待测玉米品种特定位置叶片并提取 RNA ； 3 )玉米样品病毒拷贝数获取及抗性鉴定：对步骤2 )中提取的RNA进行荧光定量RT-PCR 检测获得不同时间样品的Ct值，再利用步骤1)中的标准曲线计算出相应的病毒拷贝数，以 取样时间点为横坐标值、与取样时间点相对应的病毒拷贝数的对数值为纵坐标值，即可获 得该玉米品种体内RBSDV病毒积累动态曲线图，从而快速确定该玉米品种的玉米粗缩病种 质抗性。
[0017] 所述步骤1)中的荧光定量PCR反应获取RBSDV病毒含量标准曲线的具体过程如 下： 1.1)标准品制备：利用引物 RBSDV-F :5' -AGA GCT CTT CTA GTT ATT GCG-3' 和 RBSDV-R :5'-TCA GCA AAA GGT AAA GGA ACG-3'扩增 RBSDV 病毒的 S7 片段，并回收连接于 PMD18-T载体，经测序确认为该S7片段的重组质粒DNA后作为标准品，用Nano drop 2000 测得标准品的质粒浓度并计算出标准品起始拷贝数； 1. 2)制备梯度标准品：将步骤I. 1)获得的标准品作为标准品I，对标准品I进彳丁 10 倍稀释获得标准品II，并依次进行10倍稀释，最终获得梯度标准品溶液：标准品I、标准品 II、标准品III、标准品IV、标准品V，标准品VI、标准品W和标准品VID ; 1. 3)对步骤1. 2)获得的梯度标准品皆采用引物RBSDV-R和RP :5' -GCT CCT ACT GAG TTG CCT GTC-3'进行荧光定量RT-PCR扩增，以各梯度浓度标准品的模板拷贝数的对数值为 横坐标值、以各梯度浓度标准品测得的Ct值为纵坐标值，绘制出标准曲线。
[0018] 所述步骤1. 3)中和所述步骤3)中的荧光定量PCR反应体系每20 μ L中含：10 μ L 的 2 X qPCR master mix (Promega)、I. 0 μ L 的 cDNA 模板、8. 2 μ L 的 ddH20 以及 0· 8 μ L 的 1〇μΜ引物RBSDV-R和RP ;焚光定量PCR扩增程序为：95°C预变性2min ;95°C变性15s，60°C 退火15s，72°C延伸20s，共进行40次循环；95°C变性15s，60°C退火lmin，95°C变性15s。
[0019] 对步骤3)中获得的取样时间点、与取样时间点相对应的病毒拷贝数进行进一步鉴 定处理的步骤如下： 3. 1)以饲毒后周期取样时间点为横坐标值、病毒拷贝数为纵坐标值，对上述数据先进 行逻辑斯谛方程拟合，适合逻辑斯谛方程拟合的即为感病品种，进一步根据具体品种的生 长极限值和最大生长速度点大小评价各待测玉米品种抗性水平并进行抗性等级划分； 3. 2)对不适合逻辑斯谛方程拟合的数据进行直线回归拟合，进一步根据具体品种的斜 率大小评价各待测玉米品种抗性水平并进行抗性等级划分。
[0020] 所述步骤3. 1)中的抗性等级划分为：生长极限值为IX IO8或者最大生长速度点 小于33的确认为高感品种；生长极限值为I X IO7或者最大生长速度点大于43的确认为感 病品种；所述步骤3. 2)中的抗性等级划分为：斜率小于30的确定为尚抗品种，斜率大于30 的确定为中抗品种。
[0021] 所述步骤2)中的玉米苗期周期时间点为RBSDV传毒后3-35天内均匀分布的3-5 个时间点；待测玉米品种特定位置为顶部第一个叶片。
[0022] 所述步骤2)中的待测玉米品种为人工带毒玉米植株，该人工带毒玉米植株的培育 过程为： 2. 1)无毒灰飞虱继代繁殖：春季采集灰飞虱成虫，而后饲养在小麦幼苗上并产卵，收集 刚孵化的1龄若虫即为无毒灰飞虱，之后在小麦幼苗进行人工饲养继代繁殖； 2. 2) RBSDV毒源：从田间采集症状表现为绿矮病的小麦病株，带回实验室检测证明小 麦病株体内寄生病毒为RBSDV并将带毒的小麦病株作为RBSDV毒源小麦，而后利用无毒灰 飞虱在毒源上饲毒而后传毒于麦苗上进行毒源繁殖； 2. 3)带毒灰飞虱获得：将室内人工饲养的无毒灰飞虱，置于RBSDV毒源小麦上，饲毒处 理后移除毒源，将灰飞虱转移到新鲜健康小麦幼苗上饲养度过循回期即为带毒灰飞虱； 2. 4)带毒灰飞虱传毒接种：玉米幼苗长至一叶一心期后在25°C室温下进行传毒接种， 三天后移除带毒灰飞虱； 2. 5)待测玉米植株取样及RNA提取：移除带毒灰飞虱后开始计算，按周期采集待测玉 米品种植株上部第一个叶片并提取RNA。
[0023] 所述步骤2. 4)中的带毒灰飞虱在开始传毒接种前，需要随机抽取一定数量的带毒 灰飞虱进行RT-PCR检测RBSDV以计算带毒灰飞虱的带毒率；带毒灰飞虱传毒接种时，按照 每株玉米幼苗接种10-15头灰飞虱，并采用80目尼龙网封口的透明玻璃圆筒罩上玉米幼 苗。
[0024] 所述步骤1)中的RBSDV病毒来源于步骤2. 2)中的RBSDV毒源。
