专利名称：氯霉素抗性温控裂解质粒及其构建与在菌蜕制备中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种质粒载体，特别涉及一种氯霉素抗性温控裂解质粒及其构建方法，以及其在制备大肠杆菌菌蜕中的用途，属于基因工程领域。
背景技术：
细菌菌蜕(Bacterial ghost)是革兰氏阴性菌被噬菌体PhiX174的裂解蛋白E 裂解后形成的完整细菌空壳，这种非变性的基因灭活方式使菌蜕保留了和活菌一样的细菌胞膜结构和相关抗原蛋白，从而诱导机体的体液免疫和细胞免疫应答。菌蜕外膜的天然的高度保守结构 PAMP (pathogen-associated molecular patterns)，例如脂多糖、妝聚糖、 CPG、菌毛等，能被免疫细胞通过模式识别受体识别，有效地被树突状细胞和巨噬细胞吞噬， 并有效地促进树突状细胞的成熟和活化。菌蜕的这些生物学特点使其可直接作为疫苗使用，还可作为递呈异源抗原的重组疫苗及作为DNA疫苗甚至药物的递送载体。另外，菌蜕可以通过发酵方式生产，且冷冻干燥的菌蜕在室温下可长期保持，而不会造成效率的损失。细菌菌蜕的形成是通过对噬菌体PhiX174的裂解基因E的严格表达调控实现的。 裂解基因E可以受控于多个表达系统，如ApL/pR-cI857, LacPO-LaclH启动与阻隔物)、 PTol-xylS以及PBAD_araC等，其中应用最广泛的是在λ pL/pR_cl857转录控制下实现基因的可控表达。基因E的可控表达介导的细菌裂解已经成功地应用于各种大肠杆菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、霍乱弧菌、肺炎克雷伯氏菌、幽门螺旋杆菌、胸膜肺炎放射杆菌、流感嗜血杆菌、溶血巴氏杆菌、多杀巴氏杆菌、迟钝爱德华菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌等。 应用范围之广说明只要将基因E裂解框引入到适当的载体中，E蛋白介导的裂解可能会在每种革兰氏阴性菌中发生。目前已经构建的基因E介导的裂解质粒多数利用氨苄青霉素作为抗性筛选标记， 还有一些具有卡那霉素、四环素或庆大霉素抗性筛选标记。由于细菌耐药性现象越来越常见，许多细菌对氨苄青霉素、卡那霉素等常用抗生素产生耐药，无法利用这些抗生素作为筛选标记。但许多病原菌如副溶血性弧菌、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠杆菌0157、变形杆菌、沙门菌、志贺菌等均对氯霉素敏感，还有大多数水生生物病原菌如柱状嗜纤维菌、 柱状粘纤维菌、荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、点状气单胞菌、杀鲑气单胞菌及鲁克氏耶尔森氏菌等均对氯霉素敏感或者高度敏感。因此，利用氯霉素作为抗性筛选标记能使E蛋白介导的裂解应用到更广泛的细菌菌株中。构建氯霉素抗性的温控裂解质粒是许多病原菌能够成功形成菌蜕的前提。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种新的氯霉素抗性温控裂解质粒，并提供了其构建方法，以及其在菌蜕制备中的应用。本发明是通过以下技术方案实现的一种氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat，由噬菌体PhiX174裂解基因E (如SEQ No. 3所示)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat，如SEQ No. 4所示)和原核温控表达载体 PBV220 组成。所述氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat的构建方法为以卩遼菌体PhiX174 RFI DNA为模板、SEQ No. I和SEQ No. 2所示DNA为引物进行PCR扩增，获得噬菌体PhiX174 裂解基因E，然后将其与经EcoR I和Pst I双酶切的pBV220载体连接，获得温控裂解质粒 pBV-geneE ;将质粒pLysS经Acc II酶切，获得1787bp的包含侧翼调控序列的cat基因，然后用T4 DNA Iigase将cat基因与经Sca I单酶切的pBV-geneE进行连接，获得氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat。所述氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat能够用于制备菌脱,具体应用方式举例如下将氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat电击转化到大肠杆菌感受态细胞中；电转化后涂布含氯霉素的LB琼脂平板，培养，通过菌落PCR鉴定转化子；然后，将转化成功的含pBV-geneE-cat的大肠杆菌单克隆接种于含氯霉素的LB液体培养基，振荡培养， 然后再转接于含氯霉素的LB液体培养基中，振荡培养至OD6tltol达O. 4-0. 6，将培养物迅速调至42°C培养以诱导E基因的表达，继续培养，即得大肠杆菌菌蜕。上述制备菌蜕的方法具体如下将氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat电击转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，所述的电转化感受态细胞购自TaKaRa，或是参照Sambrook等的方法(分子克隆实验指南)制备，电转化仪(Bio-Rad, California, USA) 的电击参数为1. 5kV/cm、25 μ F、200 Ω、4· Oms,电转化后涂布含37 μ g/mL氯霉素的LB琼脂平板，30°C培养16小时，通过菌落PCR鉴定转化子。将含pBV-geneE-cat的BL21(DE3) 单克隆接种于5mL含37 μ g/mL氯霉素的LB液体培养基，30°C振荡(200r/min)培养过夜， 然后按1-2% (v/v)转接于50mL含37 μ g/mL氯霉素的LB液体培养基中，30°C振荡培养至 OD600nm达O. 4-0. 6。将培养物迅速调至42°C培养以诱导E基因的表达，继续培养4h，即得大肠杆菌菌蜕。