量稍高于P138,鉴定为中抗。这个鉴定结果和陈永坤、路银贵、薛林和 谢社香等人所在的四家单位的大田多年多点鉴定结果相吻合。因此利用荧光定量RT-PCR 检测玉米植株体内病毒含量并绘制病毒增殖曲线能够准确的区分玉米不同种质的抗感性， 故该指标能够作为评价玉米抗感能力的一个新的指标。
[0036] 在上述直观、快速检测鉴定的基础上，将得到的数据进一步通过数学统计方法对 玉米品种抗性等级进行更加精准的判断划分。将实施例获得的数据以饲毒后周期取样时 间点为横坐标值、以病毒拷贝数为纵坐标值，利用SPSS16. O软件，对获得的数据先进行逻 辑斯谛方程拟合，适合逻辑斯谛方程拟合的即为感病品种，进一步根据具体品种的A值和 TmaxG大小评价各待测玉米品种抗性水平并进行抗性等级划分，其中A值为I X IO8或者 TmaxG小于33的确认为高感品种、A值为I X IO7或者TmaxG大于43的确认为感病品种；同 时利用SPSS16. 0软件，对不适合逻辑斯谛方程的数据进行直线回归拟合，进一步根据具体 品种的斜率大小评价各待测玉米品种抗性水平并进行抗性等级划分，其中斜率小于30的 确定为高抗品种，斜率大于30的确定为中抗品种。下表一和下表二则为采用SPSS16. 0软 件分别进行逻辑斯谛方程拟合获得的相关参数和直线回归拟合获得的斜率值。
[0037] 表一 SPSS16. 0软件进行逻辑斯谛方程拟合获得的相关参数表。
[0038] 表二SPSS16.0软件进行直线回归拟合获得的斜率值。
[0039] 由表一和表二得出的数值能够得出，采用SPSS16. 0软件分析得出的结果与RBSDV 病毒积累动态曲线图的结果一致，既表明了 RBSDV病毒积累动态曲线图能够在苗期准确判 断玉米品种的种质抗性，同时亦通过统计学参数值进一步将玉米品种抗性等级进行更加精 准的判断划分。
[0040] 本发明的鉴定新方法与以往鉴定方法相比，能够在玉米苗期确定其抗感性，大大 缩短了鉴定周期；与利用发病病症确定抗感性的方法相比，玉米苗期RBSDV病毒积累动态 曲线从分子水平上确定其抗感性，可靠性高，具有较大的育种应用价值。
[0041] 以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是 按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围 之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。
【主权项】
1. 一种玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：该快速检测鉴定方法 包括以下步骤： 1) 荧光定量PCR反应获取RBSDV病毒含量标准曲线：利用RBSDV病毒S7片段的重组 质粒DNA作为标准品，经10倍稀释后对获得的梯度标准品进行荧光定量RT-PCR扩增，以各 梯度浓度标准品的模板拷贝数的对数值为横坐标值、以各梯度浓度标准品测得的Ct值为 纵坐标值，绘制出标准曲线； 2) 玉米样品RNA获取：在玉米苗期周期时间点采集待测玉米品种特定位置叶片并提取 RNA； 3 )玉米样品病毒拷贝数获取及抗性鉴定：对步骤2 )中提取的RNA进行荧光定量RT-PCR 检测获得不同时间样品的Ct值，再利用步骤1)中的标准曲线计算出相应的病毒拷贝数，以 取样时间点为横坐标值、与取样时间点相对应的病毒拷贝数的对数值为纵坐标值，即可获 得该玉米品种体内RBSDV病毒积累动态曲线图，从而快速确定该玉米品种的玉米粗缩病种 质抗性。2. 根据权利要求1所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：所 述步骤1)中的荧光定量PCR反应获取RBSDV病毒含量标准曲线的具体过程如下： I. 1)标准品制备：利用引物 RBSDV-F :5' -AGA GCT CTT CTA GIT AIT GCG-3' 和 RBSDV-R :5'-TCA GCA AAA GGT AAA GGA ACG-3'扩增 RBSDV 病毒的 S7 片段，并回收连接于 PMD18-T载体，经测序确认为该S7片段的重组质粒DNA后作为标准品，用Nano drop 2000 测得标准品的质粒浓度并计算出标准品起始拷贝数； 1. 2)制备梯度标准品：将步骤I. 1)获得的标准品作为标准品I，对标准品I进彳丁 10 倍稀释获得标准品II，并依次进行10倍稀释，最终获得梯度标准品溶液：标准品I、标准品 II、标准品III、标准品IV、标准品V，标准品VI、标准品W和标准品VID; 1. 3)对步骤1. 2)获得的梯度标准品皆采用引物RBSDV-R和RP :5' -GCT CCT ACT GAG TTG CCT GTC-3'进行荧光定量RT-PCR扩增，以各梯度浓度标准品的模板拷贝数的对数值为 横坐标值、以各梯度浓度标准品测得的Ct值为纵坐标值，绘制出标准曲线。3. 根据权利要求1或2所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在 于：所述步骤1.3)中和所述步骤3)中的荧光定量PCR反应体系每20yL中含：10yL的 2 XqPCR master mix (Promega)、1. 