专利名称：人心力衰竭中的血浆尿压素的制作方法
技术领域：
本发明涉及在哺乳动物个体、例如人中诊断心力衰竭的方法。特别地，本发明涉及其中测定体液样品中尿压素的水平以诊断心力衰竭的方法。
心力衰竭(左心室收缩功能障碍)是死亡率和发病率的主导原因。其病理生理学包括多种神经激素系统的激活，所述的神经激素系统包括儿茶酚胺、肾素-血管紧张素、内皮素、心钠素和脑钠素系统。这些系统中的某些以适应性方式激活，其它的以适应不良的方式激活。
近期的工作已经表明存在一种新的称为尿压素II(UTN)的心血管肽，该心血管肽与硬骨鱼的荷尔蒙同源(Ames等人，Nature 1999；16282-286)。该环状的十一肽是孤儿G蛋白受体(GPR14)的配体，并且肽及受体两者均分布在心肌、内皮、脉管肌细胞和神经系统中(Ames等人，Nature 1999；16282-286)。虽然其对于大鼠和猴子中的某些血管床是有效的血管收缩剂(Ames等人，Nature 1999；16282-286；Douglas等人，J CardiovascPharmacol 2000；36S163-6)，然而其在肠系膜阻力血管中也可以是血管舒张剂(Bottrill等人，Br J Pharm 2000；1301865-1870)。在不同脉管对UTN的反应性之间存在有重要的种属差异。例如，虽然猴子的脉管可被UTN有效地收缩，然而人肺脉管系统和肠系膜阻力血管被UTN高度有效地舒张(Stirrat等人，Am J Physiol 2001；280H925-928)，人皮下阻力血管对UTN没有响应(Hillier等人，Circulation 2001；1031378-1381)。UTN对血管平滑肌长期刺激可导致肥大响应(Watanabe等人，J Hypertens 2001；192191-2196)。在猴子中对心肌的直接作用表现出可能由冠状血管收缩引起的心肌抑制(Ames等人，Nature 1999；16282-286)，然而在人心肌中证明有正性肌力作用(Russell等人，Br J Pharm 2001；1325-9)。另外，已经描述了包括胶原沉着增加在内的肥大效应，这意味着UTN在心力衰竭的心室重塑中可能起作用(Zou等人，FEBS Lett 2001；50857-60；Tzanidis等人，Eur Heart J 2000；2172)。UTN使得心肌细胞中心钠素和脑钠素的表达增加(Zou等人，FEBS Lett 2001；50857-60)，该变化预期在心力衰竭中会复原至更原始的表型。Douglas等人的近期工作(Douglas等人，Lancet 2002；3591990-1997)证明在心力衰竭患者的心肌中UTN及其受体的表达均增加，甚至是在疾病的早期亦如此。UTN存在于心脏的心肌细胞、血管平滑肌细胞、内皮和炎症细胞。关于尿压素在心力衰竭中假定的作用，在重塑和纤维化增加导致日益增强的适应不良响应之前，在人中最初的正性肌力作用和血管舒张作用可以是代偿性的。
第一方面，本发明提供了在哺乳动物个体中诊断心力衰竭的方法，其中包括测定体液样品中尿压素的水平，并将其与在个体的所述体液中通常发现的指示不患有心力衰竭的参考水平进行比较，其中尿压素水平增加指示心力衰竭。
可另外测定至少一种指示心力衰竭的其它标记物、如N-末端脑钠素前体(NT-proBNP)或脑钠素(BNP)的水平，并将其与在哺乳动物个体的体液中通常发现的指示不患有心力衰竭的参考水平进行比较，其中该至少一种其它标记物的水平增加指示心力衰竭。
尿压素或其它标记物的水平可通过使用免疫测定法测定，体液可以是血浆或组织液。
在一个实施方案中，本发明的方法用于在人体中诊断心力衰竭。
第二方面，本发明提供了一种在第一方面的方法中使用的检测体液样品中尿压素的免疫测定法。
第三方面，本发明提供了一种在人体中对心脏疾病的严重程度进行示踪和分级的方法，其中在一段时期内一次或多次测定尿压素以及至少一种指示心力衰竭的其它标记物的水平，并与标准模型进行比较。
标准模型可以是分析物水平对比疾病状态的标准模型，分级可根据纽约心脏学会(NYHA)分级确定。分为四级，为1级仅在体力劳动时表现出症状的患者；2级正常体力劳动时表现出症状的患者；
3级轻体力劳动时表现出症状的患者；4级休息时表现出症状的患者。
