专利名称：K88大肠杆菌不同血清型的pcr特异性检测和分型鉴别方法
技术领域：
本发明涉及同种细菌不同血清型的检测方法，具体涉及K88大肠杆菌三种血清型 K88ab、K88ac以及K88ad的特异性检测和分型鉴别方法。
背景技术：
产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic五coh·，ETEC)是人及动物腹泻病的主要 病原。ETEC的主要致病因子分为细菌粘附素和肠毒素两部分，病原致病菌通过前者黏附到 易感宿主肠道上皮细胞并定殖，进而释放肠毒素导致腹泻。绝大多数新生仔猪和刚断奶猪 的腹泻病就是由表达K88粘附素性菌毛的ETEC病原致病菌导致的。K88菌毛有三种血清型， 即K88ab，K88ac和K88ad，它们在猪肠道上皮细胞结合性能上有所不同，即对于不同的易感 宿主受体有特异的结合特性。目前临床上对K88大肠杆菌的血清型检测和鉴定首先利用抗 共同的a单因子血清进行玻板或试管凝集试验确认阳性反应并鉴定为K88大肠杆菌后，再 分别与抗b、c、d三种不同抗原表位的单因子血清进行玻板或试管凝集试验，依据与各自单 因子反应，最后鉴定为K88大肠杆菌相应的血清型即K88ab，K88ac或K88ad。用于凝集试 验的a因子制作相对简易，而b、c、d三种不同抗原表位的单因子血清制备过程却甚为繁琐， 耗时耗力，成本不菲。值得注意的是许多标准株和绝大多数临床分离株都需要筛选特殊的 培养基并需要在实验室连续培养传代并在适宜的环境下(如温度、PH值等)，其K88粘附素 才能较为充分表达，而未经上述方法处理的菌株其粘附素在体外培养条件下不能达到一定 程度的表达，因而采用单因子血清进行玻板或试管凝集试验检测K88粘附素，尤其是特异 性检测和分型鉴别三种血清型K88ab、K88ac以及K88ad时，因K88大肠杆菌与相应单因子 血清不能产生肉眼可见的凝集反应，基于检测菌毛的玻板或试管凝集试验和应用受到很大 限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、简便、特异性强、适合临床使用的PCR特异性检 测方法，对临床分离到的K88细菌进行血清型检测和分型鉴定。本发明的原理与K88菌毛生物合成相关的多肽共有十种，分别从FaeA到FaeJ (FaeA^FaeJ),由操纵子基因fae(包括A J 一组共10个基因族)编码(faeA、faeB基因NCBI 检索号为X77671 ；faeC基因NCBI检索号为AF450247 ；faeD基因NCBI检索号为X56002 ； faeE、faeF、faeG 基因的 NCBI 检索号为 Zl 1699 S46307 ；faeH、fael、faej 基因的 NCBI 检 索号为Z11700 S46743)。其中FaeG为K88菌毛的粘附素和主要亚单位，并且含有与易感 宿主小肠细胞特异受体相结合位点。已知的基因序列信息和比较分析表明，K88ab、K88ac、 K88ad三种血清型的基因序列差异仅存在于基因faeG上。鉴于基因faeG的上述特有特征， 在基因faeG的保守区域设计上下游共用引物用于检测K88大肠杆菌，上游引物为AM005和 下游引物为AM006 ；采用同样一致的上游引物AM005，而在多变区域设计三组分别针对K88
3三个血清型特异的下游引物FM007 (ab)、FM008 (ac)、FM009 (ad)，用于检测K88三个不同 血清型大肠杆菌。通过制备各种待检细菌的DNA模板用于PCR检测，分别采用一对共用上 下游引物和三对不同的下游引物在合适的PCR参数和体系下分别同时进行PCR扩增试验， 根据扩增出与预期大小相一致的条带，最后鉴定为K88大肠杆菌和对应不同血清型K88ab、 K88ac或K88ad的大肠杆菌。本发明所采用的技术方案是包括以下步骤
(1)K88大肠杆菌PCR特异性检测以SEQID NO 1和SEQ ID NO 2的序列为引物，对 待测样本DNA模板进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，出现750bp条带的为待测样 本为K88大肠杆菌；
(2)分型鉴别以步骤1确定为K88大肠杆菌的待测样本的DNA为模板，分别用下述3 对引物进行PCR扩增
