专利名称：具抗肿瘤活性的羊毛甾烷型三萜化合物及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及三萜类化合物，尤其涉及具有抗肿瘤活性的羊毛甾烷型三萜化合物及
其制备方法，本发明还涉及该羊毛甾烷型三萜化合物作为抗肿瘤剂的应用，属于生物医药 领域。
背景技术：
肿瘤是威胁人类健康的第一杀手，寻找有效的抗肿瘤化合物是新药筛选的热点之 一。灵芝自古以来都是扶正固本的重要中药，在祖国医学对抗癌症的领域内发挥了独到作 用。研究表明，羊毛甾烷类三萜和多糖类成分是灵芝中重要的抗肿瘤活性物质基础。目前 已经发现了一百多种的灵芝三萜，其中，ganoderic acid U， V， W， X， Y和Z等大多数具有羊 毛甾烷母核的化合物具有抗肿瘤活性。该类物质抗肿瘤的机理主要与细胞毒作用直接杀死 或者加快癌细胞的凋亡有关。因此，尽可能多的制备羊毛甾烷类的衍生物并广泛开展活性 筛选及构效关系的研究是进一步加快抗肿瘤活性物质发现步伐的有力途径，并且有可能进 一步发展成为抗肿瘤的药物。
发明内容
本发明目的之一是提供一类具有具有抗肿瘤活性的羊毛甾烷型三萜化合物或其 可药用的盐。 本发明目的之二是提供一种制备上述具有抗肿瘤活性的羊毛甾烷型三萜化合物 的方法。 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的 具有抗肿瘤活性的羊毛甾烷型三萜化合物，其结构式为式I、 II、 III、 IV或V所
示
式I
4<formula>formula see original document page 5</formula> 式II
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<formula>formula see original document page 5</formula>
式IV
当然，可以制备本发明化合物酸加成的盐，这些盐包括在本发明之中。
本发明化合物的酸加成盐优选为药学上可接受的，与适当的酸(例如盐酸、醋酸、 硫酸)形成无毒的盐，除了药物上可接受的盐以外，其它的盐也包括在本发明之中。
—种制备上述化合物(I-V)的方法，包括
(1)制备灵芝子菌丝体或子实体的乙醇提取物；
(2)将灵芝子菌丝体或子实体的乙醇提取物清膏用水分散后，用石油醚反复萃取， 再用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯提取物； (3)乙酸乙酯提取物上硅胶柱，以氯仿-丙酮(50 : 1)梯度洗脱，根据TLC示踪， 合并三萜类成分，分成A、 B、 C、 D、 E、 F六个组；将B、 C、 D三组分别上凝胶S印hadex LH-20 柱，以甲醇洗脱，根据TLC示踪合并得B-l、 B-2、 B-3， C_l、 C_2、 C_3、 C_4、 C_5， D_l、 D_2、 D-3十一部分；B-3， C-2， D-3部分以半制备高效液相色谱仪进一步分离；用pH值为3，由乙 腈-水-甲醇按照56 : 36 : 8的体积比组成的溶液分离B-3得到式I化合物；用pH值为 3，由乙腈-水-甲醇按照54 : 32 : 8的体积比组成的溶液分离c-2得到式II化合物；用 pH值为3，由乙腈-水-甲醇按照54 : 35 : 6的体积比组成的溶液分离B-3得到式ni 化合物；用pH值为3，由乙腈-水-甲醇按照55 : 35 : 12的体积比组成的溶液分离D-3 得到式IV化合物；用pH值为3，由乙腈-水-甲醇按照56 : 36 : 8的体积比组成的溶液 分离D-3得到式V化合物； 本发明从灵芝子实体或发酵菌丝体中分离得到5种新的羊毛甾烷衍生物，经生物 活性评价，本发明新分离的5种羊毛甾烷衍生物能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，具有优秀 的抗肿瘤活性，在临床上可作为肿瘤剂应用。 本发明还提供了一种抗肿瘤的药物组合物，该药物组合物由有效量的本发明化合 物或其可药用的盐与药学上可接受的载体配合而成，也即是说，将药学上可接受用量的本 发明化合物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成 任意一种适宜的药物组合物。将有效量的本发明化合物与药学上可接受的载体或稀释剂配 合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适 合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法。该组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂、颗 粒剂、锭剂、栓剂，或口服液等液体制剂形式。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以 含有O. 1% _99%重量，优选10-60%重量的本发明化合物。
