专利名称：用于检测转基因玉米mir162的特异性引物及荧光标记探针及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物及荧光标记探针，及其在基因特异性定性PCR、STOR Green I实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20中的应用，属于分子生物学领域。
背景技术：
将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术(Transgene technology) 0转基因食品有转基因植物，如玉米、西红柿、土豆等，还有转基因动物，如鱼、 牛、羊等。据统计，美国食品和药物管理局确定的转基因品种已有43种。美国是转基因食品最多的国家，60%以上的加工食品含有转基因成分，90%以上的大豆、50%以上的玉米、 小麦是转基因的。由于转基因产品的生态安全和食用安全一直备受争议，相继有40多个国家和地区建立和实施了转基因标识制度。随着这些制度的建立与不断完善，人们对转基因检测技术的准确度和灵敏度提出了严格的要求，各种转基因产品的检测技术也成为了研究执占。根据不同转基因产品的检测目的不同，鉴定转基因产品的主要方式有筛查法、基因特异性检测方法、转化体特异性检测方法和构建特异性检测方法。转基因玉米MIR162是美国先正达公司开发出来的新型抗鳞翅目昆虫品种。申请人经过对现有专利和其他文献的检索，尚未发现任何关于转基因玉米MIR162基因特异性定性PCR、SYBR Green I实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物及荧光标记探针，以及其在基因特异性定性PCR、SYBR Green I实时荧光定量PCR和I1aqMan 探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20中的应用。本发明是通过以下技术方案实现的一种用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物，所述引物由上游引物和下游引物组成，其序列为MIR162GS-F 5' -GGACCAGAGCGAGCAAATCT-3‘；MIR162GS-R 5' -GCAGGGTCTTCATCTTCTTGGT-3‘；如SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2 所示。所述用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物可以用于定性检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20，具体应用时，步骤为(1)提取待检测样品的基因组DNA，并以此为模板，利用特异性引物MIR162GS-F和MIR162GS-R 进行 PCR 扩增；Q)PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；若存在扩增产物，则待检测样品中含有MIR162目的基因Vip3Aa20 ；若不存在扩增产物，则待检测样品中不含有MIR162目的基因Vip3Aa20。所述步骤(1)中，PCR程序为95°C 5min 预变性；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 35 个循环；72°C延伸7min。所述用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物可以用于STOR Green I实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20，具体应用时，步骤为(1)建立MIR162基因特异性引物的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和 zSSnb基因的STOR Green I实时荧光定量PCR标准曲线①提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入MIR162目的基因的特异性引物，以及zSSnb基因的国家标准引物，进行扩增；②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制MIR162目的基因Vip3Aa20的定量PCR标准曲线和zSSnb基因的定量PCR标准曲线；(2)提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入MIR162基因的特异性引物，以及zSSnb基因的国家标准引物，进行扩增；扩增后， 测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162基因的定量PCR标准曲线和zSSnb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米 MIR162目的基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSnb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。所述步骤⑴①和O)中，zSSIIb引物序列(国家标准)如下zSSIIb-F 5' -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3‘；zSSIIb-R 5' -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3‘。所述步骤(1)①和⑵中，扩增的参数如下扩增反应体积为20uL，2Xft~emix Ex Taq (Rox) IOuL,浓度为 IOumol/L 的 Forward primer 0. 4uL,浓度为 10umol/L 的 Reverse primerO. 4uL, ddH20 8. 2uL, DNA 模板 IuL ；扩增反应条件95°CIOmin 预变性；95°C 15s，58°C 30s, 72°C 30s，在 72°C收集荧光信号，共计40个循环。一种用于检测转基因玉米MIR162的荧光标记探针，所述探针的序列为 MIR162GS-P :FAM-5 ‘ -CTACACCAACAACATCGT-3 ‘ -Eclipse，如 SEQ ID N0. 3 所示，探针的 5'端连接一个荧光报告集团FAM，3'端连接有一个荧光淬灭集团Eclipse。