专利名称：转基因大豆bps-cv127-9转化事件外源插入载体旁侧基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因及其应用。
背景技术：
随着转基因作物的大量种植及应用，转基因产品开始大量进入我们的生活。转基因产品潜在的食品安全、生态安全问题日益引起人们的关注，各国纷纷制定相应的法律法规对转基因产品进行监管。许多国家以立法或者其他形式要求对转基因产品进行标记。除美国、加拿大、阿根廷和中国香港特区实行自愿标识制度外，国际上的大多数国家如欧盟各国、日本、韩国等国均制定了一系列强制性的标识标准。我国分别于2001年、2002年颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》及《农业转基因生物标识管理办法》，并启动了农业转基因生物的监督监管机制，要求在食品中只要含有转基因成分就必须进行标识。各国转基因标识制度的相继建立，对转基因检测技术的灵敏度和准确性提出了严格的要求，各种转基因检测技术也成为研究热点。常用的转基因检测方法有外源蛋白检测法、聚合酶链式反应(PCR)法、基因芯片检测技术、分子杂交方法等。虽然国外对转基因作物检测方法研究已有十几年，但由于转基因作物的种类多、数量大，一些转基因产品经过深加工、各种条件处理与保存后，转基因成分部分或完全降解，所以检测难度大。因此，需要根据科学技术的发展不断更新检测方法。根据不同转基因植物及其产品检测目的的不同，鉴定转基因植物主要包括检测筛选基因、目的基因、不同基因间的交联结构基因、和转入基因与受体植物间的转化体特异结构基因。简介如下I、筛选型检测方法筛选检测通常是检测转基因植物中CaMV35S启动子和NOS终止子，因为外源基因在转入作物中为了加强其表达通常会携带35S启动子和NOS终止子。但是35S启动子存在天然的花椰菜花叶病毒，NOS终止子存在于植物病毒Ti质粒中，抗生素类报告基因自然界中也普遍存在，因而仅是检测转基因植物的筛选基因，极易出现假阳性的结果，同时也达不到鉴定转基因植物的目的。2、基因特异性检测方法基因特异性检测就是检测转入转基因植物中的外源目的基因。目前人们检测的目的基因如CP4-EPSPS，BAR, CrylA(b)基因，但是由于一种作物中可能转入了几种目的基因或一种目的基因已转入到几种作物中，在检测时很容易出现假阴性。3、构建特异性检测方法构建特异性检测是利用基因元件之间的边界序列特征，能够有效鉴定使用类似基因元件的不同构建体，而且存在序列信息容易获得的特点，因此被很多研究者所使用。如 Btl76 的 CDPK-CryIA (b)，BtlI 的 IVS6_CryIA (b)，Roundup Ready 大豆的交联结构 35S-CTP，CP4-CTP等结构基因。但是，由同一个构建体可能获得不止一个不同特性的转化株，甚至可能被转化到不同的物种中，而这些转化株未必全部经过了安全评估。因此构建特异性检测芯片检测方法不能识别不同的转基因品系，检测结果也很容易出现假阳性，也不能判断该转基因品系是否经过了安全评估。4、转化体特异性检测方法转化体特异性检测芯片的基础是转基因构建体在基因组DNA序列上的整合位点具有高度特异性，即使是相同的载体多次转化，整合的位置和整合位点特征也是不可能重复的。因此根据不可重复的整合位点特征序列，开发出了转化体特异性检测芯片。与前三种方法相比，转化体特异性检测具有最高的特异性，最适合做转基因产品的定性和定量检测。 转化事件特异性检测是转基因作物及其产品检测的发展趋势，必将在转基因检测中发挥重要的作用。经过对现有的专利检索和其他文献的检索，尚未发现任何关于转基因大豆 BPS-CV127-9外源插入旁侧序列和利用此序列建立转化体特异性定性、定量PCR检测的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的在于克服现有技术在检测转基因大豆 BPS-CV127-9中存在的不足，提供一种转基因大豆BPS-CV127-9外源插入载体旁侧序列基因，及其应用。本发明是通过以下技术方案实现的转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因，其序列如序列表中I 所示，总长544bp (顺序5’ 3，)，为aaagttgcatccaacattctctttaattcagtacaagagctccttcgccgtttagtgtat60
aggaaagcgcaaactgatgtttggaagcttgaaacggcaatCBaaatctttat120
attaaagctgaacaaaaggggccctccttatttatccccttagtttttattttcatttct180
ggggcaaactagtctcgtaatatattagaggttaattaaatttatattcc240
cccaattttcatccttaaacgaacctgctgBBBCCCtBBtttcgattacc300
aattccgatctaaaaagaagtcatggaagccattgattccgcaatcgatcctctcagaga360
tttcgctaagagcagtgttcgtctcgtccagcgctgtcacaaacccgatcgcaagggtaa420
cgccttttcttcatttccgatttttgatctgtagattagggttttctgaa480
attttgatat catttgtaattgaattggttatcagaattcacgaaagtagctgtgcgtac540 544 。
ggcg所述转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因的提取方法，步骤为(I)提取转基因大豆BPS-CV127-9基因组DNA:采用4种限制性内切酶Dral、 EcoRV、PvuII、StuI充分酶切，对酶切产物进行纯化；(2)引物设计利用clontech GenomeWalker试剂盒提供的接头引物APl和AP2, 其序列分别为APl :5’ -GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ ；
