专利名称：一种高产肝素酶Ⅰ的原核表达载体的构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，特别涉及一种高产肝素酶I的原核表达载体的构建方法。
背景技术：
肝素酶(heparanase, Hpa)是近年来研究较多的ー类D-糖苷内切酶,它不仅存在 于正常的组织中，如胎盘和淋巴器官，其对胚胎的形成，新血管的生成，神经系统的发育，炎症反应等都发挥着正常的生理功能；同时也存在于多种恶性肿瘤细胞的表面，能够促进细胞的侵袭和转移，诱导肿瘤血管生成，从而降低肿瘤患者的生存率。目前，研究的重点在于如何抑制肿瘤细胞表面表达的肝素酶活性，从而有效治疗肿瘤。肝素酶的用途极其广泛，其在低分子量肝素及肝素寡糖的制备，肝素及肝素类分子的结构測定，控制肿瘤细胞的生长和转移以及清除血液中残存肝素等方面都具有重要作用。自从Payza等在肝素黄杆菌中发现肝素酶以来，人们在许多微生物中都发现了肝素酶的存在，是近期研究的热点。肝素黄杆菌来源的肝素酶可以分为肝素酶I、II和III三类，其酶基因的克隆表达、蛋白的纯化和性质研究、以及酶蛋白的改造等相关研究已经有所报道，在作用机制和生物学活性等方面也都有了一定的认识。但目前只有肝素黄杆菌和环状芽孢杆菌的肝素酶基因得到了克隆和表达，而商品化的肝素酶都来源于肝素黄杆菌。近期研究发现肝素作为长期以来用于治疗和预防血栓的药物对于人体具有一定的副作用，如影响血小板的稳定，从而导致手术后大出血等。而分子量在4000-8000的低分子量肝素(LMWH)则能够在不产生显著副作用的情况下有效地治疗血栓。截至目前为止，低分子量肝素已经逐步取代肝素成为了首选的治疗药物。低分子量肝素的生产可以分为化学降解法和酶解法。酶解法相对于化学降解法而言具有其独特的优点，例如作用条件温和，酶的专ー性高，环境相对友好等，是较理想的エ业生产肝素酶的方法。但是利用酶解法生产低分子量肝素的缺点在于(I) 一方面肝素酶的来源有限，其野生菌产量很低并且需要价格昂贵的肝素进行诱导表达，从而导致生产成本过高。另ー方面也是由于肝素酶的重组表达极易形成无活性的包涵体，并且不容易复性。(2)微生物来源的肝素酶是ー种裂解酶，在裂解反应过程所产生的低分子量肝素的非还原末端的不饱和键严重影响肝素酶的药效，必须通过臭氧氧化法去除。我国是肝素原料的出ロ大国，但一直未能对低分子量肝素生产技术进行系统的研究。目前低分子量肝素主要来自合资企业生产或者由国外进ロ，因此，利用酶解法生产低分子量肝素的研究应用前景极为广泛。而肝素酶作为低分子量肝素酶法生产的原材料，其高效生产技术的研究则是备受关注的课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产肝素酶I的原核表达载体的构建方法。一种高产肝素酶I的原核表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤
(a)以Fl和Rl为引物，Fl :5’ -TAGAATTCCAGCAAAAAAAATCCG _3’
Rl :5’ -GGCAAGCTTGTCTGGCAGTTTCGCTGTA -3’
利用PCR反应扩增得到如SEQ ID NO. I所示的编码肝素酶I的基因序列；
(b)将上述编码肝素酶I的基因序列连接至pET-28a载体上，得重组表达载体pET28a_HpaI ；
(c)将重组表达载体pET28a-Hpa I质粒转入大肠杆菌BL21菌株。进一步地，，步骤a 中，PCR 反应体系为IOXBuffer 5μ I, MgCl2 3μ I,dNTP 1μ I, DNA 1μ I, Taq酶O. 5 μ 1，引物混合物2 μ 1，双蒸水37. 5 μ I ;反应参数为97°C 5min, 97°C 50s,55°C 50s,72°C Imin 共 30 个循环，最后在 72°C延伸 lOmin。
本发明构建了肝素黄杆菌肝素酶I的原核表达载体。通过应用PCR技术合成了肝素酶I基因序列，将该基因序列克隆至载体pET_28a中，得到重组表达载体pET-28a-Hpa I，再通过CaCl2转化大肠杆菌，根据生长情况快速筛选出肝素酶活性较高的阳性克隆转化子Hpa I，该肝素酶目前可以通过大肠杆菌发酵生产，具有良好的应用前景。
图I为本发明的构建流程图。图2是重组蛋白在疋co7i BL21中的表达产物电泳图。其中M 低分子量标准蛋白；条带I :pET-28a空载诱导；条带2 :重组表达载体pET_28a_ Hpa I未诱导；条带3 :重组表达载体pET-28a Hpa I诱导3 h ；条带4 :重组表达载体pET_28a_ Hpa I诱导4 h ；条带5 :重组表达载体pET-28a- Hpa I诱导5 h ；条带6 :重组表达载体pET_28a_ Hpa I诱导6 h ;条带7 :超声裂解后的上清；条带8.:超声裂解后的沉淀。
具体实施例方式实施例I.肝素黄杆菌肝素酶I基因序列的获得 根据肝素酶I的基因序列，设计以下引物
Fl 5’ -TAGAATTCCAGCAAAAAAAATCCG _3’
Rl : 5’ -GGCAAGCTTGTCTGGCAGTTTCGCTGTA -3’
