本发明涉及RS3型抗性淀粉的制备，具体涉及一种以RS3型马铃薯抗性淀粉为晶种复合异淀粉酶、普鲁兰酶的分步脱支酶解过程制备RS3型籼米抗性淀粉的方法。
背景技术：
抗性淀粉是指不被健康人体小肠所消化，而能在大肠中被消化吸收的淀粉及其降解产物的总称。RS3型抗性淀粉又称为回生或重结晶淀粉，制备原理主要是将淀粉糊化后再迅速冷藏老化回生，淀粉在外加热源的处理条件下，分子链吸水糊化，结晶高聚态瓦解，呈高能无序态；迅速冷藏过程中淀粉分子在空间构象上发生重结晶，转为结构高度致密的有序态。RS3既具有抗性淀粉独特的抗酶解消化能力和类似胰岛素、膳食纤维的生理活性功能，且具有颗粒细小、颜色白腻、风味淡、持水力温和等特点，而受到世界各地食品科学家及营养学家的关注，有重要的“药膳”和商业价值。直链淀粉分子间氢键结合形成双螺旋进一步堆积聚集形成重结晶是淀粉短期回生的主力军。籼米因其粗糙的口感，易碎，较差的加工品质及易陈化等劣势，商品价值极低。大量研究表明，籼米淀粉组分中的直链淀粉含量远高于粳米和糯米，是极好的生产RS3型抗性淀粉的原料。晶种诱导是指在晶核形成初期，通过添加一定量的晶种降低体系的过饱和度，使晶体在外加晶核的基础上快速生长，提高体系稳定性，加快晶体形成，得到晶体粒度分布集中的晶体颗粒。马铃薯原料易得，天生具有高含量的直链淀粉，是作为制备RS3型籼米抗性淀粉晶种的最佳选择。
近几年，RS3的制备方法主要有湿热法、酶法、微波法、超声辅助法等，但无论是单一制备方法还是几种方法结合的制备方法都不能得到粒度分布集中的晶体颗粒产品，且目前使用的酶法制备RS3均采用液化酶复合脱支酶，液化酶不仅使原料中的直链淀粉损失且反应过程中产生的大量糊精也影响了RS3生成。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术中制备RS3型抗性淀粉技术的不足，提供一种RS3型籼米抗性淀粉的晶种诱导-双酶复合制备方法，该方法通过对籼米淀粉进行微波预糊化，异淀粉酶和普鲁兰酶分步脱支酶解淀粉分子，提高体系直链淀粉含量，再以RS3型马铃薯抗性淀粉为晶种制备RS3型籼米抗性淀粉，得到的RS3晶体粒度分布集中，平均产率可达27.42%。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：一种RS3型籼米抗性淀粉的晶种诱导-双酶复合制备方法，该方法步骤如下：
a.取粉碎并过40目筛的籼米制成籼米淀粉，将籼米淀粉调至含水量为30-40%后用微波炉以450-600W功率处理2min，得籼米干淀粉；
b.将上述籼米干淀粉用pH为5.0的磷酸盐缓冲溶液配制成淀粉质量分数为10-50%的淀粉乳，80-85℃水浴条件下处理20-30min，冷却至45-50℃，加入异淀粉酶酶解1-5h，异淀粉酶的加入量为1g籼米干淀粉加10-40 U异淀粉酶，灭酶，冷却至室温，用0.1mol/L HCl溶液调pH为4.5，水浴加热至55-60℃，再加入普鲁兰酶酶解1-5h，普鲁兰酶的加入量为1g籼米干淀粉加10-40U普鲁兰酶，灭酶，冷却至30-70℃；
c.于上述酶解后的淀粉乳中加入为籼米干淀粉重量2-10%的RS3型马铃薯抗性淀粉湿晶种，混匀后快速置于4℃环境中冷藏24-48h，纯化，干燥，即得RS3型籼米抗性淀粉；
上述提及的RS3型马铃薯抗性淀粉湿晶种是以马铃薯淀粉（市购产品）为原料，加蒸馏水配制成淀粉质量分数为10%的马铃薯淀粉乳，于80-85%恒温水浴下预糊化至马铃薯淀粉乳呈透明凝胶状，灭菌，冷却至室温，最后置于4℃环境中冷藏24-48h，纯化，即可。