AP2 :5’ -ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’ ；另外，参照BPS-CV127-9插入载体结构序列设计引物序列如下ATl :5’ -CCAACGATGATGTTGTTGATTGGGATG-3’ ；AT2 :5， -AACGAATCCCATCACCACAAATCCAAT-3，；(3)以转基因大豆BPS-CV127-9基因组酶切产物为模板进行两轮PCR扩增，引物对APl和ATl用于第一轮PCR反应，扩增体系20iiL，PCR程序为94°C 25s，72°C 3min，6个循环；94°C 25s，64°C 30s, 36个循环；64°C延伸7min，I个循环；引物对AP2和AT2用于第二轮PCR，在第二轮PCR中用I y L第一轮扩增产物的50倍稀释液作为模板，PCR扩增体系和反应程序与第一轮PCR相同；第二轮PCR产物即为转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因，将扩增出的清晰条带进行切割、纯化，克隆到TA载体上测序，测序所得序列为转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因。所述的转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因可以用于特异性定性检测大豆及相关产品是否含有BPS-CV127-9转化事件，具体应用时，步骤如下(I)首先，根据转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因的序列设计引物，引物序列如下CV127-F:5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-R:5，-AGGGTTTCAGCAGGTTCGTT-3J ；(2)提取待检测样品的基因组DNA，并以此为模板，利用CV127-F/CV127-R引物组合进行PCR扩增；(3)上述PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物； 若存在扩增产物，则待检测样品含有BPS-CV127-9转化事件；若不存在扩增产物，则待检测样品不含有BPS-CV127-9转化事件。所述步骤(2)中的PCR 程序为95°C 5min 预变性；94°C 30s，56°C 30s, 72°C 30s， 35个循环；72°C延伸7min。所述的转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因可以用于定量检测大豆及相关产品是否含有BPS-CV127-9转化事件及其含量，具体应用时，步骤如下(I)建立BPS-CV127-9转化体特异性引物的定量PCR标准曲线和lectin基因的定量PCR标准曲线①提取转基因大豆BPS-CV127-9基因组DNA，并用紫外分光光度计测定其OD值，计算出来浓度，计算出相应的拷贝数；②对基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入BPS-CV127-9转化事件的特异性引物和荧光标记探针，以及lectin基因的引物及探针，并进行扩增；③扩增后，测定各稀释液的中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值遇拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制BPS-CV127-9转化事件的定量PCR标准曲线和lectin基因的定量 PCR标准曲线；(2)提取纯化待检测样品基因组DNA，然后向基因组DNA提取液中分别加入 BPS-CV127-9的特异性引物和荧光标记探针，以及lectin基因的引物和探针，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的BPS-CV127-9 基因的定量PCR标准曲线和Iectin基因的定量PCR标准曲线，计算出相对应的拷贝数，则转基因大豆BPS-CV127-9基因拷贝数与大豆内标准基因lectin基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因大豆BPS-CV127-9的百分含量。所述步骤(2)②中，BPS-CV127-9基因的特异性引物和荧光标记探针是根据转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因序列设计的；lectin基因的特异性引物和荧光标记探针是根据大豆内标准基因lectin基因序列设计的，具体如下CV127-1F:5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-1R:5， -GCAGGTTCGTTTAAGGATGAAAA-3，；CV127-P :5’ -FAM-TATTCCTCAAATAAAACCC-MGB-3’ ；Lectin-IF :5’ -GGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3’ ；Lectin-IR :5，-TCCACCCCCATCCACATTT-3，；Lectin-P : 5，-FAM-ACAAAGAAACCGGTAGCG-MGB-3，。所述步骤⑵②中，扩增的参数如下扩增反应体积为20ii L，2XPremix Ex Taq 10 u L, forward primer(10 u moI L-l)Iu L, reverse primer(10 u mol L-l)Iu L, TaqMan-MGB Probe (10 U mo I L~l) 0. 5 U L, 50 X ROX Reference Dye 0. 4 U L, DNA 模板 I U L， ddH20 6. IuL ;扩增反应条件:95°C预变性30S ;95°C变性5S，60°C退火/延伸30S ;共计40 个循环。与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下I.本发明首次测序公布了转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体序旁侧序列。2.利用本发明发现的序列特征，建立了转基因大豆BPS-CV127-9转化体特异性定性、定量PCR检测方法，该方法灵敏，准确，简单，可靠，具有广阔的市场前景。