图1本发明羊毛甾烷型三萜化合物的分离路线图。
具体实施例方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。 实施例1 3 |3 -乙酰基-7 |3 -羟基-11， 15， 23-三氧化-5 a -羊毛甾 烷-8-烯-26-酸(3-acetoxylganoderic acid B)(式I化合物)的制备
干燥灵芝菌丝体(3kg)粉碎成粗粉，用15倍体积乙醇重复提取3次，真空浓縮 提取液，浸膏以适量蒸馏水分散，以石油醚(60-90°C)反复萃取，弃去石油醚层，水层以乙 酸乙酯反复萃取，合并乙酸乙酯层，减压浓縮得浸膏105g。乙酸乙酯浸膏上硅胶柱，以氯 仿-丙酮(50 : 1)洗脱，根据TLC示踪(在硫酸-甲醇显色后显红色或棕黄色斑点即为三 萜类成分)，合并相同部分，分成6组(A-F)。 B、C、D三组分别上凝胶S印hadex LH-20柱，以 甲醇洗脱，根据TLC示踪合并得i^一部分(B-l B-3， C-l C-5， D-1 D-3) 。 B_3， C_2， D-3部分以半制备高效液相色谱仪进一步分离；其中，乙腈-水-甲醇(56 : 36 : 8，以甲
6酸调pH至3)分离B-3得到3-acetoxyl ganoderic acidB(白色无定型粉末)。
ESI/MS :557 [M-H]— 丄H-NMR :0. 92， 1. 23， 0. 92， 0. 89， 1. 33， 2. 03， 4. 78， 4. 46 13C-NMR :217. 6， 207. 8， 197. 9， 179. 9， 171. 1，80. 2， 66. 8， 24. 2， 21. 5. 实施例2乙基3P-乙酰基-7!3-羟基-ll，15，23-三氧化-5a-羊毛甾
烷-8-烯-26-酸酯(3-acetoxyl ganoderate B)(式II化合物)的制备 干燥灵芝菌丝体(3kg)粉碎成粗粉，用10倍体积乙醇重复提取3次，真空浓縮提
取液，浸膏以适量蒸馏水分散，以石油醚(60-90°C)反复萃取，弃去石油醚层，水层以乙酸
乙酯反复萃取，合并乙酸乙酯层，减压浓縮得浸膏85g。乙酸乙酯浸膏上硅胶柱，以氯仿_丙
酮(40 : 1)洗脱，根据TLC示踪(在硫酸-甲醇显色后显红色或棕黄色斑点即为三萜类成
分)，合并相同部分，分成6组(A-F) 。 B、 C、 D三组分别上凝胶S印hadex LH-20柱，以甲醇
洗脱，根据TLC示踪合并得i^一部分(B-l B-3， C-l C-5， D_l D_3) 。 B_3， C_2， D_3
部分以半制备高效液相色谱仪进一步分离；其中，乙腈-水-甲醇(54 : 32 : 8，以甲酸调
pH至3)分离C-2得至lj ethyl 3-acetoxyl ganoderateB (黄色桨状物)。 ESI/MS :557 [M-H]— 丄H-NMR :0. 92， 1. 23， 0. 93， 0. 89， 1. 23， 1. 33， 2. 03， 4. 12， 4. 78， 4. 46 13C-NMR :217. 6， 207. 8， 197. 9， 175. 8， 171. 1，80. 2， 66. 9， 60. 9， 21. 5 实施例3 3，7，11，15，23-五氧化-5a-羊毛甾烷-8P ，9a 二氢-26-酸(8P ，
9 a -dihydroganoderic acid C)(式III化合物)的制备 干燥灵芝菌丝体(3kg)粉碎成粗粉，用20倍体积乙醇重复提取3次，真空浓縮提 取液，浸膏以适量蒸馏水分散，以石油醚(60-90°C)反复萃取，弃去石油醚层，水层以乙酸 乙酯反复萃取，合并乙酸乙酯层，减压浓縮得浸膏75g。乙酸乙酯浸膏上硅胶柱，以氯仿_丙 酮(50 : l)梯度洗脱，根据TLC示踪(在硫酸-甲醇显色后显红色或棕黄色斑点即为三萜 类成分)，合并相同部分，分成6组(A-F) 。 B、C、D三组分别上凝胶S印hadexLH-20柱，以甲 醇洗脱，根据TLC示踪合并得i^一部分(B-l B-3， C-l C-5，D-1 D_3) 。 B_3，C-2，D_3 部分以半制备高效液相色谱仪进一步分离；其中，乙腈-水-甲醇(54 : 35 : 6，以甲酸调 pH至3)分离B-3得到8 P ，9 a -dihydroganodericacid C(白色无定型粉末)。
