专利名称：核酸分析芯片和核酸分析装置的制作方法
技术领域：
本发明申请涉及核酸分析芯片和使用其的核酸分析装置。更具体地说，本发明申请涉及在使用微生物、细胞的生物技术的研究领域中，能够边对特定的细胞进行显微观察，边以1细胞单位进行培养，对在细胞培养微室内培养的细胞的核酸成分进行分析的新型核酸分析芯片和使用其的分析装置。
背景技术：
在以往的生物学、医学、药学领域中，为了观察细胞状态的变化或细胞对药物等的应答，一直观察细胞集团的值的平均值如同是一细胞的特性。但是，实际上细胞在集团中的细胞周期相互一致是罕见的，各个细胞以不同的周期表达蛋白质。为了解决这些问题，本发明者们以特原2000-356827申请发明了如下技术重新只选择特定的一细胞，将该一细胞作为细胞株进行培养的技术；以及在观察细胞时，对细胞的溶液环境条件进行控制，并且将容器中的细胞浓度控制为一定的技术；或者边使相互作用的细胞特定化边进行培养观察的技术。细胞的1细胞单位的计测由此而成为可能。
发明内容
但是，如上所述的本申请发明者所实现的微室是边以1细胞单位完全地对环境进行控制边使计测成为可能的培养技术，为了计测对于药物的应答等细胞的变化，必须对细胞中的表达mRNA量定量地计测，在该观点方面，实际情况是尚未开发出对于1细胞培养系最适化的核酸分析技术。
因此，本发明申请以以上的背景为基础，其课题在于提供对在细胞培养微室中培养的各个细胞的核酸成分进行分析的新的技术手段。
为了解决上述课题，本发明申请提供如下的核酸分析芯片和使用其的核酸分析装置，其具有对如上所述的本申请发明者们开发的细胞培养微室内的各容器中的细胞的核酸成分的定量解析进行直接计测的装置。
即，本发明申请第1提供核酸分析芯片，其在基板上配置多个能够将单一的细胞完全封入的穴作为培养容器，在该各个穴中残留水溶液，同时具有能够用不与水溶液混合且比水溶液的比重轻的液体充满穴的上部的上部区域，反应液可以导入上述的穴中，在光学上进行细胞的核酸分析。
此外，本发明申请第2提供使用核酸分析芯片的核酸分析装置，该分析装置具有对微室内的各容器进行光学上计测的装置、进行光学加热的装置、向微室中的各容器中导入反应液的装置、各容器内的反应液不扩散蒸发的装置等。
图1为表示本发明申请的核酸分析芯片的基本构成的一例的模式图。
图2为表示观察图1所示的核酸分析芯片，进行集束光局部过热的装置构成的一例的模式图。
图中的符号表示如下内容。
100核酸分析芯片101光学上透明的基板102培养容器103细胞104微量移液管105上部区域106物镜107半透膜201光源202、209、212滤光片203聚光透镜
204具有温度调节功能的平台205物镜206可动分色镜208光源210分色镜211镜213照相机214图像处理解析装置215平台移动用马达具体实施方式
本发明申请具有如上所述的特征，在其实施中，例如，核酸分析芯片采用在反应液导入后可以从穴中回收核酸成分，以及介于穴和上部区域之间存在密封材料，例如半透膜等各种各样的方式。
首先，使用图1的实施例对本发明申请的核酸分析芯片的基本构成的一例进行说明。核酸分析芯片100的基本构成与上述细胞培养微室相同。即，在光学透明的基板101上构成多个细胞培养容器102，在各容器102中可以装入细胞103进行培养。在该基板101的上面密封着半透膜107，可以进行培养液的交换，而且可以在防止细胞103从容器中逃逸或细菌等杂质混入的情况下对细胞进行连续培养。在培养中，当细胞内的核酸成分的信息弄清楚时，将位于上述容器102的上面的培养液全部除去，不使该部分与水溶液混合，并且将比重比水轻的液体，例如液体石蜡或硅油导入上部区域105。这样通过液体石蜡等液体将各容器102隔离。在该状态下使用微量移液管104，将上述容器102上面的半透膜107弄破，导入PCR反应液。这里，通过加入例如能够光学地对PCR反应进行计测的荧光色素，例如TaqManProbe(アマシヤム、U.S.A.)，可以进行利用荧光能量移动法的核酸定量计测。在进行荧光量的计测时，可以计测被物镜106集光的荧光。此外，为了加热各容器，通过物镜106照射红外光，可以对PCR反应进行必要的加热。此外，在未知的核酸成分的解析中，也可以使用毛细管电泳网罗地并且定量地对用微量移液管104从各容器102回收的核酸成分进行解析。此时，由于不需要在光学上对核酸分析芯片进行加热，因此可以采用サ-マルサイクラ-等现有的加热冷却装置进行PCR反应。