上述RS3型马铃薯抗性淀粉晶种制备中的纯化是指将冷藏后的马铃薯淀粉乳的pH值调为1.5，于马铃薯淀粉乳中，按1g原料马铃薯淀粉加12-20U胃蛋白酶的比例加入胃蛋白酶，38-40℃恒温水浴处理1-2h，调节pH值为6.0-6.5；再按1g原料马铃薯淀粉加80-100U耐高温a-淀粉酶的比例加入耐高温a-淀粉酶，于90-95℃恒温水浴处理20-30min，调节pH值为4.0-4.5；接着，按1g原料马铃薯淀粉加150-200U葡萄糖淀粉酶的比例加入葡萄糖淀粉酶，于58-60℃恒温水浴处理1-2h，冷却至室温；最后加入95%质量浓度的乙醇，离心，弃上清液，重复处理（即加乙醇离心过程）3次，室温下挥发乙醇。其中，离心时的转速为4000-4500r/min、时间为15-35min。
上述RS3型马铃薯抗性淀粉晶种制备中的灭菌是指采用高压蒸汽灭菌锅于110-121℃、0.05-0.15MPa条件下灭菌处理20-30min。
上述步骤b中pH为5.0的磷酸盐缓冲盐是由0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液与0.1mol/L 柠檬酸溶液配制。
上述步骤b中的两次灭酶是指将酶解后的淀粉乳于85-90℃恒温水浴10-15min。
上述步骤c中的纯化是指将冷藏后的淀粉乳调pH值为1.5，于该冷藏后的淀粉乳中，按1g籼米干淀粉加12-20U胃蛋白酶的比例加入胃蛋白酶，38-40℃恒温水浴处理1-2h，调节pH值为6.0-6.5；再按1g籼米干淀粉加80-100U耐高温a-淀粉酶的比例加入耐高温a-淀粉酶，于90-95℃恒温水浴处理20-30min，调节pH值为4.0-4.5；然后按1g籼米干淀粉加150-200U葡萄糖淀粉酶的比例加入葡萄糖淀粉酶，于58-60℃恒温水浴处理1-2h，冷却至室温；最后加入95%质量浓度的乙醇，离心，弃上清液，重复（即重复加乙醇离心的过程）处理3次，室温下挥发乙醇。其中，离心时的转速为4000-4500r/min、时间为15-35min。
上述步骤c中的干燥是指于60-70℃烘干8-10h。
上述提及的籼米淀粉的制备为本领域的常规技术，凡依现有技术能制备得到籼米淀粉的方法，皆适应用于本发明。如：将籼米粉原料置入浸渍槽中，加入为籼米粉重量5倍的0.3-0.5%质量浓度的氢氧化钠溶液，50℃下浸渍24小时，然后排出碱液，用清水洗涤一次，再次加入为籼米粉原料重量5倍的0.3-0.5%质量浓度的氢氧化钠溶液浸渍36-38小时，排出碱液后研磨成浆，研磨时按1:1的重量比一边研磨一边加入0.3-0.5%质量浓度的氢氧化钠溶液，将米浆沉淀或送入离心机中分离，所得的湿淀粉再用清水多次漂洗，精净即可。
上述提及的各种酶均为市购产品。
本发明利用微波技术预先处理籼米淀粉原料，能使淀粉分子膨胀，扩大与异淀粉酶和普鲁兰酶的接触面积，提高了酶解效率。淀粉体系中的直链淀粉含量迅速提高，并在外加晶种的诱导条件下快速发生重结晶，生成粒度分布集中的RS3型籼米抗性淀粉晶体颗粒产品。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.籼米因其粗糙的口感、易碎、较差的加工品质和易陈化等劣势，商品价值极低。本发明充分利用籼米中直链淀粉远高于粳米和糯米这一优势，将其作为生产RS3型抗性淀粉的原料，提升了籼米附加值和应用领域。
2.本发明采用异淀粉酶和普鲁兰酶分步对籼米淀粉进行脱支处理，此方法避免了目前研究中使用液化酶导致直链淀粉损失且产生大量糊精影响RS3生成等负面影响。
