浮；超声波（冰浴）间歇破碎菌体（200w，30sec/次，5~ 10次），4°C 10000r/min离心10min。取上清为可溶性鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白， 4 °C保存备用。
[0121] 2. 3. 2鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的纯化
[0122] 镍琼脂糖凝胶（Ni2+-NAT)亲和层析纯化鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白：根据 融合蛋白的6-His标签对镍离子特殊的亲和作用，使带有标签的融合蛋白能够结合于镍琼 脂糖凝胶上，改变洗脱液的条件将其洗脱，而达到纯化的目的。具体操作步骤为：
[0123] (1)装柱：镍琼脂糖凝胶装柱，柱床体积约为40mL ;
[0124] (2)平衡：用平衡缓冲液约5个床体积平衡层析柱，流速为lmL/min ;
[0125] (3)上样：将0. 45 ym滤膜过滤的可溶性上清蛋白样品约50mL，加入层析柱中，流 速为 0? 4mL/min ；
[0126] (4)洗涤：用平衡缓冲液再洗2-5个床体积，流速为lmL/min ;
[0127] (5)洗脱：分别用含20、50、lOOmmol咪唑的洗脱缓冲液进行梯度洗脱，流速为lmL/ min，收集各梯度的洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；
[0128] (6)清洗：用超纯水洗5个柱床体积，再用25%的乙醇洗3个柱床体积，流速为 lmL/min，回收镍琼脂糖凝胶柱，于4°C中保存。
[0129] 3实验结果
[0130] 3. 1鸭疫里默氏杆菌OmpH截段基因的扩增、T-克隆与鉴定结果
[0131] 3. 1. 1鸭疫里默氏杆菌OmpH截段基因的PCR扩增结果
[0132] 以RA-CH-1基因组DNA为模板对OmpH截段基因进行PCR扩增，其产物经1. 0%琼 脂糖凝胶电泳，获得了一条约234bp的特异性DNA条带（图1)。
[0133] 3. 1. 2鸭疫里默氏杆菌OmpH截段基因T克隆鉴定结果
[0134] PCR产物经胶回收纯化后，与pMD19-T(simple)载体连接并转化感受态细胞 DH5a，得到的T克隆命名为pMD19-〇mpHM。对pMD19-〇mpHM进行PCR、酶切（图2 :重组质粒 pMD19-〇mpHM用BamH I和Xho I双酶切得到两个片段，小片段的分子量大小约为234bp) 和测序鉴定，结果表明1'克隆所获得的〇11^11截段基因〇嫩序列（5￡0 1〇勵:2所示）同已 知的鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1的OmpH截段基因DNA序列完全一致。
[0135] 3. 2原核表达质粒pET32a-〇mpHM的构建与鉴定、诱导表达及其优化结果
[0136] 3. 2. 1重组表达质粒pET32a-〇mpHM的构建与酶切鉴定
[0137] 用BamH I和Xho I双酶切T克隆质粒后回收目的片段，与经相同酶切的pET_32a 表达载体进行连接并转化DH5a，得到重组表达质粒pET32a-〇mpHM，经BamH I和Xho I双 酶切后得到两条片段，Xho I、BamH I单酶切后得到一条片段，且大小与理论值相符，表明 重组原核表达质粒构建成功（图3)。
[0138] 3. 2. 2重组质粒pET32a-〇mpHM的诱导表达
[0139] 在37°C条件下，IPTG加入浓度为0.4mmol/L，诱导表达过夜，空载体转化菌 株在约20kDa处出现一特异性蛋白条带，为载体上标签蛋白本身大小；重组表达质粒 pET32a-〇mpHM表达的重组融合蛋白在大约28kDa处，与理论值相符；另外，表达蛋白可溶 性分析结果显示其主要存在于上清中，说明重组表达蛋白在菌体中以可溶的形式存在（图 4)〇
[0140] 3. 2. 3重组质粒pET32a-〇mpHM表达条件的优化
[0141] a IPTG浓度的优化：在37°C条件下，加入IPTG使其终浓度分别为Ommol/L、 0. 4mmol/L、0. 8mmol/L、1. 2mmol/L诱导培养4h，结果显示：随IPTG浓度的增高，表达量有 所增加，且IPTG浓度为0. 4mmol/L、0. 8mmol/L、1. 2mmol/L时表达量相差不多，当IPTG = 1. 2mmol/L时表达量略高于其它浓度（图5)。因此，选择1. 2mmol/L的IPTG浓度作为诱导 表达浓度。
[0142] b诱导温度条件的优化：IPTG终浓度为0. 4mmol/L，分别于25°0、30°0、37°0诱导 4h，结果显示，当温度在37 °C时，诱导蛋白量较少，而当在25 °C和30 °C时表达量较高，且 25°C时的表达量略高于30°C，故选择温度25°C作为最佳诱导温度（图6)。
[0143] c诱导时间的优化：在IPTG浓度为0. 4mmol/L，37°C条件下，分别诱导0h、5h、7h、 9h，结果表明3h诱导的蛋白表达量很少，5h-9h的重组蛋白表达量较高，且诱导9h的蛋白表 达量略高于5h、7h (图7)，因此，选择9h作为最佳诱导时间。
[0144] 实施例2鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的纯化
[0145] 将实施例1制得的含有鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的表达产物经过收集 菌体、超声波破碎、收集上清等一系列处理后，镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化重组OmpH截段 重组蛋白。蛋白样品过柱纯化后的UV曲线图显示出3个峰，峰1为穿透峰，峰2为50mmol 咪唑洗脱峰，峰3为lOOmmol咪唑洗脱峰。同时收集不同浓度咪唑洗脱峰，进行SDS-PAGE 电泳，检验纯度及浓度，结果显示：只有lOOmmol咪唑洗脱峰中含有大量高纯度的OmpH截段 重组蛋白（图8)。将纯化的OmpH截段重组蛋白经超滤管浓缩后，用核酸蛋白仪测定蛋白的 终浓度，分装后备用。
[0146] 实施例3鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