本发明构建的氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat能够在对氯霉素敏感的大肠杆菌中稳定存在，且能够诱导其发生较高效率的裂解，成功制备大肠杆菌菌蜕，裂解效率可高达99. 998%。本发明构建的氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat,可以在大肠杆菌中稳定的复制，并能够高效表达氯霉素乙酰转移酶，从而产生氯霉素抗性，以此来作为抗性筛选标记，适用于多数病原菌，如副溶血性弧菌、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠杆菌0157、 变形杆菌、沙门菌、志贺菌、柱状嗜纤维菌、柱状粘纤维菌、荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、点状气单胞菌、杀鲑气单胞菌及鲁克氏耶尔森氏菌等，应用广泛，且可高效表达裂解基因E，制备的菌蜕裂解效率高，可达99. 998%。
图I :本发明构建氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat的流程示意图；图2 :含氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat的大肠杆菌BL21 (DE3)的裂解动力学曲线；图3 :大肠杆菌BL21 (DE3)菌蜕的透射电镜照片。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步阐释本发明，本发明构建的氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat的结构特征和优势将随着描述而更为清晰。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。试验材料质粒PBV220、质粒pLysS、菌株BL21 (DE3)为本实验室保存； Enterobacteria phage phiX174 RFI DNA,限制性内切酶，T4DNA ligase, PCR 相关试剂， Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit,TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit 均购于购于TaKaRa宝生物(工程)大连有限公司；引物合成与测序由华大基因(BGI)完成。实施例I、氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat的构建I. lPhiX174裂解基因E的克隆根据GenBank中PhiX174基因E的编码序列设计引物geneE-F :5’ -ATCAGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTG-3’ (SEQ No. I)，引入 EcoR I 限制性酶切位点；geneE-R 5，~GGCCTGCAGCAGAACGTTTTTTACCTTTAG~3，(SEQ No. 2)，引入 Pst I 限制性酶切位点。引物由华大基因合成。以PhiX174RFIDNA为模板通过PCR扩增基因E。PCR反应体系为 TaKaRa Ex Taq I. 2U, IOXEx Taq Buffer (Mg2+Plus) 5 μ L, dNTP Mixture (各 2. 5mM)4y L, PhiX174RFI DNA2ng, geneE-F (20 μ M) I μ L, geneE-R (20 μ Μ) I μ L，补水到 50 μ L0 PCR 反应程序为 94°C预变性 5min，94°C 45s, 56°C 45s, 72°C 40s，28 个循环，72°C延伸lmin。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收约300bp的片段，用EcoR I和Pst I进行双酶切，回收酶切产物，获得geneE。12温控裂解质粒pBV-geneE的构建质粒pBV220经EcoR I和Pst I双酶切，酶切反应体系为EcoR I 10U、Pst I 10U、 IOXH Buffer 2 μ L、pBV2200. 8 μ g、补水至20μ L，37°C酶切lh，回收酶切产物，获得线性化pBV220。将线性化pBV220与geneE连接，连接反应体系为T4DNA ligase 350U、geneE 0.4pmol、pBV O. 03pmol、10XT4DNALigase Buffer 2· 5 μ L，补水至 25 μ L，16°C连接 12h， 并热击转化入大肠杆菌DH5 α。转化的DH5 α先在无氨苄青霉素的LB液体培养基中30°C、 180r/min条件下振荡培养lh，然后将其涂布在含有氨苄青霉素50 μ g/ml的LB平板上， 30°C培养16h。通过菌液PCR筛选阳性克隆，并测序鉴定。基因E序列正确的转化子进行增菌培养，提取质粒，命名为pBV-geneE。I. 3氯霉素乙酰转移酶基因cat平末端片段的获得质粒pLysS经AccII 单酶切，酶切体系为 Acc II 10U、10XM Buffer 2 μ L>pLysS 0. 6μ g、补水至20μ L，37°C酶切lh。琼脂糖凝胶电泳酶切产物，切胶回收约1800bp条带， 获得包含启动子区的氯霉素乙酰转移酶基因cat片段。14pBV-geneE线性化平末端片段的获得质粒pBV220_geneE 经 Sca I 酶切，酶切体系为 Sca I 10UU0XH Buffer 2 μ L、 PBV2200. 8 μ g、补水至20 μ L，37°C酶切Ih。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，回收约3. 6kb条带，获得pBV-geneE线性化平末端片段。