发明人研究了人心力衰竭(左心室收缩功能障碍)中UTN的血浆水平，并将其与更确定的N-末端脑钠素前体(N-末端proBNP)的血浆水平增加进行了比较。血浆从126名心力衰竭患者以及220名年龄和性别匹配的正常对照中取得。通过免疫发光测定法测定了N-末端proBNP和UTN。心力衰竭患者的血浆中N-末端proBNP和UTN两者均增加，并且显著相关(rs＝0.35，P＜0.001)。与N-末端proBNP相反，在血浆UTN和NYHA分级之间没有联系。虽然血浆N-末端proBNP表现出与年龄和女性性别正性相关，但是在血浆UTN中没有表现出这种年龄依赖性的变化，并且正常女性中的水平比男性低。N-末端proBNP和UTN诊断心力衰竭的受试者工作特征曲线的面积分别为0.90和0.86(两者均P＜0.001)。在心力衰竭患者中血浆UTN增加，这表明该肽在所述疾病的病理生理学中起作用。在心力衰竭的诊断中，血浆UTN是N-末端proBNP的有用的替换物，因为其在心力衰竭中的水平增加与年龄、性别或NYHA分级无关。
在本发明中，将所测定的尿压素水平(以及指示心脏疾病的其它标记物的水平，如果测定了的话)与在个体的所述体液中通常发现的指示不患有心力衰竭的参考水平比较。这些参考水平可由对不患有心力衰竭的个体的群体研究而确定。所述个体可按照年龄和/或性别匹配。
如所提及的，其它标记物可以是N-末端proBNP。可二者择一或另外地，可测定BNP的水平。心肌细胞中储存的proBNP(两种循环形式、即BNP(活性肽)和N-末端BNP(NTproBNP，非活性肽)的完整前体)在左心室的释放以及BNP产物的增加由心肌伸长、心肌张力和心肌受损而激发。
其中测定尿压素水平的体液可以是血浆或组织液，虽然也可使用其它来源的体液，即全血、血清或尿液。
本发明中所测定的标记物可使用免疫测定法检测。在一个实施方案中，免疫测定法如下进行将取自待测个体的样品与适宜的抗体在当如果存在标记物时可发生免疫特异性结合的条件下接触，检测或测定抗体的任何免疫特异性结合的量。任何适宜的免疫测定法均可使用，其非限制性地包括使用例如下述技术的竞争性或非竞争性测定体系western印迹法、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附法)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、聚集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和A蛋白免疫测定。
例如，标记物可在液态样品中通过两步夹心测定法测定。在第一步，使用捕获试剂(例如抗标记物抗体)来捕获标记物。该捕获试剂可任选地固定在固相上。在第二步，使用直接或间接标记的检测试剂来检测所捕获的标记物。在一个实施方案中，检测试剂为抗体。在另一实施方案中，检测试剂为外源凝集素。
本发明还提供了可在本发明的第一方面的方法中使用的、用于检测尿压素的免疫测定法、试剂盒或装置。该免疫测定试剂盒或装置可含有与尿压素特异性结合的抗体，或者还含有结合心力衰竭的其它标记物的抗体。另外，该免疫测定法可任选地含有下述的一种或多种(1)使用该免疫测定法、试剂盒或装置诊断心力衰竭的说明；(2)标记了的抗体结合配体；(3)固定有抗体的固相(例如试纸)；以及(4)显示管理部门许可用于诊断、预诊断、治疗的用途或其任意组合的标签或插页。如果没有提供抗体的标记了的结合配体，则抗体本身可用可检测的标记物如化学发光部分、酶部分、荧光部分或放射性部分进行标记。
此处所用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含与抗原特异性结合的抗原结合位点的分子。可用于本发明的免疫球蛋白可以是免疫球蛋白分子的任何类(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亚类。抗体包括但不局限于多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、人源化和嵌合抗体、单链抗体、Fab片段及F(ab′)片段、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型抗体(抗-Id)以及上述任一的表位结合片段。