0 y L 的 cDNA 模板、8. 2 y L 的 ddH20 以及 0? 8 y L 的 IOMM 引物RBSDV-R和RP ;荧光定量PCR扩增程序为：95°C预变性2min ;95°C变性15s，60°C退火 15s，72°C延伸20s，共进行40次循环；95°C变性15s，60°C退火lmin，95°C变性15s。4. 根据权利要求1所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：对 步骤3)中获得的取样时间点、与取样时间点相对应的病毒拷贝数进行进一步鉴定处理的步 骤如下： 3. 1)以饲毒后周期取样时间点为横坐标值、病毒拷贝数为纵坐标值，对上述数据先进 行逻辑斯谛方程拟合，适合逻辑斯谛方程拟合的即为感病品种，进一步根据具体品种的生 长极限值和最大生长速度点大小评价各待测玉米品种抗性水平并进行抗性等级划分； 3. 2)对不适合逻辑斯谛方程拟合的数据进行直线回归拟合，进一步根据具体品种的斜 率大小评价各待测玉米品种抗性水平并进行抗性等级划分。5. 根据权利要求4所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：所 述步骤3. 1)中的抗性等级划分为：生长极限值为IXIO8或者最大生长速度点小于33的确 认为高感品种；生长极限值为IXIO7或者最大生长速度点大于43的确认为感病品种；所述 步骤3. 2)中的抗性等级划分为：斜率小于30的确定为尚抗品种，斜率大于30的确定为中 抗品种。6. 根据权利要求1所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：所 述步骤2)中的玉米苗期周期时间点为RBSDV传毒后3-35天内均匀分布的3-5个时间点； 待测玉米品种特定位置为顶部第一个叶片。7. 根据权利要求1或6所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于： 所述步骤2)中的待测玉米品种为人工带毒玉米植株，该人工带毒玉米植株的培育过程为： 2. 1)无毒灰飞虱继代繁殖：春季采集灰飞虱成虫，而后饲养在小麦幼苗上并产卵，收集 刚孵化的1龄若虫即为无毒灰飞虱，之后在小麦幼苗进行人工饲养继代繁殖； 2. 2)RBSDV毒源：从田间采集症状表现为绿矮病的小麦病株，带回实验室检测证明小 麦病株体内寄生病毒为RBSDV并将带毒的小麦病株作为RBSDV毒源小麦，而后利用无毒灰 飞虱在毒源上饲毒而后传毒于麦苗上进行毒源繁殖； 2. 3)带毒灰飞虱获得：将室内人工饲养的无毒灰飞虱，置于RBSDV毒源小麦上，饲毒处 理后移除毒源，将灰飞虱转移到新鲜健康小麦幼苗上饲养度过循回期即为带毒灰飞虱； 2. 4)带毒灰飞虱传毒接种：玉米幼苗长至一叶一心期后在25°C室温下进行传毒接种， 三天后移除带毒灰飞虱； 2. 5)待测玉米植株取样及RNA提取：移除带毒灰飞虱后开始计算，按周期采集待测玉 米品种植株上部第一个叶片并提取RNA。8. 根据权利要求7所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：所 述步骤2. 4)中的带毒灰飞虱在开始传毒接种前，需要随机抽取一定数量的带毒灰飞虱进行 RT-PCR检测RBSDV以计算带毒灰飞虱的带毒率；带毒灰飞虱传毒接种时，按照每株玉米幼 苗接种10-15头灰飞虱，并采用80目尼龙网封口的透明玻璃圆筒罩上玉米幼苗。9. 根据权利要求7所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：所 述步骤1)中的RBSDV病毒来源于步骤2. 2)中的RBSDV毒源。10. 根据权利要求7所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：所 述步骤2. 3)中的灰飞虱饲毒后的循回期为25-30天。
【专利摘要】本发明公开了一种玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，该方法步骤如下：1）利用RBSDV病毒S7片段的重组质粒DNA作为标准品，稀释后对获得的梯度标准品进行荧光定量RT-PCR扩增，以各梯度浓度标准品的模板拷贝数的对数值为横坐标值、Ct值为纵坐标值绘制出标准曲线；2）在玉米苗期周期时间点采集待测玉米品种特定位置叶片并提取RNA；3）对提取的RNA进行荧光定量RT-PCR检测获得不同时间样品的Ct值，再利用标准曲线计算出病毒拷贝数，即可获得该玉米品种体内RBSDV病毒积累动态曲线图，从而确定抗感性。本发明能够在玉米苗期从分子水平上确定其抗感性，鉴定周期短且可靠性高，具有较大的育种应用价值。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104928365
【申请号】CN201510258990
【发明人】铁双贵, 韩小花, 卢彩霞, 岳润清, 齐建双, 燕树锋, 池海锋, 陈娜娜, 付晓雷, 刘璐
【申请人】河南省农业科学院
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年5月20日