专利名称：转基因大豆bps-cv127-9检测用标准质粒分子及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程技术领域的质粒分子，具体来说，涉及一种转基因大豆 BPS-CV127-9检测用标准质粒分子及其构建方法与应用。
背景技术：
在过去的几十年里，随着分子生物学各领域的不断发展，植物基因的分离、基因工程载体的构建、细胞的基因转化、转化细胞的组织培养、植株再生及外源基因表达的检测等各项技术日趋成熟和完善，有关植物基因工程的研究日新月异，许多以前根本不可能的基因转化工作在越来越多的植物上获得成功。各种转基因作物新品种的不断的研究出来。近十几年来，我国农业转基因生物技术得到了飞速的发展，我国转基因抗虫棉花、延熟番茄、 抗病辣椒、抗虫杨树和抗病番木瓜，转植酸玉米等已先后获得安全证书，进入了商业化生产。转基因大豆BPS-CV127-9是巴斯夫植物科学公司开发的耐咪唑啉酮类农业除草剂的大豆作物，该品种含有耐除草剂拟南芥AHASL (csrl-2)编码序列和拟南芥AHASL终止子。随着转基因作物的大量种植及应用，转基因产品开始大量进入我们的生活。转基因产品潜在的食品安全、生态安全问题日益引起人们的关注，各国纷纷制定相应的法律法规对转基因产品进行监管。许多国家以立法或者其他形式要求对转基因产品进行标记。除美国、加拿大、阿根廷和中国香港特区实行自愿标识制度外，国际上的大多数国家如欧盟各国、日本、韩国等国均制定了一系列强制性的标识标准。我国分别于2001年、2002年颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》及《农业转基因生物标识管理办法》，并启动了农业转基因生物的监督监管机制。各国转基因标识制度的相继建立和公众对转基因产品关注度的提高，对转基因检测技术的灵敏度和准确性提出了严格的要求，因此，各种转基因检测技术也就成了研究热点。常用的转基因检测方法有聚合酶链式反应(PCR)法，外源蛋白检测法，基因芯片检测技术，分子杂交方法等，目前最主要使用的方法是PCR法。根据不同转基因植物及其检测目的的不同，鉴定转基因植物主要包括检测筛选基因、目的基因、不同基因间的交联结构基因、和转入基因与受体植物间的转化体特异结构基因。转化体特异性检测的基础是转基因构建体在基因组DNA序列上的整合位点具有高度特异性，即使是相同的载体多次转化， 整合的位置和整合位点特征也是不可能重复的。因此根据不可重复的整合位点特征序列， 开发出了转化体特异性检测方法。与前三种方法相比，转化体特异性检测具有最高的特异性，最适合做转基因产品的定性和定量检测。转化事件特异性检测是转基因作物及其产品检测的发展趋势，必将在转基因检测中发挥重要的作用。在转基因定性、定量PCR检测过程中，阳性标准品是必须的，因此阳性标准品的配置要求非常严格，必须经过多个实验室的实验验证方可应用于转基因定量PCR检测。以转基因植物的种子等制作的标准物质，制作过程复杂，不易保存，且每个检测都要有相应的标准物质，极大的阻碍了转基因检测的发展。标准分子的概念由日本科学家Kuribara等于2002年提出，它是指一种含有转基因检测目的外源基因和内标准基因的特异性片段的线性化重组质粒分子。经验证质粒标准分子在GMO鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物。 质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，DNA易于扩增，所以可提供无限稳定量的标准物质，并且纯度较高；且操作容易，稳定性高，同一个标准分子可以同时包含多个外源目的基因，经济又高效。甚至有学者将质粒标准分子称为“金标准物质”。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了转基因大豆BPS-CV127-9品系的特异性检测用标准质粒分子及其构建方法，使其可以代替转基因大豆BPS-CV127-9的阳性标准物质用于转基因大豆BPS-CV127-9特异性的定性、定量PCR检测。本发明的设计思路为根据转基因大豆BPS-CV127-9的品系特异性序列和内标准基因序列，利用重叠PCR反应的原理设计特异PCR引物，经过PCR扩增获得转基因大豆 BPS-CV127-9的转化体特异序列和内标准基因lectin —段序列的重组DNA片段。利用分子克隆技术重组DNA片段到克隆载体pGM-T载体中，获得新的质粒分子pGMT-CV127。本发明构建的标准质粒分子可以代替转基因大豆BPS-CV127-9原有的阳性标准物质，用于定性和定量PCR检测，彻底解决了转基因大豆BPS-CV127-9检测中标准物质缺乏的难题。本发明是通过以下技术方案实现的转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子，其空白载体为质粒载体pGM_T，包含有转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异序列和大豆内标准基因lectin的特异性片段。所述转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异序列为 GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGTTTTTATTTTCATTTCTTTCTAATAAAGGGGCAAACTAGTCTCGT AATATATTAGAGGTTAATTAAATTTATATTCCTCAAATAAAACCCAATTTTCATCCTTAAACGAACCTGCTGAAAC CCT ;如序列表中I所示。