图I为转基因大豆BPS-CV127-9转化体定性PCR扩增结果电泳示意图其中M MarkDL2000 ；1 BPS-CV127-9 ；2 =Conquista ;3 :转基因大豆 GTS40-3-2 ；4 Mon87701 ；5 A5547-127 ；6 A5547 ；7 :转基因大豆305423 ；8 :转基因玉米Mon810 ；9 :非转基因玉米郑单 958 ；10 :转基因棉花M0N531 ；11 :非转基因大豆1138-2 ；12 :空白对照。图2为实施例2中内标准(lectin基因)定量PCR标准曲线。图3为实施例3中转基因大豆BPS-CV127-9转化体定量PCR标准曲线。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例I转基因大豆BPS-CV127-9转化体外源插入序列的PCR扩增提取转基因大豆BPS-CV127-9基因组DNA :采用4种限制性内切酶Dral、EcoRV、 PvuII、StuI充分酶切，对酶切产物进行纯化。合成引物序列如下ATl :5’ -CCAACGATGATGTTGTTGATTGGGATG-3’ ；AT2 :5， -AACGAATCCCATCACCACAAATCCAAT-3，。根据clontech GenomeWalker试剂盒提供的方法，利用接头引物APl和AP2,和BPS-CV127-9插入载体结构序列设计引物进行实验。以转基因大豆BPS-CV127-9基因组酶切产物为模板进行两轮PCR扩增，引物对APl 和ATl用于第一轮PCR反应，扩增体系20 iiL。PCR程序为94°C 25s，72°C 3min，6个循环； 94°C 25s, 64°C 30s，36个循环；64°C延伸7min，I个循环。引物对AP2和AT2用于第二轮 PCR,在第二轮PCR中用I y L第一轮扩增产物的50倍稀释液作为模板，PCR扩增体系和反应程序与第一轮PCR相同；用琼脂糖凝胶电泳检测第二轮PCR产物，将扩增出的清晰条带进行切割、纯化，克隆到TA载体上测序。利用NCBI提供的blast分析工具，分析序列，判断基因组和载体结合位点。结果如下以引物对APl和ATl用于第一轮PCR反应，引物对AP2和AT2用于第二轮PCR后，成功扩增获得544bp产物。对PCR产物测序，经过blast分析，Ibp到242bp为大豆基因组序列，243bp到544bp为拟南芥序列。由来源于大豆基因组的序列和来源于拟南芥的序列共同组成转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因，其序列如序列表中I所示。实施例2转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因的应用I)利用本发明中所提供序列设计转基因大豆BPS-CV127-9转化事件转化体特异性定性PCR检测方法引物由上海博尚生物公司合成，合成的引物序列如下CV127-F:5， -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3，；CV127-R:5，-AGGGTTTCAGCAGGTTCGTT-3J ；分别取BPS-CV127-9、Conquista、转基因大豆 GTS40-3-2、Mon87701、A5547-127、 A5547、转基因大豆305423、转基因玉米Mon810、非转基因玉米郑单958、转基因棉花 M0N531、非转基因大豆1138-2基因组为模板，分别利用CV127-F/CV127-R引物组进行PCR 扩增。PCR 程序为95°C 5min 预变性；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s，35 个循环;72°C延伸 7min。上述PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物。结果利用所设计的引物以植物基因组为模板进行PCR扩增，结果如图I所示，由图I可见，只有BPS-CV127-9基因组成功的扩增出特异性的147bp产物，而其他转基因和非转基因样品作为模板都没有观察到扩增产物。这表明，该引物有良好的特异性，适合用于转化体特异性的检测。2)利用本发明中所提供序列设计转基因大豆BPS-CV127-9转化事件转化体特异性定量PCR检测方法提取转基因大豆BPS-CV127-9基因组DNA，并用紫外分光光度计测定其OD值，计算出来浓度，计算出相应的拷贝数；对基因组DNA进行梯度稀释，梯度稀释得到I. OX 105、 I. OXlO4U. OXlO3U. OXlO2U. OXlO1 拷贝 u I71 做为实验的标准品。通过Primer Express软件设计适合BPS-CV127-9和lectin基因的定量PCR检测用的特异性引物和TaqMan探针。BPS-CV127-9引物和探针序列如下CV127-1F:5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-1R:5， -GCAGGTTCGTTTAAGGATGAAAA-3，；CV127-P :5’ -FAM-TATTCCTCAAATAAAACCC-MGB-3’ ；
8