图2表示细胞培养微室100的用于导入集束光的装置构成的一例，该集束光用于加热容器102从而引起PCR反应。在该装置中，为了观察核酸分析芯片100中的细胞等试料和荧光量的变化，具有显微镜观察系统，此外，为了同时对容器中的水溶液进行加热，具有红外集束光照射系统。由图2可以看到，在显微观察光学系的光路上配置核酸分析芯片100。首先，显微观察光学系具有如下的构成。用滤光器202将从光源201照射的光调整为特定的波长，通过聚光透镜203集光，照射到核酸分析芯片100上。照射的光作为透过光用于用物镜205进行观察。核酸分析芯片100内部的透过光像被镜211反射而通过滤光器212后，被照相机213诱导，在照相机的受光面上成像。因此，芯片100的材料相对于滤光器202选择的波长的光，优选为光学上透明的材料。具体地说，使用硼硅酸玻璃、石英玻璃等玻璃，聚苯乙烯等树脂或塑料，或硅基板等固体基板。此外，特别是当使用硅基板时，优选将波长900nm以上波长的光用于观察。
此外，从光源208照射的荧光观察用激发光也在滤光器209处进行波长选择，然后通过分色镜210诱导到物镜205上，作为核酸分析芯片100内部的荧光观察的激发光使用。从芯片100发出的荧光再次被物镜205集光，用照相机213只能观察到被滤光器212切割(cut)激发光后的荧光和透过光。此时，通过调整滤光器202、209、212的组合，可以用照相机213只观察透过光，或者只观察荧光，或者同时观察透过光像和荧光像。在光路内还具有通过可动分色镜206将红外激光光源207产生的激光导入物镜205的机构。该激光通过物镜205成为集束光，可以对核酸分析芯片100进行局部加热。当使集光点移动时，通过使可动分色镜移动，可以使核酸分析芯片100内的激光的集束位置变动。作为该激光的波长，优选具有水的吸收，但不具有光化学作用并且在基板的吸收少的波长。如果为1500nm的波长的光等，用水可以有效地产生激光吸收，或者在吸收了光的容器内使反应液局部发热。
此外，用照相机获得的图像数据通过图像处理解析装置214解析，以各种解析结果为基础，为了对可动分色镜206或载置核酸分析芯片100的具有温度调节功能的可动XY平台204的位置进行控制，可以对在X-Y方向自由移动的平台移动用马达215进行驱动。此外，也可以用该温度调节装置使芯片全体进行PCR反应。
在以上的实施例中，使用1个照相机进行计测，但在本发明申请中，例如，通过加入分色镜，对至少不同的2波长下的荧光强度的变化进行计测，可以采用上述能量移动法进行定量解析。
当然，本发明申请并不限于以上的例示，在其构成的细节可以有各种各样的实施方式。
如上所述，根据本发明申请，可以对在单一细胞培养微室内培养的各个细胞的核酸成分进行解析。
权利要求
1.核酸分析芯片，其特征在于在基板上配置多个能够将单一的细胞完全封入的穴作为培养容器，在该各个穴中具有残留水溶液同时、能够用不与水溶液混合且比水溶液的比重轻的液体充满穴的上部的上部区域，反应液可以导入所述的穴中，进行光学上的细胞核酸分析。
2.权利要求1所述的核酸分析芯片，其特征在于在反应液导入后，可以从穴中回收核酸成分。
3.权利要求1或2所述的核酸分析芯片，其特征在于介于作为培养容器的穴和上部区域之间存在着能够将反应液向穴中导入，进而从穴中回收核酸成分的密封材料。
4.权利要求3所述的核酸分析芯片，其特征在于密封材料是能够进行培养液的交换的半透膜。
5.核酸分析装置，其使用权利要求1～4中任一项所述的核酸分析芯片，其特征在于具有对在作为培养容器的穴中的反应进行光学计测的装置。
6.权利要求5所述的核酸分析装置，其特征在于具有对特定波长的荧光量的变化进行计测的装置。
7.权利要求5或6所述的核酸分析装置，其特征在于具有存在水的吸收，照射能够加热容器中的水溶液的波长的集束光的装置。
8.权利要求5～7中任一项所述的核酸分析装置，其特征在于具有向穴中导入反应液的装置和从穴中提取核酸成分的装置。
全文摘要
对作为细胞培养微室内的各培养容器102的穴中的细胞103的核酸成分直接进行定量解析的装置，其具有对微室内的各容器102进行光学计测的装置、进行光学加热的装置、将反应液导入微室中的各容器102的装置、各容器102内的反应液不扩散、蒸发的装置，能够对在单一细胞培养微室中培养的各个细胞的核酸成分进行分析。
文档编号G01N21/03GK1678737SQ0382013
公开日2005年10月5日 申请日期2003年8月26日 优先权日2002年8月26日
发明者安田贤二 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构