本发明提供了在哺乳动物个体中诊断心力衰竭的方法，其中包括测定体液样品中指示心脏疾病的至少一种第一标记物和/或尿压素的水平，并将其与在哺乳动物个体的所述体液中通常发现的指示不患有心力衰竭的参考水平进行比较，其中至少一种第一标记物和/或尿压素的水平增加指示心力衰竭。本发明还提供了一种在人类个体中对心脏疾病的严重程度进行示踪和分级的方法，其中在一段时期内一次或多次测定尿压素以及至少一种第一标记物的水平，并与标准模型进行比较。
至于其它每个方面，本发明每个方面优选的特征已做必要的修改。此处提及的现有技术的文献以法律所允许的最大程度引用。
本发明在下述非限制性的实施例中进一步进行描述。参考下述附图
图1a和1b显示了血浆NT proBNP和血浆UTN分别对NYHA分级作图的图表；图2a和2b是NT proBNP和UTN分别在诊断心力衰竭中的受试者工作曲线(ROC)；以及图3是N-末端proBNP和UTN的组合在诊断心力衰竭中的ROC曲线预后指数。
方法得自正常对照和心力衰竭患者的血浆样品。
从Leicester Royal Infirmary的诊所和病房中招募患有心力衰竭的患者。所有患者均有心力衰竭的临床诊断，并且超声心动图证明射血分数低于45％。正常对照与这些患者的年龄和性别相匹配，没有药物治疗，并且超声心动图证明射血分数高于55％。患者的特征在表1中给出。
卧床休息15分钟后静脉穿刺获得10ml血液，在包含EDTA和抑肽酶的冰冷试管中混合。离心后回收血浆，于-70℃储存待测。
N-末端proBNP的测定N-末端proBNP的测定基于Karl(Karl等人，Scand J Clin Lab InvestSuppl 1999；230177-181)所描述的非竞争性N-末端proBNP测定。针对人N-末端proBNP的N-末端(氨基酸1-12)和C-末端(氨基酸65-76)产生家兔多克隆抗体。
将来自血清的IgG在A蛋白琼脂糖柱上纯化。用针对C-末端的抗体(每ELISA板孔100μL，0.5μg)作为捕获抗体。将N-末端抗体亲和纯化并生物素化。将样品或N-BNP标准品的等分试样(20μL)于4℃在C-末端抗体包覆的孔中与生物素化的抗体一起孵育24小时。在洗涤之后，每孔加入标记有甲基-吖啶酯的抗生物素蛋白链菌素(抗生物素蛋白链菌素-MAE，5×106相对光单位/ml)(Hart & Taaffe，J Immunol Methods 1987；10191-96)。将板在如前所述的Dynatech MLX发光测量计上读数(Hughes等人，Clin Sci1999；96373-380)。检测下限为5.7fmol/ml未经萃取的血浆。可接受的测定间和测定内变异系数分别为2.3％和4.8％。ANP、BNP或CNP没有交叉反应性。
尿压素II的测定从Phoenix Pharmaceuticals Inc.，Belmont，CA获得对UTN循环形式特异的抗体。以在反相HPLC上纯化的生物素化UTN作为示踪剂。采用使用血浆C18萃取液的竞争性测定法，将50ng抗体与萃取液或标准(每孔1至2000fmol)在100μl测定缓冲液(如12所述)中孵育。于4℃孵育24小时后，加入生物素化的UTN示踪剂(每孔250fmol)。在包覆有抗家兔IgG的ELISA板(100ng/孔)中回收免疫沉淀物。在洗涤和与抗生物素蛋白链球菌-MAE孵育之后，如上所述引发化学发光。测定间和测定内的变异系数分别为2.3％和8.1％，对BNP或N-末端proBNP没有反应性。测定下限为3.1fmol/ml。
统计学分析在SPSS第11版上进行统计学分析。数据以中间数[范围]给出。通过Kruskal-Wallis方差分析进行比较，描绘受试者工作特征曲线(ROC)。采用Spearman′s rho(rs)进行相关分析。认为P＜0.05的值具有统计学意义。
