一种玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业科学技术领域，具体地说是一种鉴定周期短、可靠性高的玉米粗 缩病种质抗性的快速检测鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 玉米（Maize)在当今社会中发挥的作用越来越大，它不仅仅是重要的粮食作物， 也是重要的饲料及工业原料。我国的玉米总产量仅次于水稻产量，在国民经济中占有越来 越重要的地位。玉米粗缩病是由水稻黑条矮缩病毒（RBSDV)或玉米粗缩病病毒（MRDV)引起 的一种世界范围的重要病害。2002年，玉米粗缩病在希腊大面积爆发，超过70%的玉米遭 受损失。玉米整个生育期都可以感病，苗期是玉米粗缩病的敏感期，发病越早，越易感病，其 中5叶期以前易感病，9叶后抗病性增强。玉米粗缩病的典型症状为植株矮小，节间明显缩 短，叶面积显著降低，干物质累积显著减少，病情严重时无果穗或有穗不结实，造成严重减 产。我国最早于1954年在甘肃西部和新疆南部首次发现该病，其后在全国大部分玉米种植 区陆续爆发，不断造成玉米主产区产量下降或者严重减产，成为严重危害玉米生产的重要 病害。近年来，随着我国农业种植结构不断调整，暖春天气逐年增多，连续出现适宜粗缩病 发生的气候条件，造成玉米粗缩病在黄淮海区域的危害情况逐年加重，各地爆发情况屡见 报道，给我国玉米生产和全国的粮食安全带来非常严重的破坏。因此防治该病成为目前玉 米生产的主要任务之一。
[0003] 目前所知的能引起玉米粗缩病的病原有三种，分别为水稻黑条矮缩病毒（Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)、马德里约柯托病毒（Mai de Rio Cuarto virus， MRCV)和玉米粗缩病毒（Maize rough dwarf virus，MRDV)，这三种病毒都属于呼肠孤病毒 科（Reoviridae)斐济病毒属（Fjivirus)。其中MRDV和MRCV分别能够引起欧洲和南美洲 玉米粗缩病。引起我国玉米粗缩病的宄竟是何种病原曾经引起过争论。我国玉米粗缩病的 病原物分离及测序比对研宄确认引起我国玉米粗缩病的病原物为RBSDV，而非MRDV。
[0004] 玉米粗缩病病毒RBSDV -般不能通过种子、土壤和接触传染，也不能经嫁接、汁液 摩擦等传播，只能由灰飞虱刺吸并以持久性方式间歇传播。灰飞虱属温带害虫，广泛分布于 东亚、东南亚、欧洲等地，在国内分布则遍及全国各地。灰飞虱能够传播多种病害，如水稻条 纹叶枯病、水稻黑条矮缩病、玉米矮花叶病，小麦绿矮病等，危害严重。带毒灰飞虱成虫或若 虫在冬小麦、田头地边杂草等场所越冬，第二年3、4月份若虫羽化后成为第一批带毒灰飞 虱，随着天气转暖，于4、5月份开始迀飞，5月中旬至6月初平均气温20~25°C，适于灰飞 虱活动，田间灰飞虱种群数量达高峰，并在小麦收获前形成迀飞高峰，春、夏播玉米田若在 此时遭遇大量带毒灰飞虱则形成大规模病害，造成严重损失。
[0005] 玉米粗缩病由于其危害严重，可防不可治，且当前生产上推广的玉米品种大部分 不抗病，因而急需培育和改良出玉米粗缩病抗性品种，才能从根本上减少该病带来的损失。 大规模筛选玉米种质资源是培育抗性品种的基础，对候选种质资源进行抗性鉴定则是重要 且必须的措施。
[0006] 目前对玉米粗缩病进行种质资源鉴定主要有田间自然鉴定法和室内人工接种鉴 定法两种。自然鉴定法是长久以来长久应用的方法，但因其受到自然条件的制约，不同年 份、不同地点的鉴定结果差异较大，且自然鉴定法无法有效控制诸如灰飞虱带毒率、接虫 量、接种时间等的一致性，因而使得鉴定结果不准确。如王桂跃等人通过自然鉴定结果认为 丹340表现出较强的粗缩病抗病性，而路银贵等人的自然鉴定研宄结果认为丹340属于高 感自交系。人工接种鉴定法是在借鉴自然鉴定法基础上建立起来的接种鉴定方法。对于玉 米粗缩病而言，包括室内灰飞虱饲养和人工接种鉴定两个方面。室内人工饲养灰飞虱和人 工接种玉米粗缩病病毒的方法能够保证鉴定使用的灰飞虱带毒率和接虫数量的稳定性，能 够保证鉴定结果重复性好、可信度高。目前室内鉴定均采用苗期接虫，待植株抽雄后通过观 察感病症状来确定其抗病性。
[0007] 科学技术发展日新月异，目前用于检验鉴定植物病毒的方法包括以下几种：生物 学方法、血清学方法、电子显微镜法、芯片检测法和分子生物学方法。
[0008] 生物学方法是通过病毒在病毒特定寄主上接种病毒后，依据寄主上表现出来的局 部或系统症状，可以初步确定病毒的种类和归属。该方法的优点在于其操作简单易行，缺点 是工作量大，耗时长，而且受季节性限制，准确性不高。目前只有部分实验室仍在采用此种 方法，应用不广泛。
