中，1为金电极、2为戊二醛-大肠杆 菌抗体层、3为牛血清白蛋白封闭层、4为大肠杆菌层、5为RCA产物层。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合具体附图及实施例对本实用新型进行进一步说明：
[0041] 1.首先制备环状挂锁探针，通过以下步骤：
[0042] (1)取3 yL挂锁探针9 yL连接探针于已灭菌的IOOyL离心管内，加入6 yL T4 DNA连接酶缓冲溶液，50 μ L灭菌水，震荡均匀，生料带封闭；
[0043] (2)将此离心管放入95°C恒温lOmin，37°C恒温2h，使之杂交完全；
[0044] (3)加入2 μ LT4DNA连接酶，封口膜封口，16°C恒温2h，是挂锁探针连接完全后， 65°C恒温20min使T4DNA连接酶变性；
[0045] (4)加入1 μ 1核酸外切酶I在37°C保温Ih将连接探针水解后80°C恒温20min使 核酸外切酶I变性。
[0046] 2.金电极1的预处理；
[0047] 3.配制2%的戊二醛溶液，以此溶液将大肠杆菌抗体交联到电极表面，60min干 燥，用二次水和PBS冲洗电极除去未结合的抗体，得戊二醛-大肠杆菌抗体层2 ;
[0048] 4.待用二次水冲洗几次之后，在戊二醛-大肠杆菌抗体层后修饰牛血清白蛋白， 使牛血清白蛋白封闭未特异性结合的位点，得牛血清白蛋白封闭层3 ;
[0049] 5.电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后，在大肠杆菌菌液中孵育，并用PBS缓冲液 冲，大肠杆菌由于和捕获电极之间的特异性结合而结合到电极上得大肠杆菌层4 ;
[0050] 6. PBS冲洗，在适配体-引物的PBS溶液中孵育，适配体通过与目标物之间的 强识别能力，被修饰在电极表面，再在其上修饰步骤1所得环状挂锁探针，后加入到含 1 μ ldNTP、1 μ lphi29DNA聚合酶、1 μ IBSA的溶液中37°C孵育2h完成RCA反应得RCA产物 层5。
[0051] 实施例2
[0052] -种检测大肠杆菌的电化学传感器的制备方法的对比实验，步骤如下：
[0053] a、2支金电极首先在0. 3和0. 05 μ m的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用 二次水冲洗；
[0054] b、配制2%的戊二醛溶液，以此溶液将大肠杆菌抗体交联到电极表面，60min干燥， 用二次水和PBS冲洗电极除去未结合的抗体；
[0055] c、待用二次水冲洗几次之后，在戊二醛-大肠杆菌抗体层后修饰牛血清白蛋白， 使牛血清白蛋白封闭未特异性结合的位点；
[0056] 检测方法如下：
[0057] d、在PBS缓冲液中充分搅动清洗后，在大肠杆菌菌液中孵育，用PBS缓冲液冲洗， 大肠杆菌由于和捕获电极之间的特异性结合而结合到电极上；
[0058] e、1号电极PBS冲洗，在适配体-引物的PBS溶液中孵育，适配体通过与目标物之 间的强识别能力，被修饰在电极表面；
[0059] f、1号电极将成环挂锁探针修饰与电极表面，加入到含1 μ ldNTP、1 μ lphi29DNA 聚合酶、I μ IBSA的溶液中37°C孵育2h完成RCA反应；
[0060] g、2号电极将适配体-血红素适配体探针修饰于大肠杆菌层后；
[0061] h、以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为O到-0. 6 V，脉冲宽度 0. 05V，脉冲宽度扫描为0. 06 S，采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化。
[0062] i、实验发现，下表为实验结果，1为非RCA的实验检测情况，2为RCA的检测情况， 实验发现，采用了 RCA的实验检测出的电信号是不用RCA的10倍。
[0063] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限 制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为 等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0064] 实施例3
[0065] 一种检测大肠杆菌的电化学传感器的稳定性分析，步骤如下：
[0066] a、4支金电极首先在0. 3和0. 05 μ m的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用 二次水冲洗；
[0067] b、配制2%的戊二醛溶液，以此溶液将大肠杆菌抗体交联到电极表面，60min干燥， 用二次水和PBS冲洗电极除去未结合的抗体；
[0068] c、待用二次水冲洗几次之后，在戊二醛-大肠杆菌抗体层后修饰牛血清白蛋白， 使牛血清白蛋白封闭未特异性结合的位点；
[0069] 检测方法如下：
[0070] d、电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后，在大肠杆菌菌液中孵育，用PBS缓冲液冲 洗，大肠杆菌由于和捕获电极之间的特异性结合而结合到电极上；
[0071] e、PBS冲洗，在适配体-引物的PBS溶液中孵育，适配体通过与目标物之间的强识 别能力，被修饰在电极表面；