ESI-MS 513 [M-H]—NMR :0. 75， 0. 92， 1. 02， 1. 06， 1. 15， 1. 48， 1. 62， 13C-NMR :215. 3， 210. 4， 207. 7， 204. 8， 197. 9， 176. 2， 59. 1，20. 7， 12. 7 实施例4 3 |3 -乙酰基-15 a -羟基-7， 11， 23-三氧化-5 a -羊毛甾
烷-8-烯-26-酸(3-acetoxylganoderic acid K)(式IV化合物)的制备 干燥灵芝菌丝体(3kg)粉碎成粗粉，用20倍体积乙醇重复提取3次，真空浓縮提
取液，浸膏以适量蒸馏水分散，以石油醚(60-90°C)反复萃取，弃去石油醚层，水层以乙酸
乙酯反复萃取，合并乙酸乙酯层，减压浓縮得浸膏50g。乙酸乙酯浸膏上硅胶柱，以氯仿_丙
酮(50 : 1)梯度洗脱，根据TLC示踪(在硫酸-甲醇显色后显红色或棕黄色斑点即为三萜
类成分)，合并相同部分，分成6组(A-F)。 B、C、D三组分别上凝胶S印hadex LH-20柱，以
甲醇洗脱，根据TLC示踪合并得i^一部分(B-l B-3， C-l C-5， D_l D_3) 。 B_3， C_2，
D-3部分以半制备高效液相色谱仪进一步分离；其中，乙腈-水-甲醇(55 : 35 : 12，以甲
7酸调pH至3)分离D-3得到3-acetoxyl ganodericacid K(黄色桨状物)。
ESI-MS 559[M+H] +H-NMR :0. 75， 0. 92， 1. 02， 1. 06， 1. 15， 1. 48， 1. 62， 13C-NMR :215. 3， 210. 4， 207. 7， 204. 8， 197. 9， 176. 2， 59. 1，20. 7， 12. 7 实施例5 乙基15a-羟基-3， 7， 11 ， 23-四氧化_5 a -羊毛甾
烷-8-烯-26-oate (ethylganoderate J)(式V化合物)的制备 干燥灵芝菌丝体(3kg)粉碎成粗粉，用15倍体积乙醇重复提取3次，真空浓縮提取液，浸膏以适量蒸馏水分散，以石油醚(60-90°C)反复萃取，弃去石油醚层，水层以乙酸乙酯反复萃取，合并乙酸乙酯层，减压浓縮得浸膏45g。乙酸乙酯浸膏上硅胶柱，以氯仿_丙酮(50 : 1)梯度洗脱，根据TLC示踪(在硫酸-甲醇显色后显红色或棕黄色斑点即为三萜类成分)，合并相同部分，分成6组(A-F)。 B、C、D三组分别上凝胶S印hadex LH-20柱，以甲醇洗脱，根据TLC示踪合并得i^一部分(B-l B-3， C-l C-5， D_l D_3) 。 B_3， C_2，D-3部分以半制备高效液相色谱仪进一步分离；其中，乙腈-水-甲醇(56 : 36 : 8，以甲酸调pH至3分离D-3得到ethyl ganoderate J(黄色浆状物)。
ESI-MS 541 [M-H]—H-NMR :0. 89， 0. 91， 0. 93， 1. 14， 1. 17， 1. 20， 1. 28， 4. 15， 4. 31 13C-NMR :215. 3， 208. 6， 204. 8， 201. 3， 176. 0， 152. 7， 151. 1，60. 8， 14. 3 试验例1本发明式I-V化合物对人肿瘤细胞生长的抑制作用试验 1、供试化合物实施例1-5所制备的化合物式I-V ; 2、试验方法 取对数生长期的肿瘤细胞，以5000个/孔接种于96孔板中，于37°C 5% C02条件下培养10-12小时后，给药组加入供试化合物，使其终浓度分别为20-240 g/mL，空白对照组为0. 08%二甲基亚砜，阳性对照组为20nmol/L的顺铂，采用MTT比色法，于波长570nm/650nm处测定吸光度A值。根据A值计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。
肿瘤细胞的生长抑制率=(1-实验组的A值/阴性对照组的A值)X 100%