上述用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物及用于检测转基因玉米MIR162的荧光标记探针，可以用于TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有 MIR162目的基因Vip3Aa20，具体应用时，步骤为(1)建立MIR162基因特异性引物的I1aqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线和 zSSIIb基因的I1aqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线①提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入MIR162目的基因Vip3Aa20的特异性引物和荧光标记探针，以及zSSUb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制MIR162目的基因Vip3Aa20的定量PCR标准曲线和zSSUb基因的定量PCR标准曲线；(2)提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入MIR162基因的特异性引物和荧光标记探针，以及zSSUb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162基因的定量PCR标准曲线和zSSUb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSUb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。所述步骤(1)①和O)中，zSSUb引物和探针序列(国家标准)如下zSSIIb-F 5' -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3‘；zSSIIb-R 5' -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3‘；zSSIIb-P :FAM-5' -TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3‘ -TAMRA。所述步骤(1)①和⑵中，扩增的参数如下扩增反应体积为20uL，2Xft~emix Ex Taq (Rox) 12. 5uL,浓度为 10umol/L 的 Forward primer IuL,浓度为 10umol/L 的 Reverse primer luL，浓度为 lOumol/L 的 TaqMan probeO. 5uL, ddH20 4uL, DNA 模板 IuL ；扩增反应条件95°CIOmin 预变性；95°C 15s，58°C 30s，72°C 30s，在 72°C收集荧光信号，共计45个循环。本发明设计了针对转基因玉米MIR162目的基因Vip3Aa20的特异性引物与探针序列，并建立了转基因玉米MIR162基因特异性定性PCR检测方法、STOR Green I实时荧光定量PCR检测方法和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，该检测方法经实验验证，灵敏、 准确、简单、可靠，具有广阔的应用价值与市场前景。
图1为实施例1中转基因玉米MIR162基因特异性定性PCR扩增结果电泳示意图。图2为实施例2中内标准基因zSSUb的STOR Green I实时荧光定量PCR标准曲线。图3为实施例2中转基因玉米MIR162目的基因Vip3Aa20STOR Green I实时荧光定量PCR标准曲线。图4为实施例3中内标准基因zSSUb的I1aqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线。图5为实施例3中转基因玉米MIR162目的基因Vip3Aa20TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1转基因玉米MIR162转化体特异性定性PCR检测方法引物由大连Takara公司合成，稀释成lOumol/L备用，合成的引物序列如下
MIR162GS-F 5' -GGACCAGAGCGAGCAAATCT-3‘；MIR162GS-R 5' -GCAGGGTCTTCATCTTCTTGGT-3‘。分别提取转基因玉米MIR162、GA21、NK603、M0N810、M0N88017、TC1507、MIR604、 Btl76、Btll，非转基因大豆1138-2，转基因大豆GTS40-3-2、M0N87701，转基因棉花 M0N88913、LLcotton25、M0N531、M0N1445，转基因水稻TT51、科丰6号，非转基因玉米郑单 958基因DNA为模板，分别用MIR162GS-F和MIR162GS-R引物组合进行PCR扩增。PCR程序为:95°C 5min 预变性；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s，;35 个循环；72°C延伸 7min。PCR 扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物。结果利用所设计的引物以提取的基因组为模板进行PCR扩增，结果如图1所示， 由图可见，只有转基因玉米MIR162基因组成功扩增出98bp特异性产物，而其他转基因和非转基因样品模板都没有可观察到的扩增产物。由此证明，该引物具有良好的特异性，适合于转基因玉米MIR162基因特异性的定性检测。实施例2转基因玉米MIR162基因特异性STOR Green I实时荧光定量PCR检测方法提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA，按5倍倍比分别稀释至5°，5^,5"2, 5_3， 5_4 ；相应的拷贝数设为100000，20000，4000，800，160，每个浓度设3个重复，检测扩增的重复性。引物由大连Takara公司合成，稀释成lOumol/L备用。合成的MIR162引物序列如下MIR162GS-F 5' -GGACCAGAGCGAGCAAATCT-3‘；MIR162GS-R 5' -GCAGGGTCTTCATCTTCTTGGT-3‘。玉米内标引物(zSSIIb)采用国家标准引物，其序列如下zSSIIb-F 5' -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3‘；zSSIIb-R 5' -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3‘。扩增反应体积为 20uL，2 X Premix Ex Taq (Rox) IOuL，浓度为 IOumo 1/L 的 Forward primerO. 