所述大豆内标准基因lectin的特异性片段的序列为GCCCTCTACTCCACCCCCATCCACATTTGGGACAAAGAAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTCGCCGCTTCC TTCAACTTCACCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAGGCTTGCAGATGGGC ;如序列表中 2 所示。所述转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子的构建方法为首先，设计特异性PCR引物，从转基因大豆BPS-CV127-9基因组DNA中扩增获得转基因大豆BPS-CV127-9 的转化体特异序列和大豆内标准基因lectin —段序列的重组DNA片段，然后，利用分子克隆技术重组DNA片段到克隆载体pGM-T载体中，获得新的质粒分子pGMT-CV127。具体构建步骤如下①利用GenBank等数据库进行生物信息学分析，获得大豆内标准基因lectin、转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异性序列。所述的大豆内标准基因lectin，指的是大豆凝集素基因，其在大豆基因组中高度保守，具有种间特异性、种内非特异性和单拷贝数的特点。所述的转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异性序列，指的是转基因大豆 BPS-CV127-9外源插入载体与大豆基因组邻接区的DNA序列。②设计PCR特异性引物。所述的PCR特异性引物，指的是长度为28±10nt的寡核苷酸链，其与大豆lectin基因或者转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异性序列完全相同或者相互补。③特异性的扩增大豆内标准基因lectin和转基因大豆BPS_CV127_9的转化体特异性序列。所述的特异性的扩增，指的是利用设计的特异性的引物进行PCR扩增大豆lectin 基因和转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异性序列。④大豆lectin基因和转基因大豆BPS_CV127_9的转化体特异性序列的拼接。所述的拼接，指的是利用重叠PCR技术将大豆lectin基因和转基因大豆 BPS-CV127-9的转化体特异性序列两个独立的DNA片段融合成一个重组的新DNA片段。⑤含有新的重组DNA片段的质粒分子克隆。所述的分子克隆，指的是将上述得到的重组特异性DNA片段连接到质粒载体 pGM-T上，或得转基因标准质粒分子pGMT-CV127。⑥标准质粒分子pGMT-CV127的定性和定量PCR检测方法验证所述的定性PCR检测方法验证，是指用于标准质粒分子PGMT-CV127构建的品系特异性片段只能在转基因大豆BPS-CV127-9基因组DNA中扩增获得，而不能在其他大豆品种和作物基因组中扩增得到。所述的定量PCR检测方法验证,是指检测标准质粒分子pGMT_CV127在进行定量 PCR分析是的特异性、灵敏度、重复性、和重演性等特性，以鉴定该标准分子替代转基因大豆 BPS-CV127-9阳性标准物质的能力，以及实际用于定量PCR检测转基因大豆BPS-CV127-9的测定有效性。上述构建方法中，所述PCR特异性引物为两对，序列如下S0E-CV127-1 GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT ；S0E-CV127-2 GGATGGGGGTGGAGTAGAGGGCAGGGTTTCAGCAGGTTCGTT ；SOE-lec-1 AACGAACCTGCTGAAACCCTGCCCTCTACTCCACCCCCATCC ；S0E-lec-2 :GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG。本发明的转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子，可以用于转基因大豆 BPS-CV127-9的定性、定量检测。定性检测时，检测方法为首先，提取待检测样品的基因组DNA，以此为模板，使用特异性引物进行PCR扩增，以转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子作为阳性对照； 然后，待检测样品的PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物，若存在扩增产物，则待检测样品中含有BPS-CV127-9转化事件；若不存在扩增产物，则待检测样品中不含有BPS-CV127-9转化事件。定性检测时，所述特异性引物序列如下CV127-F:5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-R:5， -AGGGTTTCAGCAGGTTCGTT-3，；Iectin-F :5' -GCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3'；Iectin-R :5' -GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3'。定量检测时，检测方法为首先，以转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子为标准品，使用特异性引物和TaqMan探针进行实时荧光定量PCR扩增，以Ct为纵坐标， 以起始拷贝数的自然对数为横坐标，制作大豆内标准基因lectin标准曲线和转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异性引物标准曲线；然后，提取待检测样品的基因组DNA，以此为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，将其Ct值代入标准曲线，计算出样品的起始拷贝数，然后利用转基因大豆的拷贝数与大豆内标准基因的拷贝数之比，即可得到样品中转基因大豆 BPS-CV127-9的百分含量。