第1对上游引物序列如SEQ ID NO :1，下游引物序列如SEQ ID NO 3 ； 第2对上游引物序列如SEQ ID NO :1，下游引物序列如SEQ ID NO 4 ； 第3对上游引物序列如SEQ ID NO :1，下游引物序列如SEQ ID NO 5 ； 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，根据出现500bp条带所对应的引物来判断待测样本血清
型
由第1对引物扩增出500bp条带的，待测样本血清型为K88ab ； 由第2对引物扩增出500bp条带的，待测样本血清型为K88ac ； 由第3对引物扩增出500bp条带的，待测样本血清型为K88ad。本发明的优点在于
1.用于检测不同血清型K88ab、K88ac和K88ad标准株和临床分离株，该PCR检测方法 得出的分型结果准确无误，且没有假阳性和相互交叉反应的发生。2.从细菌培养、制备细菌染色体DNA模板用于PCR分型检测到获取结果，整个过程 只需要18个小时，操作方法也很简便，可同时检测多个样品，能够满足临床快速诊断和一 次检测大量样品的要求。3.该检测方法所需的试剂及设备成本较低，设计合成的检测引物-20°C可以长期 保存，能多次使用。
图1 K88大肠杆菌标准株的PCR分型检测
泳道1、6为K88ab标准株C83901，泳道2、7为K88ac标准株C83902,泳道3、8为K88ad 标准株C83903，泳道4、9为K99标准株，泳道5、10为987P标准株；所有泳道均用AM005作 为上游引物，泳道广5均用AM006作为下游引物，泳道6、分别用MF007、MF008、MF009作为 下游引物，泳道9用MF007作为下游引物，泳道10用MF008作为下游引物。图2 三种MF引物的特异性
泳道广3为K88ab标准株C83901，泳道4 6为K88ac标准株C83902，泳道7 9为K88ad 标准株C83903 ；所有泳道均用AM005作为上游引物，泳道1、4、7用MF007作为下游引物，泳 道2、5、8用MF008作为下游引物，泳道3、6、9用MF009作为下游引物。
具体实施例方式本发明的PCR检测方法所用引物的核苷酸序列如下
AM005 (SEQ ID NO :1):5，-GGTGATTTCAATGGTTCGGTC-3，(21bp)，对应三种血清型相同 的上游保守区域
AM006 (SEQ ID NO :2):5，-AATGCTACGTTCAGCGGAGCG-3，(21bp)，对应三种血清型相同 的下游保守区域
MF007 (SEQ ID NO :3):5，-TGCAGCACCCGAAACAGTCGTCGT-3，(24bp)，对应 ab 血清型特 异的下游区域
MF008 (SEQ ID NO :4):5，-CCCAGCCGACGATTCAGAACCCCT-3，(24bp)，对应 ac 血清型特 异的下游区域
MF009 (SEQ ID NO :5):5，-TGCAGAATTCTGAACATTCGTCGG-3，(24bp)，对应 ad 血清型特 异的下游区域。本发明检测方法过程如下
1. 制备待检样品的染色体DNA模板将待检细菌单菌落接种于LB液体培养基中， 过夜振摇培养12h，离心弃除含LB培养基的上清液，用超纯水洗涤两次后用100 μ 1超纯水 悬浮于指形管中，置于100°C沸水中水浴5分钟，4°C 10000rpm/min离心10分钟，取50 μ 1 上清做PCR模板。2. PCR扩增及产物检测50μ 1扩增体系包含了 IXPCR缓冲液，0. 2mM dNTP， 上下游引物各1πιΜ，5μ 1待检样品PCR模板以及1单位的商品化rTaq酶。扩增循环参数为 94°C 预变性 4min; 94 °C 30s, 56 °C 30s，72°C lmin，25 个循环；72°C 延伸 lOmin。取 5μ1 PCR产物在1. 2%琼脂糖胶中以90V恒定电压电泳40min，溴乙锭EB染色，以DL2000 DNA MarkerCTAKARA公司)为标准分子量分析结果，能扩增出预期大小为750bp和500bp左右条 带的PCR产物，它们分别为K88大肠杆菌和对应于相应的不同血清型K88ab、K88ac或K88ad 大肠杆菌。实施例1: K88大肠杆菌标准株的检测和分型鉴别