10umol/L ^ Reverse primer 0. 4uL, ddH20 8. 2uL，DNAluL。才Γ 增反应条件95°C IOmin预变性；95°C 15s，58°C 30s, 72°C 30s，在72°C收集荧光信号，共计 40个循环。每个试样重复3次，同时设立无菌双蒸水(ddH20，空白)和非转基因样品(郑单958，阴性)对照。结果通过对不同MIR162标准品拷贝数为100000，20000，4000，800，160的DNA进行STOR Green I实时荧光定量PCR扩增，计算机软件自动生成标准曲线，纵坐标为Ct，横坐标为起始拷贝数的自然对数。根据标准曲线所得的线性计算公式，通过对不同转基因含量的转基因玉米MIR162标准品(1%,0.5%,0. 1%,0. 05%,0.01% 阳性样品、阴性样品及空白对照的测定，将样品的Ct值代入公式，即可得到待测样品转基因成分的百分含量。对玉米内标准基因zSSnb和转基因玉米MIR162的基因特异性引物对同一组标准品DNA和不同百分含量的转基因玉米DNA进行STOR Green I实时荧光定量PCR扩增，分别得到PCR扩增曲线，并由系统软件自动生成标准曲线。玉米内标准基因zSSnb的标准曲线如图2所示，该曲线的斜率为-3. 25，相关系数R2为0. 999。转基因玉米MIR162的基因特异性引物的标准曲线如图3所示，该曲线的斜率为-3. 557，相关系数R2为0. 998。因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。根据公式样品中转基因玉米MIR162含量=(外源基因MIR162拷贝数/内标基因zSSUb 拷贝数)X100%可以计算出待测样品中转基因成分MR162的百分含量。实施例3转基因玉米MIR162转化体特异性TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA，按5倍倍比分别稀释至5°，5—1，5_2，5_3，5_4 ；相应的拷贝数设为100000，20000，4000，800，160，每个浓度设3个重复，检测扩增的重复性。引物和探针由大连Takara公司合成，稀释成lOumol/L备用。合成的MIR162引物与探针序列如下MIR162GS-F 5' -GGACCAGAGCGAGCAAATCT-3‘；MIR162GS-R 5' -GCAGGGTCTTCATCTTCTTGGT-3‘；MIR162GS-P :FAM-5' -CTACACCAACAACATCGT-3‘ -Eclipse。玉米内标引物与探针(zSSIIb)采用国家标准引物与探针，其序列如下zSSIIb-F 5' -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3‘；zSSIIb-R 5' -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3‘；zSSIIb-P :FAM-5' -TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3‘ -TAMRA。扩增反应体积为20uL,2XPremix Ex Taq (Rox) 12. 5uL,浓度为 10umol/L 的 Forward primer IuL,浓度为 10umol/L 的 Reverse primer IuL,浓度为 lOumol/L 的 TaqMan probeluL, ddH20 3. 5uL, DNA 模板 IuL ；扩增反应条件95 °C IOmin 预变性；95 °C 15s, 58°C 30s, 72°C 30s，在72°C收集荧光信号，共计45个循环。每个试样重复3次，同时设立无菌双蒸水(ddH20，空白)和非转基因样品(郑单958，阴性)对照。结果通过对不同MIR162标准品拷贝数为100000，20000，4000，800，160的DNA进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增，计算机软件自动生成标准曲线，纵坐标为Ct，横坐标为起始拷贝数的自然对数。根据标准曲线所得的线性计算公式，通过对不同转基因含量的转基因玉米MIR162标准品(1 %，0. 5 %，0. 1 %，0. 05 %，0. 01 % )、阳性样品、阴性样品及空白对照的测定，将样品的Ct值代入公式，即可得到待测样品转基因成分的百分含量。对玉米内标准基因zSSUb和转基因玉米MIR162的基因特异性引物对同一组标准品DNA和不同百分含量的转基因玉米DNA进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增，分别得到 PCR扩增曲线，并由系统软件自动生成标准曲线。玉米内标准基因zSSUb的标准曲线如图 4所示，该曲线的斜率为-3. 557，相关系数R2为0. 999。转基因玉米MIR162的基因特异性引物的标准曲线如图5所示，该曲线的斜率为-3. M6，相关系数R2为0. 997.因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。根据公式样品中转基因玉米MIR162含量=(外源基因MIR162拷贝数/内标基因zSSUb 拷贝数)X100%可以计算出待测样品中转基因成分MR162的百分含量。以上结果可以证明，本发明为转基因玉米MIR162目的基因Vip3Aa20的定性PCR、 SYBRGreen I实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测提供了简单、可靠的测定方法，可以用于转基因玉米MIR162的检测。本发明为转基因标识提供了一种强有力的技术支撑，为转基因产品的控制提供了必要的手段。
权利要求
1.一种用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物，其特征在于所述引物由上游引物和下游引物组成，其序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。
2.权利要求1所述的用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物在定性检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20中的应用。
3.权利要求1所述的用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物在STORGreen I实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20中的应用。