定量检测时，所述特异性引物和TaqMan探针的序列如下BPS-CV127-9引物和探针序列如下CV127-1F:5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-1R:5， -GCAGGTTCGTTTAAGGATGAAAA-3，；CV127-P :5’ -FAM-TATTCCTCAAATAAAACCC-MGB-3’ ；lectin基因引物和探针序列如下Lectin-IF :5’ -GGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3’ ；Lectin-IR :5，-TCCACCCCCATCCACATTT-3，； Lectin-P : 5，-FAM-ACAAAGAAACCGGTAGCG-MGB-3，。本发明利用重叠PCR和分子亚克隆的方法首次构建了含有大豆lectin基因和转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异性序列的标准质粒分子pGMT-CV127。本发明中明确提出此标准质粒分子可以代替转基因大豆BPS-CV127-9的阳性标准物质用于该品系特异性定性、定量PCR检测，很好的解决了该品系检测过程中阳性标准物质缺乏的问题。此标准质粒分子PGMT-CV127对实际样品分析的结果比较准确。因此，本发明中构建的标准质粒分子完全适合用于对转基因大豆BPS-CV127-9样品及其加工产品的定性定量检测。
图I为本发明构建的标准质粒分子pGMT-CV127的示意图谱。图2为PCR扩增BPS-CV127-9侧翼序列的电泳图，其中，M =Mark DL2000 ；1 :标准质粒分子 PGMT-CV127 ；2 =Conquista ；3 :转基因大豆 GTS40-3-2 ；4 Mon87701 ；5 :A5547_127 ； 6 A5547 ；7 :转基因大豆305423 ；8 :转基因玉米Mon810 ；9 :非转基因玉米郑单958 ；10 :转基因棉花M0N531 ；11 :非转基因大豆1138-2 ；12 :空白对照。图3为lectin基因标准曲线。图4为BPS-CV127-9特异性序列标准曲线。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明；本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件操作。实施例I :标准分子的构建一、实验试剂DNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，ex Taq DNA聚合酶及 dNTPs、DNA分子量标记(IOObp DNA marker)购自宝生物工程(大连)有限公司，X_gal、氨苄青霉素(Amp)、IPTG、pGM-T克隆载体试剂盒、LB培养基购自北京天根生化公司。由上海博尚公司合成引物,测序。
二、实验仪器恒温培养箱、涡旋震荡器、紫外分光光度计(美国Beckman公司)、BI0_RAD PCR扩增仪、EPS 301凝胶电泳系统、⑶S800凝胶成像系统、Beckman台式冷冻离心机、ESCO生物
安全柜等。三、实验方法和过程I、利用GenBank等数据库进行生物信息学分析，获得大豆内标准基因lectin基因、转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异性序列。2、构建标准质粒分子pGMT-CV127的PCR引物设计根据大豆内标准基因lectin基因和转基因大豆BPS_CV127_9的转化体特异性序列，使用Primer5. 0设计两对弓I物，一对弓I物用于扩增转基因大豆BPS-CV127-9外源插入载体与大豆基因组邻接区特异性序列，另一对引物用于扩增大豆内标准基因lectin基因的序列。引物序列见表I。表I.构建标准质粒分子pGMT-CV127的PCR引物
权利要求
1.转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子，其特征在于其空白载体为质粒载体pGM-T，包含有转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异序列和大豆内标准基因lectin的特异性片段。
2.权利要求I所述的转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子的构建方法，其特征在于首先，设计特异性PCR引物，从转基因大豆BPS-CV127-9基因组DNA中扩增获得转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异序列和大豆内标准基因lectin —段序列的重组DNA 片段，然后，利用分子克隆技术重组DNA片段到克隆载体pGM-T载体中，获得新的质粒分子 PGMT-CV127。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于步骤如下①设计PCR特异性引物；②特异性的扩增大豆内标准基因lectin和转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异性序列；③大豆lectin基因和转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异性序列的拼接；④含有新的重组DNA片段的质粒分子克隆，得到标准质粒分子BPS-CV127-9。