lectin基因引物和探针序列如下Lectin-IF :5’ -GGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3’ ；Lectin-IR :5，-TCCACCCCCATCCACATTT-3，；Lectin-P : 5，-FAM-ACAAAGAAACCGGTAGCG-MGB-3，。反应体系(20U L) 2 X Premix Ex Taq IOuL, forward primer (10 U mo I L-l)Iu L, reverse primer(10 u moI L-l) Iu L, TaqMan-MGB Probe(10 u moI L-l)0. 5 u L, 50 X ROX Reference Dye 0. 4u L, DNA 模板 I y L, ddH20 6. I u L0 扩增反应条件95°C预变性30S ;95°C变性5S，60°C退火/延伸30S ;共计40个循环。每个样品重复3次，同时设置空白和阴性对照。结果通过不同拷贝数的基因组DNA为标准品进行实时荧光定量PCR扩增，计算机自动生成标准曲线，纵坐标为Ct，横坐标为起始拷贝数的自然对数。根据标准曲线所得的线性计算公式，通过对不同转基因含量的转基因大豆BPS-CV127-9标准品(0.05%、0. 1%, 0.5%,1% )、阳性样品、阴性样品及空白对照的测定，将样品的Ct值带入公式，即可得到待测样品中BPS-CV127-9的百分含量。对大豆内标准基因lectin和转基因大豆BPS_CV127_9的转化体特异性引物对同一组不同浓度的植物基因组DNA和不同百分含量的转基因大豆DNA进行实时荧光定量PCR 扩增，分别得到PCR扩增曲线，并由系统自动生成标准曲线。大豆内标准基因lectin的标准曲线如图2所示，该曲线斜率为-3. 269，相关系数R2 = 0. 999。基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异性引物的标准曲线如图3所示，该曲线斜率为-39. 097，相关系数R2 = 0. 998。 因此，只要获得未知样品的Ct值，既可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。然后利用转基因大豆的拷贝数与大豆内标准基因的拷贝数之比，就可以得到该样品中转基因大豆 BPS-CV127-9的百分含量。以上结果可以看出，本发明为转基因大豆BPS-CV127-9的定向和定量PCR检测提供了简单、可靠的测定方法，可以用于转基因大豆BPS-CV127-9的检测。本发明为转基因标识提供了一种有用的参考，为转基因产品的控制提供了必要的手段。
权利要求
1.转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因，其特征在于其序列如序列表中I所示，为aaagttgcatccaacattctctttaattcagtacaagagctccttcgccgtttagtgtat60aggaaagcgcaaactgatgtttggaagcttgaaacggcaaCBaaatctttat120attaaagctgaacaaaaggggccctccttatttatccccttagtttttattttcatttct180ttct&&t&&&ggggcaaactagtctcgtaatatattagaggttaattaaatttatattcc240tCBBBtBBBBcccaattttcatccttaaacgaacctgctgBBBCCCttcgattacc300aattccgatctaaaaagaagtcatggaagccattgattccgcaatcgatcctctcagaga360tttcgctaagagcagtgttcgtctcgtccagcgctgtcacaaacccgatcgcaagggtaa420cgccttttcttcatttccgatttttgatctgtagattagggttttctgaa480attttgatatcatttgtaattgaattggttatcagaattcacgaaagtagctgtgcgtac540ggcg5440
2.权利要求I所述的转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因的提取方法，其特征在于步骤为(1)提取转基因大豆BPS-CV127-9基因组DNA:采用4种限制性内切酶DraI、EcoRV、 PvuII, StuI充分酶切，对酶切产物进行纯化；(2)引物设计利用clontechGenomeWalker试剂盒提供的接头引物APl和AP2,其序列分别为APl :5’ -GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ ；AP2 :5’ -ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’ ；另外，参照BPS-CV127-9插入载体结构序列设计引物序列如下ATl :5’ -CCAACGATGATGTTGTTGATTGGGATG-3’ ；AT2 :5， -AACGAATCCCATCACCACAAATCCAAT-3，；(3)以转基因大豆BPS-CV127-9基因组酶切产物为模板进行两轮PCR扩增，引物对APl 和ATl用于第一轮PCR反应，扩增体系20iiL，PCR程序为94°C 25s，72°C 3min，6个循环； 94°C25s，64°C 30s，36个循环;64°C延伸7min，l个循环;引物对AP2和AT2用于第二轮PCR， 在第二轮PCR中用I ii L第一轮扩增产物的50倍稀释液作为模板，PCR扩增体系和反应程序与第一轮PCR相同；第二轮PCR产物即为转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因。