3.脱支酶解后添加RS3型马铃薯抗性淀粉晶种，诱导淀粉体系中易于重结晶的直链淀粉在较低的过饱和度下快速聚集生长，避免了自然起晶时间长，易发生爆发成核等劣势现象，晶种诱导成核不仅有利于RS3型籼米抗性淀粉晶体的生长，还有利于提高产率，得到晶体粒度分布集中的抗性淀粉产品。
4.本发明使用的淀粉原料易得，不受季节限制，可常年生产，加工成本合理，产品具有很好的市场前景。
具体实施方式
籼米淀粉的制备：取籼米粉碎，过40目筛，按现有技术制备成籼米淀粉。
实施例1
RS3型马铃薯抗性淀粉湿晶种的制备：以马铃薯淀粉为原料，加蒸馏水配制成淀粉质量分数为10%的马铃薯淀粉乳，于80%恒温水浴下预糊化，至马铃薯淀粉乳呈透明凝胶状，再采用高压蒸汽灭菌锅于110℃、0.05MPa条件下处理30min，冷却至室温，置于4℃环境中冷藏24h，调pH值为1.5；于马铃薯淀粉乳中，按1g原料马铃薯淀粉加12U胃蛋白酶的比例加入胃蛋白酶，于38℃恒温水浴处理2h，调节pH值为6.0；再按1g原料马铃薯淀粉加80U耐高温a-淀粉酶的比例加入耐高温a-淀粉酶，于90℃恒温水浴处理30min，调节pH值为4.0；接着，按1g原料马铃薯淀粉加150U葡萄糖淀粉酶的比例加入葡萄糖淀粉酶，于58℃恒温水浴处理2h，冷却至室温；最后加入95%质量浓度的乙醇，以4000r/min离心35min，弃上清液，重复处理3次，室温下挥发乙醇，即得。
RS3型籼米抗性淀粉的制备：以上述籼米淀粉为原料，调节含水量为30%，用微波炉以450W功率处理2min后，得籼米干淀粉，用pH为5.0的磷酸盐缓冲溶液将籼米干淀粉配制成淀粉质量分数为10%的淀粉乳，80℃水浴条件下处理30min，冷却至45℃，加入异淀粉酶（1g籼米干淀粉加10U异淀粉酶）酶解5h，灭酶（于85℃恒温水浴15min），冷却至室温，用0.1mol/L HCl溶液调pH为4.5，水浴加热至55℃，再加入普鲁兰酶（1g籼米干淀粉加10U普鲁兰酶）酶解5h，灭酶（于85℃恒温水浴15min），冷却至30℃；于上述酶解后的淀粉乳中加入为籼米干淀粉重量2%的上述RS3型马铃薯抗性淀粉湿晶种，混匀后快速置于4℃环境中冷藏24h，将冷藏后的淀粉乳调pH值为1.5，再于该冷藏后的淀粉乳中加入胃蛋白酶（1g籼米干淀粉加12U胃蛋白酶），38℃恒温水浴处理2h，调节pH值为6.0，接着加入耐高温a-淀粉酶（1g籼米干淀粉加80U耐高温a-淀粉酶），于90℃恒温水浴处理30min，调节pH值为4.0，然后加入葡萄糖淀粉酶（1g籼米干淀粉加150U葡萄糖淀粉酶），于58℃恒温水浴处理2h，冷却至室温，最后加入95%质量浓度的乙醇，以4000r/min离心35min，弃上清液，重复处理3次，室温下挥发乙醇，60℃干燥10h，即得RS3型籼米抗性淀粉。
实施例2
RS3型马铃薯抗性淀粉湿晶种的制备：以马铃薯淀粉为原料，加蒸馏水配制成淀粉质量分数为10%的马铃薯淀粉乳，于85%恒温水浴下预糊化，至马铃薯淀粉乳呈透明凝胶状，再采用高压蒸汽灭菌锅于121℃、0.15MPa下处理20min，冷却至室温，置于4℃环境中冷藏48h，调pH值为1.5；于马铃薯淀粉乳中，按1g原料马铃薯淀粉加20U胃蛋白酶的比例加入胃蛋白酶，于40℃恒温水浴处理1h，调节pH值为6.5；再按1g原料马铃薯淀粉加100U耐高温a-淀粉酶的比例加入耐高温a-淀粉酶，于95℃恒温水浴处理20min，调节pH值为4.5；接着，按1g原料马铃薯淀粉加150U葡萄糖淀粉酶的比例加入葡萄糖淀粉酶，于60℃恒温水浴处理1h，冷却至室温；最后加入95%质量浓度的乙醇，以4500r/min离心15min，弃上清液，重复处理3次，室温下挥发乙醇，即得。
