一种检测大肠杆菌的生物传感器的制造方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型涉及传感器技术领域，特别涉及一种检测大肠杆菌的电化学传感器。
【背景技术】
[0002] 近年来，致病性大肠杆菌对生产发展的危害越来越严重。分析原因主要有以下几 点：单纯由致病性大肠杆菌所引起的原发病较少，并发、继发的形式增多，间接增加了大 肠杆菌病的危害。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明， 大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜 粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为 主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。
[0003] 如果食品的菌落总数严重超标，说明其产品的卫生状况达不到基本的卫生要求， 将会破坏食品的营养成分，加速食品的腐败变质，使食品失去食用价值。消费者食用微生物 超标严重的食品，很容易患痢疾等肠道疾病，可能引起呕吐、腹泻等症状，危害人体健康安 全。而大肠菌群超标，也同样会引起腹泻、肠胃感染等。
[0004] 检测大肠杆菌的传统方法主要有三种，分别是多管发酵法、滤膜法和平板计数法， 这些方法有仪器操作复杂，需要专业操作人员等缺点。
[0005] 滚环复制放大技术是借鉴自然界中环状DNA分子滚环式的扩增机制而发展起来 的一种核酸扩增技术，这种扩增形式能在同温下对单链环状DNA进行相对无限单链扩增， 不需要特定的热循环仪，且每条链使用1-2个引物就能实现指数扩增，并具有快速、特异、 灵敏等特点，因而近年来在一些基因检测技术的研究中被广泛采用。由于滚环复制的模板 必须是封闭的单链环状DNA，因而许多研究者将这一特性用于单核苷酸多态性检测、基因表 达图谱和病毒基因检测等的研究中，还有一些实验直接将滚环的无限复制作为一种信号放 大系统，并在此基础上开发出许多相关的技术。
【发明内容】
[0006] 针对现有检测方法中仪器操作复杂，需要专业操作人员的缺陷，本实用新型提供 了一种检测大肠杆菌的电化学传感器。
[0007] 本实用新型的技术方案如下：
[0008] -种检测大肠杆菌的电化学传感器，从内到外依次为金电极、戊二醛-大肠杆菌 抗体层、牛血清白蛋白封闭层、大肠杆菌层和RCA产物层。
[0009] 所述的戊二醛-大肠杆菌抗体层厚度为120±10nm，牛血清白蛋白封闭层厚度为 100±10nm，RCA 产物层厚度为 55±10nm。
[0010] 所述的电化学传感器，是通过如下步骤制备得到的：
[0011] 1.制备环状挂锁探针：
[0012] (1)取3 yL挂锁探针9 u L连接探针于已灭菌的I 0 0 u L离心管内，加入6 u I T 4 DNA连接酶缓冲溶液，50 μ L灭菌水，震荡均匀，生料带封闭；
[0013] (2)将此离心管放入95°C恒温lOmin，37°C恒温2h，使之杂交完全；
[0014] (3)加入2 μ LT4DNA连接酶，封口膜封口，16°C恒温2h，是挂锁探针连接完全后， 65°C恒温20min使T4DNA连接酶变性；
[0015] (4)加入1 μ 1核酸外切酶I在37°C保温Ih将连接探针水解后80°C恒温20min使 核酸外切酶I变性；
[0016] 2.金电极的预处理；
[0017] 3.配制2%的戊二醛溶液，以此溶液将大肠杆菌抗体交联到电极表面，60min干 燥，用二次水和PBS冲洗电极除去未结合的抗体，得戊二醛-大肠杆菌抗体层；
[0018] 4.待用二次水冲洗几次之后，在戊二醛-大肠杆菌抗体层后修饰牛血清白蛋白， 使牛血清白蛋白封闭未特异性结合的位点，得牛血清白蛋白封闭层；
[0019] 5.电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后，在大肠杆菌菌液中孵育，并用PBS缓冲液 冲，大肠杆菌由于和捕获电极之间的特异性结合而结合到电极上得大肠杆菌层；
[0020] 6. PBS冲洗，在适配体-引物的PBS溶液中孵育，适配体通过与目标物之间的 强识别能力，被修饰在电极表面，再在其上修饰步骤1所得环状挂锁探针，后加入到含 1 μ ldNTP、1 μ lphi29DNA聚合酶、1 μ IBSA的溶液中37°C孵育2h完成RCA反应得RCA产物 层。
[0021] 所述的电化学传感器，优选RCA产物制备中挂锁探针和适配体-引物物质的量比 为 3:1〇
[0022] 所述的牛血清白蛋白的浓度为0. 1%。
[0023] 检测时采用三电极系统，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，修饰电极为 工作电极，以含对苯二酚和双氧水的PBS为工作底液采用差分脉冲伏安法检测，电位设置 为O到-0. 6 V，脉冲宽度0. 05V，脉冲宽度扫描为0. 06 S，进行检测。
[0024] 本实用新型的工作原理：