3.权利要求I所述的转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因在特异性定性检测大豆及相关产品是否含有BPS-CV127-9转化事件中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于定性检测时，方法如下(1)首先，根据转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因的序列设计引物，引物序列如下CV127-F:5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-R:5’ -AGGGTTTCAGCAGGTTCGTT-3’ ；(2)提取待检测样品的基因组DNA，并以此为模板，利用CV127-F/CV127-R引物组合进行PCR扩增；(3)上述PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；若存在扩增产物，则待检测样品含有BPS-CV127-9转化事件；若不存在扩增产物，则待检测样品不含有BPS-CV127-9转化事件。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中的PCR程序为95°C5min 预变性；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s，35 个循环;72°C延伸 7min。
6.权利要求I所述的转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因在定量检测大豆及相关产品是否含有BPS-CV127-9转化事件中的应用。
7.根据权利6要求所述的应用，其特征在于定量检测时，方法如下(1)建立BPS-CV127-9转化体特异性引物的定量PCR标准曲线和lectin基因的定量 PCR标准曲线①提取转基因大豆BPS-CV127-9基因组DNA，并用紫外分光光度计测定其OD值，计算出来浓度，计算出相应的拷贝数；②对基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入BPS-CV127-9转化事件的特异性引物和荧光标记探针，以及lectin基因的引物及探针，并进行扩增；③扩增后，测定各稀释液的中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值遇拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制BPS-CV127-9转化事件的定量PCR标准曲线和lectin基因的定量PCR 标准曲线；(2)提取纯化待检测样品基因组DNA，然后向基因组DNA提取液中分别加入 BPS-CV127-9的特异性引物和荧光标记探针，以及lectin基因的引物和探针，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的BPS-CV127-9 基因的定量PCR标准曲线和lectin基因的定量PCR标准曲线，计算出相对应的拷贝数，则转基因大豆BPS-CV127-9基因拷贝数与大豆内标准基因lectin基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因大豆BPS-CV127-9的百分含量。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述步骤(2)②中，BPS-CV127-9基因的特异性引物和荧光标记探针是根据转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因序列设计的；lectin基因的特异性引物和荧光标记探针是根据大豆内标准基因 lectin基因序列设计的,具体如下CV127-1F:5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-1R:5’ -GCAGGTTCGTTTAAGGATGAAAA-3’ ；CV127-P :5’ -FAM-TATTCCTCAAATAAAACCC-MGB-3’ ；Lectin-IF :5，-GGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3，；Lectin-IR :5’ -TCCACCCCCATCCACATTT-3’ ；Lectin-P :5，-FAM-ACAAAGAAACCGGTAGCG-MGB-3，。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述步骤(2)②中，扩增的参数如下 扩增反应体积为 20 u L, 2 XPremix Ex Taq 10 u L, forward primer (10 u mo I L-l) I u L, reverse primer(10 u moI L-l)Iu L, TaqMan-MGB Probe (10 u moI L-l)0.5 u L,50 X ROX Reference Dye 0. 4u L, DNA 模板 I y L, ddH20 6. I u L ;扩增反应条件95°C预变性 30S ； 95°C变性5S，60°C退火/延伸30S ;共计40个循环。
全文摘要
本发明公开了转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因，其序列如序列表中1所示。本发明的转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体旁侧基因可以用于特异性定性检测大豆及相关产品是否含有BPS-CV127-9转化事件，以及定量检测大豆及相关产品是否含有BPS-CV127-9转化事件。本发明首次测序公布了转基因大豆BPS-CV127-9转化事件外源插入载体序旁侧序列，建立了转基因大豆BPS-CV127-9转化体特异性定性、定量PCR检测方法，该方法灵敏，准确，简单，可靠，具有广阔的市场前景。
文档编号C12N15/11GK102586242SQ20121005353
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者孙红炜, 李凡, 李宁, 杨淑珂, 路兴波 申请人:山东省农业科学院植物保护研究所