[0072] f、将成环挂锁探针修饰与电极表面，加入到含1 μ IdNTPU μ lphi29DNA聚合酶、 1 μ IBSA的溶液中37°C孵育2h完成RCA反应。
[0073] g、以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0. 6 V，脉冲宽度 0. 05V，脉冲宽度扫描为0. 06 S，采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化，检测目标物，进 行标准曲线的绘制。
[0074] h、在冰箱中放置7天，拿出后进行检测，与没有放入冰箱前的数据进行比较，下表 为对比结果，1为放置于冰箱前，2为放置于冰箱后，实验发现，冰箱放置后所测得的实验结 果与放置前相差无几，表明了该传感器具有稳定性好这一特点。
[0075] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限 制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为 等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0076] 实施例4
[0077] -种检测大肠杆菌的电化学传感器的制备方法的标准曲线的绘制及实际应用，步 骤如下：
[0078] a、6支金电极首先在0. 3和0. 05 μ m的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用 二次水冲洗；
[0079] b、配制2%的戊二醛溶液，以此溶液将大肠杆菌抗体交联到电极表面，60min干燥， 用二次水和PBS冲洗电极除去未结合的抗体；
[0080] c、待用二次水冲洗几次之后，在戊二醛-大肠杆菌抗体层后修饰牛血清白蛋白， 使牛血清白蛋白封闭未特异性结合的位点；
[0081] 检测方法如下：
[0082] d、电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后，在大肠杆菌菌液中0，1.8X10， 1.8X102，1.8X103，1.8X104，1.8X10 5，1.8X106，LSXlO7CfumL1 孵育，用PBS 缓 冲液冲洗，大肠杆菌由于和捕获电极之间的特异性结合而结合到电极上；
[0083] e、PBS冲洗，干在适配体-引物的PBS溶液中孵育，适配体通过与目标物之间的强 识别能力，被修饰在电极表面；
[0084] f、将成环挂锁探针修饰与电极表面，加入到含1 μ IdNTPU μ lphi29DNA聚合酶、 1 μ IBSA的溶液中37°C孵育2h完成RCA反应。
[0085] g、以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0. 6 V，脉冲宽度 0. 05V，脉冲宽度扫描为0. 06 S，采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化，检测目标物，进 行标准曲线的绘制。标准曲线检测结果如下表所示，电流为平行三次检测测得的平均值，可 以看出电流响应随大肠杆菌的浓度的增加而增加，且在1. 8X10-1. 8X IO7Cfu mL 1的大肠 杆菌浓度内，响应电流与大肠杆菌浓度的对数呈线性关系，即该传感器的线性检测范围为 1. 8X10-1. 8 X IO7Cfu mL S
[0087] h、采用加标回收的方法，检测牛奶和矿泉水样品，平行测定3次，测定回收率，并 与传统检测方法平板计数法进行比较，下表为比较结果，向样品中加入不同的大肠杆菌量， 由传感器和平板计数分别后检测，检测结果相差无几，表明该传感器有应用于实际检测的 潜力。
[0088] CN 204832101 U 说明书 7/7 页
[0089] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限 制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为 等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种检测大肠杆菌的生物传感器，其特征在于，从内到外依次为金电极、戊二醛-大 肠杆菌抗体层、牛血清白蛋白封闭层、大肠杆菌层和RCA产物层。2. 根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述的戊二醛-大肠杆菌抗体层厚 度为120± 10nm，牛血清白蛋白封闭层厚度为100± 10nm，RCA产物层厚度为55± IOnm0
【专利摘要】本实用新型公开了一种检测大肠杆菌的生物传感器，从内到外依次为金电极、戊二醛-大肠杆菌抗体层、牛血清白蛋白封闭层、大肠杆菌层和RCA产物层，本实用新型提供的生物传感器的电极性能稳定，重复性好，检出限为1.6×10cfu？mL-1<b>。</b>
【IPC分类】G01N27/327, G01N27/26
【公开号】CN204832101
【申请号】CN201520043401
【发明人】王玉, 郭玉娜, 黄加栋, 刘素, 徐伟, 王虹智, 许颖, 邱婷婷, 崔洁
【申请人】济南大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年1月22日