RS3型籼米抗性淀粉的制备：以上述籼米淀粉为原料，调节含水量为40%，用微波炉以600W功率处理2min，用pH为5.0的磷酸盐缓冲溶液将籼米干淀粉配制成淀粉质量分数为50%的淀粉乳，85℃水浴条件下处理20min，冷却至50℃，加入异淀粉酶（1g籼米干淀粉加40U异淀粉酶）酶解1h，灭酶（于90℃恒温水浴10min），冷却至室温，用0.1mol/L HCl溶液调pH至4.5，水浴加热至60℃，再加入普鲁兰酶（1g籼米干淀粉加40U普鲁兰酶）酶解1h，灭酶（于90℃恒温水浴10min），冷却至70℃；于上述酶解后的淀粉乳中加入为籼米干淀粉重量10%的上述RS3型马铃薯抗性淀粉湿晶种，混匀后快速置于4℃环境中冷藏48h，将冷藏后的淀粉乳调pH值至1.5，再于冷藏后的淀粉乳中加入胃蛋白酶（1g籼米干淀粉加20U胃蛋白酶），40℃恒温水浴处理1h，调节pH值为6.5，接着加入耐高温a-淀粉酶（1g籼米干淀粉加100U耐高温a-淀粉酶），于95℃恒温水浴处理20min，调节pH值为4.5，然后加入葡萄糖淀粉酶（1g籼米干淀粉加200U葡萄糖淀粉酶），于60℃恒温水浴处理1h，冷却至室温，最后加入95%质量浓度的乙醇，以4500r/min离心15min，弃上清液，重复处理3次，室温下挥发乙醇，70℃干燥8h，即得RS3型籼米抗性淀粉。
实施例3
RS3型马铃薯抗性淀粉湿晶种的制备：以马铃薯淀粉为原料，加蒸馏水配制成淀粉质量分数为10%的马铃薯淀粉乳，于82%恒温水浴下预糊化，至马铃薯淀粉乳呈透明凝胶状，采用高压蒸汽灭菌锅于115℃、0.10MPa条件下处理25min，冷却至室温，置于4℃环境中冷藏36h，调pH值为1.5；于马铃薯淀粉乳中，按1g原料马铃薯淀粉加16U胃蛋白酶的比例加入胃蛋白酶，于39℃恒温水浴处理1.5h，调节pH值为6.2；再按1g原料马铃薯淀粉加90U耐高温a-淀粉酶的比例加入耐高温a-淀粉酶，于92℃恒温水浴处理25min，调节pH值为4.2；接着，按1g原料马铃薯淀粉加180U葡萄糖淀粉酶的比例加入葡萄糖淀粉酶，于59℃恒温水浴处理1.5h，冷却至室温；最后加入95%质量浓度的乙醇，以4200r/min离心25min，弃上清液，重复处理3次，室温下挥发乙醇，即得。
RS3型籼米抗性淀粉的制备：以上述籼米淀粉为原料，调节含水量为35%，用微波炉以500W功率处理2min，得籼米干淀粉；用pH为5.0的磷酸盐缓冲溶液将籼米干淀粉配制成淀粉质量分数为30%的淀粉乳，82℃水浴条件下处理25min，冷却至48℃，加入异淀粉酶（1g籼米干淀粉加20U异淀粉酶）酶解3h，灭酶（88℃恒温水浴12min），冷却至室温，用0.1mol/L HCl溶液调pH至4.5，水浴加热至58℃，再加入普鲁兰酶（1g籼米干淀粉加20U普鲁兰酶）酶解3h，灭酶（88℃恒温水浴12min），冷却至50℃；于上述酶解后的淀粉乳中加入为籼米干淀粉重量7%的上述RS3型马铃薯抗性淀粉湿晶种，混匀后快速置于4℃环境中冷藏36h，将冷藏后的淀粉乳调pH值至1.5，再于冷藏后的淀粉乳中加入胃蛋白酶（1g籼米干淀粉加16U胃蛋白酶），39℃恒温水浴处理1.5h，调节pH值为6.2，接着加入耐高温a-淀粉酶（1g籼米干淀粉加90U耐高温a-淀粉酶），于92℃恒温水浴处理25min，调节pH值为4.2，然后加入葡萄糖淀粉酶（1g籼米干淀粉加180U葡萄糖淀粉酶），于59℃恒温水浴处理1.5h，冷却至室温，最后加入95%质量浓度的乙醇，以4200r/min离心25min，弃上清液，重复处理3次，室温下挥发乙醇，65℃干燥9h，即得RS3型籼米抗性淀粉。