[0025] 所述步骤2. 3)中的灰飞虱饲毒后的循回期为25-30天。
[0026] 本发明相比现有技术有如下优点： 本发明的快速检测鉴定方法与以往鉴定方法相比，能够在玉米苗期确定其抗感性，大 大缩短了鉴定周期；与利用发病病症确定抗感性的方法相比，玉米苗期RBSDV病毒积累动 态曲线从分子水平上确定其抗感性，可靠性高，具有较大的育种应用价值。
【附图说明】
[0027] 附图1为本发明的实施例中获得的绝对定量的标准曲线图； 附图2为本发明的实施例中的灰飞虱带毒率检测结果示意图； 附图3为本发明的实施例中C7-2、P138、丹340、478、XH6、M〇17、郑58和郑单958玉米 品种体内RBSDV病毒积累动态曲线图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图与实施例对本发明作进一步的说明。
[0029] -种玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，该快速检测鉴定方法包括以下步 骤：1)焚光定量PCR反应获取RBSDV病毒含量标准曲线：利用RBSDV病毒S7片段的重组质 粒DNA作为标准品，经10倍稀释后对获得的梯度标准品进行荧光定量RT-PCR扩增，以各梯 度浓度标准品的模板拷贝数的对数值为横坐标值、以各梯度浓度标准品测得的Ct值为纵 坐标值，绘制出标准曲线；2)玉米样品RNA获取：在玉米苗期周期时间点采集待测玉米品种 特定位置叶片并提取RNA ;3)玉米样品病毒拷贝数获取及抗性鉴定：对步骤2)中提取的RNA 进行荧光定量RT-PCR检测获得不同时间样品的Ct值，再利用步骤1)中的标准曲线计算出 相应的病毒拷贝数，以取样时间点为横坐标值、与取样时间点相对应的病毒拷贝数的对数 值为纵坐标值，即可获得该玉米品种体内RBSDV病毒积累动态曲线图，从而快速确定该玉 米品种的玉米粗缩病种质抗性。
[0030] 其中步骤1)中的荧光定量PCR反应获取RBSDV病毒含量标准曲线的具体过程如 下：1. 1)标准品制备：利用引物RBSDV-F :5'-AGA GCT CTT CTA GTT ATT GCG-3'和RBSDV-R : 5' -TCA GCA AAA GGT AAA GGA ACG-3' 扩增 RBSDV 病毒的 S7 片段，并回收连接于 pMD18-T 载体，经测序确认为该S7片段的重组质粒DNA后作为标准品，用Nano drop 2000测得标准 品的质粒浓度并计算出标准品起始拷贝数；1. 2)制备梯度标准品：将步骤I. 1)获得的标准 品作为标准品I，依次按照下述稀释方法稀释：Iv原液(标准品I )+9v稀释缓冲液，得标准 品II ; Iv标准品II +9v稀释缓冲液，得标准品III ;Iv标准品III +9v稀释缓冲液，得标准品IV ; Iv标准品IV+9v稀释缓冲液，得标准品V ;Iv标准品V+9v稀释缓冲液，得标准品VI ;Iv标 准品VI +9v稀释缓冲液，得标准品W ;Iv标准品W +9v稀释缓冲液，得标准品VID ;最终获得 梯度标准品溶液：标准品I、标准品II、标准品III、标准品IV、标准品V，标准品VI、标准品W 和标准品VID ;1. 3)对步骤1. 2)获得的梯度标准品皆采用引物RBSDV-R和RP :5' -GCT CCT ACT GAG TTG CCT GTC-3'进行荧光定量RT-PCR扩增，以各梯度浓度标准品的模板拷贝数的 对数值为横坐标值、以各梯度浓度标准品测得的Ct值为纵坐标值，绘制出标准曲线。且在 步骤1. 3)中和步骤3)中的荧光定量PCR反应体系每20yL中含：10yL的2XqPCR master mix (Promega)、1.0 μ L 的 cDNA 模板、8· 2 μ L 的 ddH20 以及 0· 8 μ L 的 1〇μΜ 引物 RBSDV-R 和RP ;荧光定量PCR扩增程序为：95°C预变性2min ;95°C变性15s，60°C退火15s，72°C延伸 20s，共进行40次循环；95°C变性15s，60°C退火lmin，95°C变性15s。荧光定量PCR反应在 Eppendorf Mastercycler实时焚光定量PCR仪中进行。
[0031] 对步骤3)中获得的取样时间点、与取样时间点相对应的病毒拷贝数进行进一步 鉴定处理的步骤如下：3. 1)以饲毒后周期取样时间点为横坐标值、与取样时间点相对应的 病毒拷贝数为纵坐标值，利用SPSS16. 0软件，对上述数据先进行逻辑斯谛方程拟合，适合 逻辑斯谛方程拟合的即为感病品种，进一步根据具体品种的生长极限值（A值）和最大生长 速度点（TmaxG)大小评价各待测玉米品种抗性水平并进行抗性等级划分；3. 2)同时利用 SPSS16. 0软件，对不适合逻辑斯谛方程的数据进行直线回归拟合，进一步根据具体品种的 斜率大小评价各待测玉米品种抗性水平并进行抗性