利用PCR反应扩增编码肝素酶I的基因序列，PCR反应体系为(50 μ I) IOXBuffer5μ I, MgCl2 3μ I, dNTP 1μ I, DNA 1μ I, Taq 酶 O. 5 μ 1，引物混合物 2 μ 1，双蒸水37. 5μ I。反应参数为97°C 5min，(97°C 50s，55°C 50s，72°C lmin)共 30 个循环，最后在72°C延伸lOmin，琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，回收产物送上海生工生物工程有限公司测序，所得序列如SEQ ID NO. I所示。实施例2.重组大肠杆菌表达载体的构建
用I和Η η III分别双酶切PCR扩增产物和pET_28a质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，用T4DNA连接酶连接回收的目的条带，得到原核表达载体pET28a-HpaI，用CaCl2法42°C热激90秒将其转化到大肠杆菌BL21。利用Kana抗性筛选单菌落。所选转化克隆经PCR、酶切鉴定和DNA测序测定证明克隆正确后送上海生物工程有限公司测序。具体构建流程见图I。实施例3.重组大肠杆菌表达载体的转化和筛选将鉴定正确的重组表达载体pET28a-Hpa I质粒转入大肠杆菌BL21菌株，加入 O. 5mmol/L的IPTG诱导表达9h，加入磷酸缓冲液重悬细胞，超声波破碎得到肝素粗酶液。利用Azure A法測定肝素酶活性，筛选出表达肝素酶活最高的菌株Hpa I (47)。实施例4.肝素酶在大肠杆菌中的表达
在5 ml含50 mg/L Kan的LB液体培养基中，按I :50接种BL21-pET_28a- Hpa I菌液，37 °C, 220 rpm振荡培养过夜；次日接种培养过夜的菌液至含50 mg/L Kan的新LB液体培养基中，37°C，220 rpm振荡培养至0D600 = O. 5左右；每管分别加入IPTG至终浓度为O. 5mmol/L，28°C诱导表达；分别在诱导3 h、4 h、5 h、6 h后收集菌液，4°C，12000 rpm高速离心收集菌体；加入2 ml O. 025 M Na2HP04-NaH2P04 (pH 6. 8)缓冲液重悬洗涤菌体，4°C，12000 rpm离心20 min,弃上清。重复洗漆菌体一次。加入I ml上述缓冲液重悬菌体。冰浴中超声悬浮细胞(工作6 S，间隔6 S，功率200，次数100次)后，12000 rpm离心10 min,取上清即为粗酶液。SDS-PAGE电泳检测，如图2所示。在44. 3 kDa位置附近出现一条高表达量的特异性条带，分子量大小约为42. 9 kDa，与理论值相符。本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非作为对本发明的限定，只要在本发明的实质范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种高产肝素酶I的原核表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤 (a)以Fl和Rl为引物，Fl :5’ -TAGAATTCCAGCAAAAAAAATCCG _3’Rl :5’ -GGCAAGCTTGTCTGGCAGTTTCGCTGTA -3’ 利用PCR反应扩增得到如SEQ ID NO. I所示的编码肝素酶I的基因序列； (b)将上述编码肝素酶I的基因序列连接至pET-28a载体上，得重组表达载体pET28a_HpaI ； (c)将重组表达载体pET28a-Hpa I质粒转入大肠杆菌BL21菌株。
2.如权利要求I所述的构建方法，其特征在于，步骤a中，PCR反应体系为IOXBuffer 5μ I, MgCl2 3μ I, dNTP I μ I, DNA I μ I, Taq酶 O. 5 μ 1，引物混合物 2 μ 1，双蒸水 37. 5 μ I ;反应参数为97°C 5min, 97°C 50s,55°C 50s,72°C Imin 共 30 个循环，最后在72°C延伸lOmin。
全文摘要
本发明公开了一种高产肝素酶Ⅰ的原核表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤以F1和R1为引物，F15’-TAGAATTCCAGCAAAAAAAATCCG-3’、R15’-GGCAAGCTTGTCTGGCAGTTTCGCTGTA-3’；利用PCR反应扩增得到如SEQIDNO.1所示的编码肝素酶Ⅰ的基因序列；将上述编码肝素酶Ⅰ的基因序列连接至pET-28a载体上，得重组表达载体pET28a-HpaI；将重组表达载体pET28a-HpaⅠ质粒转入大肠杆菌BL21菌株。
文档编号C12N15/70GK102618568SQ201210052690
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者于平 申请人:浙江工商大学