[0025] 本实用新型用到包括以下的DNA探针：
[0026] 1、挂锁探针 5? -P- TMg^^g^^TTTTCCCAACCCGCCCTACCCTTTTTTTTTT CCCAACCCGCC CTACCCTTTTGTAACTGTTTCCTTC-?, ' ( SEQ ID NO ： 1)；
[0027] 2、连接探针 5' - rfr GTT JC-3'（ SEQ ID NO :2);
[0028] 3、话配体-引物：5'_ GCAATGGTACGGTACTTCCACTTAGGTCGAGGTTAGTTTGC TTGCTGGC GCATCCACTGAGCGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAATTTTTTTTTTTGCTAGAAGGAAACAGTTAC-3 ? ( SEQ ID NO ：3)；
[0029] 4、适配体 _ 血红素适配体 GCAATGGTACGGTACTTCCACTTAGGTCGAGGTTAGTTTGC TTGCT GGCGCATCCACTGAGCGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAATTTTTTTTTTGG GTA GGG CGG GTT GGG( SEQ ID NO ：4)；
[0030] 实验中首先设计了挂锁探针和连接探针，挂锁探针5'磷酸化，以便和3'端结合成 环，挂锁探针上含有可与连接探针互补配对的部分，即斜体部分，这是为了让连接探针拉近 挂锁探针的3'端和5'端以便成环，另外我们又对挂锁探针进行另一设计，即含有两段血红 素适配体的互补序列的单链DNA，即挂锁探针的加粗部分，为避免其相互影响，我们在两段 血红素适配体间插入10个T，为避免斜体部分即与连接探针互补的部分对血红素适配体互 补序列的影响，我们也引入无关序列T。我们还设计了适配体-引物探针，适配体即与大肠 杆菌特异性结合的DNA单链，引物是与成环后的环状探针互补配对结合的部分，RCA反应也 是基于此引物进行的。为避免适配体和引物的相互影响，我们在他们之间引入无关序列T。 我们还设计了适配体-血红素适配体探针主要是为了和RCA实验做对比。
[0031] 具体的实验是这样进行的，将连接探针与挂锁探针混合，互补配对完全后加入T4 DNA连接酶，在酶和ATP的存在下将挂锁探针3'端和5'端间的这个切口连接起来形成锁式 拓扑环(环状探针)。加入核酸外切酶I，核酸外切酶I可以水解单链，加入后可将连接探 针水解而不影响环状探针，将环状探针放置备用。
[0032] 构建传感器时将抗体交联到电极表面后，由BSA封闭未特异性结合的探针，此时 将电极在大肠杆菌菌液中孵育，由于大肠杆菌与抗体的特异性结合而被捕获到电极上，修 饰预先设计适配体-引物链，适配体由于和大肠杆菌的特异性结合而被固定到电极上，修 饰环状探针，环状探针的双下划线部分与适配体-引物的双下划线部分是可以互补配对 的，可与之结合二修饰在电极上，在phi29 DNA聚合酶缓冲液、phi29 DNA聚合酶、dNTP的 作用下以适配体-引物探针以环状探针环为模板进行滚环复制，形成多个与该环序列互补 的高分子量DNA，即RCA产物，该RCA产物的含丰富血红素适配体，血红素适配体在血红素和 钾离子的存在下形成G-四连体结构，该结构的DNA具有类似辣根过氧化物酶（HRP)的功 能，即催化溶液中的双氧水（H2O2)发生还原反应，检测H2O 2的电化学还原信号可对大肠杆菌 进行定量。若大肠杆菌的浓度不同，那么捕获的适配体-引物DNA链的量也不同，RCA产物 也不同，最后根据酶催化底液反应的量的不同，产生的不同的电化学信号可以定量出大肠 杆菌的浓度。即被检测物越多，固定的DNA酶的量也越多，催化产生的电信号也越强。
[0033] 本发明采用的滚环复制放大（RCA)这一反应，在短时间内形成了大量的血红素的 适配体，在血红素的存在下，该适配体表现出类辣根过氧化氢酶（HRP)的功能，即能催化HQ 与H2O2的氧化反应，通过这一氧化反应表征电化学信号。文章中对RCA的应用是一大亮点， 使检测更为灵敏同时对挂锁探针完美设计，使得制备的传感器灵敏度高，检测速度快；检测 E. coli的方法，操作简单、快速、灵敏，便于现场检测。
[0034] 本实用新型的有益效果：
[0035] 1、制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
[0036] 2、设计挂锁探针，使用RCA技术使反应中产生大量的具有类HRP酶功能的DNA序 列，广生$父尚的酶功能。
[0037] 3、电极性能稳定，重复性好，适用于食品安全中大肠杆菌的检测和生物传感器产 业化的实际应用，实施例中检验了其稳定性；
[0038] 4、以金电极为固定载体固定抗体和RCA产物的夹心型电化学传感系统，可实现对 食品中大肠杆菌的快速在线检测，发现该传感器的检测范围为1.8X10-1. SXlO7Cfu mL1检出限为I. 6X IOcfu mL、
【附图说明】
[0039] 图1为生物传感器的横截面的结构示意图，其