4.一种用于检测转基因玉米MIR162的荧光标记探针，其特征在于所述探针的序列如 SEQ ID NO. 3所示，探针的5'端连接一个荧光报告集团FAM，3‘端连接有一个荧光淬灭集团 Eclipse。
5.权利要求1所述的用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物及权利要求4所述的用于检测转基因玉米MIR162的荧光标记探针在TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20中的应用。
6.一种定性检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20的方法，其特征在于步骤为(1)提取待检测样品的基因组DNA，并以此为模板，利用特异性引物MIR162GS-F和 MIR162GS-R 进行 PCR 扩增；0)PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；若存在扩增产物，则待检测样品中含有MIR162目的基因Vip3Aa20 ；若不存在扩增产物，则待检测样品中不含有MIR162目的基因Vip3Aa20。
7.一种STOR Green I实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20的方法，其特征在于步骤为(1)建立MIR162基因特异性引物的STORGreenI实时荧光定量PCR标准曲线和zSSnb 基因的STORGreen I实时荧光定量PCR标准曲线①提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入 MIR162目的基因的特异性引物，以及zSSnb基因的国家标准引物，进行扩增；②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制MIR162目的基因Vip3Aa20的定量PCR标准曲线和zSSnb基因的定量 PCR标准曲线；(2)提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入MIR162基因的特异性引物，以及zSSnb基因的国家标准引物，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162基因的定量PCR 标准曲线和zSSnb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162 目的基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSnb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤⑴①和(2)中，扩增的参数如下扩增反应体积为 20uL，2XPremix Ex Taq (Rox) 10uL，浓度为 10umol/L 的 Forward primer 0.lOumol/L 的 Reverse primer 0. 4uL, ddH20 8. 2uL,DNA|ffe. IuL ；if 增反应条件95°C IOmin预变性；95°C 15s，58°C 30s, 72°C 30s，在72°C收集荧光信号，共计 40个循环。
9.一种TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20的方法，其特征在于步骤为(1)建立MIR162基因特异性引物的I1aqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线和zSSnb 基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线①提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入 MIR162目的基因Vip3Aa20的特异性引物和荧光标记探针，以及zSSUb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制MIR162目的基因Vip3Aa20的定量PCR标准曲线和zSSUb基因的定量 PCR标准曲线；(2)提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入MIR162基因的特异性引物和荧光标记探针，以及zSSUb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162基因的定量PCR标准曲线和zSSUb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSUb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述步骤(1)①和O)中，扩增的参数如下扩增反应体积为20uL，2XPremix Ex Taq(Rox) 12. 5uL，浓度为10umol/L的 Forward primer IuL,浓度为 10umol/L 的 Reverse primer IuL,浓度为 lOumol/L 的 TaqMan probeO. 5uL, ddH20 4uL, DNA 模板 IuL ；扩增反应条件95°C IOmin预变性；95°C 15s, 58°C 30s, 72°C 30s，在72°C收集荧光信号，共计45个循环。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测转基因玉米MIR162的特异性引物，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种用于检测转基因玉米MIR162的荧光标记探针，序列如SEQ ID NO.3所示，探针的5′端连接一个荧光报告集团FAM，3′端连接有一个荧光淬灭集团Eclipse。本发明还公开了该引物及探针用于基因特异性定性PCR、SYBR Green I实时荧光定量PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测玉米及其相关产品是否含有MIR162目的基因Vip3Aa20的检测方法，该检测方法经实验验证，灵敏、准确、简单、可靠，具有广阔的应用价值与市场前景。
文档编号C12Q1/68GK102559921SQ20121005253
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者孙红炜, 张广远, 李凡, 杨淑珂, 路兴波 申请人:山东省农业科学院植物保护研究所