I. 5pBV_geneE_cat 质粒的构建将cat基因片段憐酸化处理，反应体系为T4polynucleotide Kinase 12U、cat 10pmol、5 μ L10XT4 Polynucleotide Kinase Buffer、补水至 50 μ L, 37 °C 处理 lh。将线性化质粒pBV-geneE去磷酸化，反应体系为Alkaline Phosphatase 4U、线性化质粒 pBV-geneE 15pmoIUO X SAPBuffer 5 μ L，补水至 50 μ L，37°C处理 lh。用T4 DNA ligase连接去磷酸化的pBV-geneE片段与磷酸化的cat片段,连接反应体系为T4DNAligase 350U、憐酸化cat片段04pmol、去憐酸化pBV-geneE片段O. 03pmol、 10XT4DNA Ligase Buffer 2· 5 μ L、补水至25 μ L，16°C反应12h。将连接产物通过热击转化入大肠杆菌DH5a。通过氯霉素和菌液PCR筛选阳性克隆，并测序鉴定。基因E和基因 cat的序列均正确的转化子进行增菌培养,提取质粒,命名为pBV-geneE-cat。上述构建氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat的流程示意图如图I所示。实施例2、质粒pBV-geneE-cat转化大肠杆菌BL21 (DE3)制备菌脱2. I氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat的电转化将氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat电击转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，所述的电转化感受态细胞购自TaKaRa,参照Sambrook等的方法(分子克隆实验指南)制备，电转化仪(Bio-Rad, California, USA)的电击参数为I. 25kV/cm、25 μ F、200 Ω、 6. 0ms,电转化后涂布含37 μ g/mL氯霉素的LB琼脂平板，30°C培养16小时，通过菌落PCR
鉴定转化子。将含氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat的BL21 (DE3)单克隆接种于5mL含 371^/1^氯霉素的1^液体培养基，301振荡(200r/min)培养过夜，然后按I % (v/v)转接于50mL含37 μ g/mL氯霉素的LB液体培养基中，30°C振荡培养至OD6tltlnm达0. 4-0. 6。将培养物迅速调至42°C培养以诱导E基因的表达，继续培养4h。诱导前后不同时间点取样，监测培养物的OD6tltlnm和活菌CFU变化，活菌CFU通过将诱导前后的培养物各100 μ L适当稀释后涂布LB平板进行计数。诱导结束后形成的ghost菌蜕用PBS洗涤3次，冻干保存，并对冻干后的菌蜕进行活菌CFU检测。质粒pBV-geneE-cat诱导BL21 (DE3)裂解的动力学曲线见图2。升温诱导30min 后，BL21(DE3)培养物的0D_和活菌CFU均快速降低，随后缓慢降低至最低水平。诱导前培养物的活菌数为3. 45X 107CFU/mL，诱导结束时培养物的活菌数为5. 26 X 102CFU/mL,该质粒的裂解效率达99. 998%。冻干后的菌蜕未检测到活菌。试验例I、大肠杆菌BL21(DE3)菌蜕的透射电镜观察将实施例2中42°C诱导4h的菌液4000g离心lOmin，用2. 5%戊二醛4°C下固定细菌3h，0.01mol/LPBS洗涤3次，离心后直接电镜观察。结果见图3。
权利要求
1.一种氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat，其特征在于由噬菌体PhiX174裂解基因E、氯霉素乙酰转移酶基因和原核温控表达载体pBV220组成。
2.权利要求I所述的氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat的构建方法,其特征在于以噬菌体PhiX174RFI DNA为模板、SEQ No. I和SEQ No. 2所示DNA为引物进行PCR扩增，获得噬菌体PhiX174裂解基因E，然后将其与经EcoR I和Pst I双酶切的pBV220载体连接，获得温控裂解质粒pBV-geneE ;将质粒pLysS经Acc II酶切，获得1787bp的包含侧翼调控序列的cat基因，然后用T4DNA Iigase将cat基因与经Sca I单酶切的pBV-geneE 进行连接，获得氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat。
3.权利要求I所述的氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat在制备菌脱中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于制备菌蜕的方法如下将氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat电击转化到大肠杆菌感受态细胞中；电转化后涂布含氯霉素的LB 琼脂平板，培养，通过菌落PCR鉴定转化子；然后,将转化成功的含pBV-geneE-cat的大肠杆菌单克隆接种于含氯霉素的LB液体培养基，振荡培养，然后再转接于含氯霉素的LB液体培养基中，振荡培养至OD6tltlnm达0. 4-0. 6，将培养物迅速调至42°C培养以诱导E基因的表达， 继续培养，即得大肠杆菌菌蜕。
全文摘要
氯霉素抗性温控裂解质粒及其构建与在菌蜕制备中的应用。本发明公开了一种氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat及其构建方法，还公开了该质粒pBV-geneE-cat在大肠杆菌Ecoli.BL21(DE3)菌蜕制备中的应用。本发明氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat由噬菌体PhiX174裂解基因E、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)和原核温控表达载体pBV220组成。本发明构建的质粒pBV-geneE-cat可以在大肠杆菌中稳定的复制，并能够高效表达氯霉素乙酰转移酶，从而产生氯霉素抗性，以此来作为抗性筛选标记，还可高效表达裂解基因E，在制备氯霉素敏感的大肠杆菌菌蜕时裂解效率可达99.998％。
文档编号C12N15/66GK102586307SQ20121005357
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者安利国, 杨桂文, 祝文兴, 袁金铎 申请人:山东师范大学