[0009] 血清学方法是利用抗体和其对应抗原的体外特异性结合检测植物病毒。免疫学方 法能够较大量的检测鉴定植物病毒。然而对于一些分离纯化比较困难的病毒，应用此方法 检测则有一定难度。除了抗体制备的难度大以外，免疫学方法还受到以下几个因素的制约： (1) 免疫学检验植物病毒的方法是建立在利用病毒外壳蛋白的抗原性，然而有些植物在某 种情况下不含有外壳蛋白，而且类病毒并没有外壳蛋白，这使得该方法的应用受到了限制。 (2) 某些植物的生殖生长周期制约着该方法的应用。例如，藜属的叶、花、果实中可以检测出 CMLV病毒，而在树木休眠后的木本部分却难以用ELISA方法检测。
[0010] 电子显微镜鉴定法较形态学鉴定方法可以准确直观地观察到植物病毒粒体的形 态、大小、表面微细结构和存在部位等信息，结合免疫学检测的电镜检测法则可以更进一步 的研宄病毒在细胞内的复制和装配、判断血清学关系等。
[0011] 芯片技术是近年国际上发展迅速的一项高新技术，可以分为基因芯片和蛋白质芯 片技术，是植物病毒快速检测技术的重要发展方向。基因芯片技术是将荧光标记技术与DNA 杂交技术相结合的一种基因水平检测法，以其灵敏度高和特异性强等特点，在细菌、病毒等 病原鉴定和检测方面发挥着重要作用。其基本原理是将各种不同病毒样品的特征基因片段 点样，制成基因芯片，再使荧光标记的待检样品核酸与芯片杂交，杂交信号通过激光共聚焦 显微扫描技术进行灵敏、实时、准确的检测，经计算机软件分析并进行结果判断。蛋白质芯 片又称蛋白质微阵列，是继基因芯片之后又发展起来的一项具有高灵敏度、高特异性、高质 量且微型化的分析蛋白质的新技术。目前，荧光染料标记法是蛋白质芯片检测中应用最广 的一种方法，其原理简单，优点是敏感性高、适用安全，并具有良好的分辨率。在蛋白质芯片 的基础上，发展出了基体辅助激光解吸电离飞行时间等质谱技术，其基本原理是用生物学 或化学的方法将生物制剂或者探针固定在载体上，形成了一个个芯驰矩阵。该方法使用范 围较为广泛，是一种特异性强、灵敏度高的快速检测生物分子的技术，在植物病毒的检测和 鉴定上有着较好的应用前景。
[0012] 分子生物学方法主要是通过提取病毒的核酸（DNA、RNA)来检测病毒的种类和存 在。目前主要应用的定性检测分子生物学方法包括病毒核酸分子杂交技术、dsRNA电泳技术 和多聚酶链式反应（PCR)技术，定量检测主要是指实时荧光定量PCR技术。此种方法灵敏 度高，特异性强，检测速度快，操作过程也比较简便、可用于大量样品检测。由于分子生物学 鉴定方法有无可替代的优点，从而使此方法在植物病毒鉴定中得到迅速而广泛的应用。荧 光定量PCR在植物病毒检测与鉴定方面，能够定量检测病毒拷贝数。应用荧光定量PCR检 测未知样本时，对模板定量检测可以采用两种方法：相对定量法和绝对定量法。相对定量检 测方法用来比较一个目标基因在不同处理下的不同表达水平，指的是在目标基因之间做比 较，这些基因具有不同的表达水平，分别来自经过各自处理的样品中。它们分别与非调控的 参考基因相比。然后根据AACt方法计算出其表达水平。
[0013] 绝对定量检测方法是应用符合要求的标准品做出标准曲线，通过检测未知样品的 Ct值在标准曲线上计算出该样品的核酸拷贝数。实时荧光定量PCR方法相比其他定量方 法和普通PCR方法特异性更强、准确性高、灵敏度高、线性关系广（荧光信号的产生与产物 扩增呈一一对应关系)、操作简单安全，样品的污染较底(样品的扩增和检测在同一管内进 行)，且不需要后期处理。由于荧光定量PCR法对检测未知样品含量的优越性，已经在诸多 领域如植物病理机制研宄，转基因研宄中的目标基因表达水平和医学临床检测方面得到了 广泛和成熟的应用。
[0014] 研宄证明对玉米植株接种RBSDV，不管是抗病还是感病玉米植株体内，均检测到 RBSDV病毒，以上各种方法只能检测病毒的有无，无法对其繁殖动态进行定量观察。另外 玉米植株苗期感染RBSDV病毒之后，症状不凸显，不能确定其抗病性，需要等到植株抽雄才 能确定其抗病性。因此本申请利用荧光定量RT-PCR技术对接种病毒后的玉米幼苗体内的 RBSDV积累情况进行定量检测，通过观察其繁殖动态曲线，从而快速确定玉米的抗感性。
【发明内容】
[0015] 本发明的目的是针对现有玉米粗缩病室内鉴定周期长等缺点，提供一种鉴定周期 短、可靠性高的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法。
[0016] 本发明的目的是通过以下技术方案解决的： 一种玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：该快速检测鉴定方法包 括以下步骤： 1) 荧光定量PCR反应获取RBSDV病毒含量标准曲线：利用RBSDV病毒S7片段的重组 质粒DNA作为标准品，经10倍稀释后对获得的梯度标准品进行荧光定量RT-PCR扩增，以各 梯度浓度标准品的模板拷贝数的对数值为横坐标值、以各梯度浓度标准品测得的Ct值为 纵坐标值，绘制出标准曲线； 2) 玉米样品RNA获取：在玉米苗期周期时间点采集