K88ab、K88ac和K88ad三种血清型大肠杆菌标准株分别为C83901株、C83902株和 C83903株，分别购自中国兽药监察所菌种保藏中心；K99、987P大肠杆菌标准株用于阴性对 照设置，商品化购置于中国兽药监察所菌种保藏中心，由本实验室保存。以ΑΜ005/ΑΜ006 —对上下游引物，Κ88大肠杆菌三种血清型标准株均可扩增出预 期为750bp左右大小的条带，而K99及987P标准株无任何条带，其它多种大肠杆菌和沙门 氏菌等革兰氏阴性细菌也无任何条带，表明AM005/AM006适用于K88菌毛基因的特异性检 测；以AM005与对应K88不同的血清型的下游引物MF配对时，K88标准株能扩增出预期为 500bp左右的条带，分别相对应于单一血清型(K88ab、K88ac或K88ad的一种)，而K99及 987P标准株无任何条带。如图1所示。值得注意的是，引物MF007、MF008和MF009分别特异性地对应K88ab、K88ac和 K88ad三种血清型，任一 K88标准血清型大肠杆菌用其他两种MF引物与AM005配对使用时， 无法扩增出500bp的特异性条带。如图2所示。实施例2 临床分离株的检测和分型鉴别
从我们收集和鉴定的223株肠道腹泻大肠杆菌菌株，进一步在实验室体外培养和连续
5传代(至少10代以上)，对上述所有菌株通过K88a单因子血清进行凝集试验确认阳性反应 并鉴定为K88，共计23株，进一步分别与抗b、c、d三种不同抗原表位的单因子血清进行试 管凝集试验鉴定，确定血清型K88ab为5株，K88ac为12株，K88ad为6株。在PCR检测和 分型鉴别上述23株大肠杆菌试验中，全部采用双盲试验。试验中，先用引物AM005/AM006 进行PCR检测。结果23株分离株中所有菌株均扩增出750bp的条带，表明带有K88菌毛基 因。再用AM005和不同的三个下游引物MF分别对这23株K88细菌进行分型检测，结果5 株细菌有为K88ab血清型，12株为K88ac血清型，6株为K88ad，结果与单因子血清凝集试 验鉴定相同。
权利要求
一种K88大肠杆菌不同血清型的PCR特异性检测和分型鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤(1)K88大肠杆菌PCR特异性检测以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的序列为引物，对待测样本DNA模板进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，出现750bp 条带的为待测样本为K88大肠杆菌；(2)分型鉴别以步骤1确定为K88大肠杆菌的待测样本的DNA为模板，分别用下述3对引物进行PCR扩增第1对上游引物序列如SEQ ID NO1，下游引物序列如SEQ ID NO3；第2对上游引物序列如SEQ ID NO1，下游引物序列如SEQ ID NO4；第3对上游引物序列如SEQ ID NO1，下游引物序列如SEQ ID NO5；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，根据出现500bp 条带所对应的引物来判断待测样本血清型由第1对引物扩增出500bp 条带的，待测样本血清型为K88ab；由第2对引物扩增出500bp 条带的，待测样本血清型为K88ac；由第3对引物扩增出500bp 条带的，待测样本血清型为K88ad。
全文摘要
本发明涉及K88大肠杆菌不同血清型的检测方法。该方法是先对待测样本进行PCR特异性检测，出现750bp条带的为待测样本为K88大肠杆菌，再分别用3对特异性引物对K88大肠杆菌DNA进行PCR扩增，根据扩增产物的500bp条带判断血清型。本发明的方法不仅分型结果准确无误，且没有假阳性和相互交叉反应的发生，还具有操作简便，可同时检测多个样品，成本较低的优点。
文档编号C12Q1/68GK101979664SQ201010574869
公开日2011年2月23日 申请日期2010年12月6日 优先权日2010年12月6日
发明者包文斌, 吴圣龙, 姚丰华, 朱军, 朱国强, 朱春红, 朱晓芳, 王建业, 羊扬, 舒燕, 郁磊 申请人:扬州大学