3、试验结果 试验结果表明，本发明化合物(I-V)对多种肿瘤细胞具有抑制增殖作用(表l)，特别对肺癌、鼻咽癌和肝癌细胞具有很强的抑制作用，对妇科肿瘤细胞的增殖亦有较好的抑制作用。 表1本发明化合物对肿瘤细胞的增殖抑制作用
细胞才朱抑制率(IC50, (xg/ml)
式I式n式m式IV式V
Hela子宫颈癌59. 385. 365. 390. 389. 8
SK0V-3卵巢癌80. 278, 672. 172. 380. 6
HEC-IB子宫内膜癌225. 1220. 4336. 1325. 5223. 8
BGC-823胃癌88. 375. 252. 682. 1112. 6
NCI-H460肺癌98. 3112. 587. 385. 2143. 8
L78肺癌10. 825. 612. 431. 522. 5
CNE鼻咽癌22. 628. 434. 636. 529. 3
Bel-7402肝癌52. 143. 666. 844. 863. 2
Hep G2肝癌62. 872. 679. 480. 663. 1
9
权利要求
结构式为式I、II、III、IV或V所示的羊毛甾烷型三萜化合物或其可药用的盐式I式II式III式IV式V。F2008101845885C0000011.tif,F2008101845885C0000012.tif,F2008101845885C0000013.tif,F2008101845885C0000021.tif,F2008101845885C0000022.tif
2. —种制备权利要求1所述的羊毛甾烷型三萜化合物方法，包括(1) 制备灵芝子菌丝体或子实体的乙醇提取物；(2) 将灵芝子菌丝体或子实体的乙醇提取物清膏用水分散后，用石油醚反复萃取，再用 乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯提取物；(3) 乙酸乙酯提取物上硅胶柱，以氯仿-丙酮(50 : 1)梯度洗脱，根据TLC示踪，合并 三萜类成分，分成A、 B、 C、 D、 E、 F六个组；将B、 C、 D三组分别上凝胶S印hadex LH-20柱，以 甲醇洗脱，根据TLC示踪合并得B-l 、 B-2、B-3， C-l 、 C_2、 C_3、 C_4、 C_5， D_l 、 D_2、D_3 ^^—部 分；B-3，C-2，D-3部分以半制备高效液相色谱仪进一步分离；用pH值为3，由乙腈-水-甲 醇按照56 : 36 : 8的体积比组成的溶液分离B-3得到式I化合物；用pH值为3，由乙 腈-水-甲醇按照54 : 32 : 8的体积比组成的溶液分离C-2得到式II化合物；用pH值 为3，由乙腈-水-甲醇按照54 : 35 : 6的体积比组成 的溶液分离B-3得到式III化合 物；用pH值为3，由乙腈-水-甲醇按照55 : 35 : 12的体积比组成的溶液分离D_3得到 式IV化合物；用pH值为3，由乙腈-水-甲醇按照56 : 36 : 8的体积比组成的溶液分离 D-3得到式V化合物。
3. —种抗肿瘤药物组合物，由有效量的权利要求1所述的羊毛甾烷型三萜化合物或其 可药用的盐和药学上可接受的载体或辅料组成。
4. 权利要求1所述的羊毛甾烷型三萜化合物或其可药用的盐在制备抗肿瘤药物中的 用途。
全文摘要
本发明公开了具抗肿瘤活性的羊毛甾烷型三萜化合物及其制备方法和应用。其制备方法包括制备灵芝子菌丝体或子实体的乙醇提取物；将灵芝子菌丝体或子实体的乙醇提取物清膏以水分散后，用石油醚反复萃取，再用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯提取物；将乙酸乙酯提取物通过正相、反相以及凝胶柱层析反复分离得到三部分；用制备高效液相色谱，分别以乙腈-甲醇-水体系洗脱，收集相应组分后，减压蒸干后即得。本发明从灵芝子实体或发酵菌丝体中分离得到5种新的羊毛甾烷衍生物，经生物活性评价，本发明新分离的5种羊毛甾烷衍生物能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，具有优秀的抗肿瘤活性，在临床上可作为肿瘤剂应用。
文档编号C07J9/00GK101747400SQ200810184588
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月17日 优先权日2008年12月17日
发明者李园园, 汤亚杰 申请人:湖北工业大学