结果表1显示了正常人和心力衰竭患者的特征，他们在年龄和性别上匹配良好。如所预期的，心力衰竭患者中N-末端proBNP显著增加。在正常人群中，N-末端proBNP与年龄增加之间正性相关(rs＝0.41，P＜0.001)，并且女性中的水平比男性高(P＜0.001，表1)。N-末端proBNP随NYHA分级增加而增加(图1a，通过Kruskal Wallis测试的P＜0.001)。在心力衰竭患者中血浆UTN也增加(表1)，但是与年龄没有相关性。与N-末端proBNP不同，在女性中的水平比男性低(P＜0.001，表1)。血浆UTN不受NYHA分级增加的影响(图1b)。在心力衰竭患者中N-末端proBNP和UTN均增加而与性别无关(对于所有比较，P＜0.001)。N-末端proBNP和UTN也适度相关(rs＝0.35，P＜0.001)。
在心力衰竭患者中，血浆UTN水平与利尿剂、β-阻滞剂或ACE抑制剂的使用无关。N-末端proBNP和UTN用于检测心力衰竭的ROC曲线的面积分别为0.90和0.86(P＜0.001，与对角参考线相比)。
使用SPSS上的单变量普通线性模型程序，输入年龄作为协同变量，性别和NYHA分级作为因子，对心力衰竭患者中N-末端proBNP水平进行log标准化分析，得到模型的r2为0.446(P＜0.001)，以年龄、性别和NYHA分级作为显著征兆性变量(分别为P＜0.034、0.002和0.001)。经鉴别这些因子均不是UTN的征兆性变量(r2＝0.058)。因此，心力衰竭患者中的UTN水平增加而与年龄、性别或HYHA分级无关。
由图1a和1b中的图表进行比较可以看到，与单独测定NT proBNP相比，测定血浆UTN与测定血浆NT proBNP的组合可提供更多的有关心力衰竭诊断的信息。即，NT ProBNP水平仅在发展到NYHA分级3级时开始增加，而血浆UTN水平在NYHA分级高于1级的患者中即增加。因此，测定这两种标记物可较早期地鉴定心脏疾病。
表6
非球面表面系数
目前血浆中UTN的来源是未知的，但是可能是起源于心血管，因为已经证明其在心肌细胞、内皮、脉管肌细胞和炎症细胞中的表达增加(Douglas等人，Lancet 2002；3591990-1997)。结合该证据，我们的数据表明，在心力衰竭的病理生理学中可能涉及UTN系统。目前还不清楚活性增加是心室功能障碍的起因还是心室功能障碍的结果。
这种新的心血管肽在心力衰竭的病理生理学中有所涉及提出了一种在将来能使用适宜的受体激动剂或拮抗剂调节的荷尔蒙系统。其作为心力衰竭的诊断测试的用途可能是更直接的。
权利要求
1.一种在哺乳动物个体中诊断心力衰竭的方法，其中包括测定体液样品中尿压素的水平，并将其与在个体的所述体液中通常发现的指示不患有心力衰竭的参考水平进行比较，其中尿压素水平的增加指示心力衰竭。
2.根据权利要求1中所述的方法，其中尿压素水平通过使用免疫测定法确定。
3.根据权利要求1或2中所述的方法，其中另外测定至少一种指示心力衰竭的其它标记物的水平，并将其与在哺乳动物个体的所述体液中通常发现的指示不患有心力衰竭的参考水平进行比较，其中该至少一种其它标记物的水平增加指示心力衰竭。
4.根据权利要求3中所述的方法，其中其它标记物是NT-proBNP或BNP。
5.根据权利要求3或4中所述的方法，其中其它标记物的水平通过使用免疫测定法确定。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中体液是血浆或组织液。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中的个体是人。
8.在权利要求1至7的方法中使用的检测体液样品中尿压素的免疫测定法。
9.在人体中对心脏疾病的严重程度进行示踪和分级的方法，其中在一段时期内一次或多次测定尿压素以及至少一种指示心力衰竭的其它标记物的水平，并与标准模型进行比较。
10.根据权利要求9中所述的方法，其中标准模型是分析物水平对比疾病状态的标准模型。
11.根据权利要求9或10中所述的方法，其中分级是根据NYHA分级确定的。
全文摘要
本发明提供了在哺乳动物个体中诊断心力衰竭的方法。测定来自个体的体液样品中尿压素的水平，并将其与在个体的所述体液中通常发现的指示不患有心力衰竭的参考水平进行比较。尿压素水平的增加指示心力衰竭。
文档编号G01N33/53GK1678912SQ03819947
公开日2005年10月5日 申请日期2003年7月11日 优先权日2002年7月11日
发明者L·额 申请人:因沃耐斯瑞士医学有限公司