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于所述PCR特异性引物为两对，序列如下S0E-CV127-1 GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT ；S0E-CV127-2 GGATGGGGGTGGAGTAGAGGGCAGGGTTTCAGCAGGTTCGTT ；SOE-lec-1 AACGAACCTGCTGAAACCCTGCCCTCTACTCCACCCCCATCC ；S0E-lec-2 :GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG。
5.权利要求I所述的转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子在定性检测转基因大豆BPS-CV127-9中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于检测方法为首先，提取待检测样品的基因组DNA，以此为模板，使用特异性弓I物进行PCR扩增，以转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子作为阳性对照；然后，待检测样品的PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物，若存在扩增产物，则待检测样品中含有BPS-CV127-9转化事件；若不存在扩增产物，则待检测样品中不含有BPS-CV127-9转化事件。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述特异性引物序列如下CV127-F :5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-R:5’ -AGGGTTTCAGCAGGTTCGTT-3’ ；Iectin-F :5' -GCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3'；Iectin-R :5' -GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3'。
8.权利要求I所述的转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子在定量检测转基因大豆BPS-CV127-9中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于检测方法为首先，以转基因大豆 BPS-CV127-9检测用标准质粒分子为标准品，使用特异性引物和TaqMan探针进行实时荧光定量PCR扩增，以Ct为纵坐标，以起始拷贝数的自然对数为横坐标，制作大豆内标准基因lectin标准曲线和转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异性引物标准曲线；然后，提取待检测样品的基因组DNA，以此为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，将其Ct值代入标准曲线，计算出样品的起始拷贝数，然后利用转基因大豆的拷贝数与大豆内标准基因的拷贝数之比，即可得到样品中转基因大豆BPS-CV127-9的百分含量。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述特异性引物和TaqMan探针的序列如下BPS-CV127-9引物和探针序列如下CV127-1F:5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-1R:5’ -GCAGGTTCGTTTAAGGATGAAAA-3’ ；CV127-P :5’ -FAM-TATTCCTCAAATAAAACCC-MGB-3’ ； lectin基因引物和探针序列如下Lectin-IF :5，-GGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3，；Lectin-IR :5’ -TCCACCCCCATCCACATTT-3’ ；Lectin-P :5，-FAM-ACAAAGAAACCGGTAGCG-MGB—3，。
全文摘要
本发明公开了转基因大豆BPS-CV127-9检测用标准质粒分子，其载体为质粒载体pGM-T，包含有转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异序列和大豆内标准基因lectin的特异性片段。其构建方法为首先，设计特异性PCR引物，从转基因大豆BPS-CV127-9基因组DNA中扩增获得转基因大豆BPS-CV127-9的转化体特异序列和大豆内标准基因lectin一段序列的重组DNA片段，然后，利用分子克隆技术重组DNA片段到克隆载体pGM-T载体中，获得新的质粒分子pGMT-CV127。本发明构建的标准质粒分子可以代替转基因大豆BPS-CV127-9原有的阳性标准物质，用于定性和定量PCR检测，彻底解决了转基因大豆BPS-CV127-9检测中标准物质缺乏的难题。
文档编号C12N15/66GK102586306SQ201210053519
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者孙红炜, 李凡, 李宁, 杨淑珂, 路兴波 申请人:山东省农业科学院植物保护研究所