专利名称：利用scar标记鉴定甘蔗抗黑穗病性方法
技术领域：
本发明涉及一种植物的抗病性分子标记的鉴定方法，具体涉及利用SCAR标记鉴定甘蔗抗黑穗病性方法，属于生物技术领域。
背景技术：
MMXSaccharum oiTiciaa/ )是最主要的糖料作物,鹿糖占我国食糖总产的90% 以上，甘鹿生产关系我国食糖安全。由黑粉菌引起的甘鹿黑穗病是一种世界性的也是我国最严重的甘蔗真菌性病害，目前主栽品种宿根黑穗病发病率高达 20%，造成严重损失，培育抗病品种是最经济、最有效的控制措施，抗病性鉴定的效率和准确性直接影响抗病育种的进程和效果。目前，国内外甘蔗对黑穗病抗性鉴定还是采用用人工接种蔗茎后田间种植，在整个生长季观察发病率进行抗病性鉴定，其不足在于首先至少需要根据两个作物季(即2次新植或I次新植和I次宿根)的鉴定结果进行综合判断，周期长达2年；其次该方法工作量大，占地大，成本高，难以对大规模的样品进行鉴定，而甘蔗高度杂合的异源多倍体作物， 也是无性繁殖作物，杂交F1代分离群体性状高度分离，是进行选择的最佳时期，但优良聚合基因型重组概率很低，通常从实生苗到育成品种的概率约为1/100，000，故鉴定和选择的工作量极大。甘蔗抗黑穗病性状的选择也是以杂交分离的大群体作为选择基础，现有的鉴定方法与育种的大群体要求不相适应；再次田间抗病性表现是甘蔗基因型、环境和病原3个因素互作的结果，因此，环境对抗病性表现型影响大，不同年份间的鉴定结果有比较大的差
巳因此，甘蔗对黑穗病抗性的鉴定效率和准确性直接关系甘蔗生产的安全，而目前的抗病性鉴定方法效率低、周期长、耗费高，准确性也不足，需要更简便、快速、准确的抗病性鉴定技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用SCAR标记鉴定甘蔗抗黑穗病性的方法。本发明利用SCAR标记鉴定甘蔗抗黑穗病性的方法，包括基因组DNA的提取、 SCAR-PCR标记的检测体系建立和SCAR-PCR产物的检测，其特征在于
1、SCAR-PCR标记的检测使用的检测引物是甘蔗SCAR-F和SCAR-R，其中，SCAR-F 是 5' -CTTTGTTTCCCGTAGTGTCTTGT-3'，SCAR-R 是 5’-ATAGCCTGCCTTCTCTCCTTT-3’ ；
2、SCAR-PCR标记的检测建立SCAR-PCR扩增体系为总体积25μ I，内含2. 5 μ I 10XPCR 缓冲液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 mmol/L 的检测引物 SCAR-F 和 SCAR-R 各 I. 0 μ I, I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-50 ng 基因组 DNA， ddH20 补足到 25 μ I ;SCAR-PCR 扩增程序如下94 °C 4 min ；94 °C I min, 58 °C I min, 72 0C 2 min，30个循环；72 °C 10 min ;所述 10XPCR缓冲液组成成分为 100 mmol/L pH8. 5 Tris-HCl，500 mmol/L KCl 和 15 mmol/L MgCl2 ；3、SCAR-PCR产物的检测电泳检测的SCAR-PCR扩增图谱中，在分子量为331 bp的位置出现DNA条带,为甘鹿感黑穗病的标志；在分子量为331 bp的位置未出现DNA条带,为甘蔗抗黑穗病标志。本发明具有以下优点本发明的利用SCAR标记鉴定甘蔗抗黑穗病性的方法，具有灵敏度高，所需要的DNA用量少的特点；与常规的人工接种田间抗性鉴定相比，具有操作简便、检测时间短、准确性高、容易判断、重复性好和不受环境条件影响等优点。I、操作简便该检测方法得到的显性标记可显著减少甘蔗抗黑穗病性鉴定的工作量，检测时只需要SCAR-PCR扩增和产物检测即可快速鉴定甘蔗抗黑穗病性；而常规的人工接种田间抗性鉴定则需要大量的人力和物力来开展人工接种和田间收据收集处理，当品种多时鉴定工作难以进行。2、检测时间短该检测方法所需时间为1-2天，而常规的人工接种田间抗性鉴定试验所需时间至少为2年。3、准确性高、容易判断、重复性好，而且不受环境因素的影响该检测方法以基因组DNA为材料，DNA是稳定的遗传物质，不受环境因素等的影响，同时它的331 bp的显性判断一目了然，减少了环境条件的影响和人为判断的偏差，大大提高了准确性；而常规的人工接种田间抗性鉴定试验中，受人工接种效果、田间抗性鉴定数据收集时间和种植环境的影响，给准确判断造成困难。本发明为甘蔗种质资源的评价和新品种的审定工作，提供了更为简便有效的抗黑穗病性鉴定体系，对加强我国抗黑穗病甘蔗种质资源的保护工作具有重要意义。
图I为使用甘蔗SCAR-F和SCAR-R检测引物鉴定22个甘蔗品种抗黑穗病性的SCAR-PCR扩增图谱。其中各泳道中，M代表分子量标准，C代表空白对照，S代表对应甘蔗品种人工接种田间抗性鉴定为感黑穗病，R代表对应甘蔗品种人工接种田间抗性鉴定为抗黑穗病；1-22代表22个品种，具体为1，FN91-4710; 2，GT96-44; 3，R0C5; 4， FN95-1702; 5， YZ92-19; 6， R0C26; 7， YT93-159; 8， YT85-177; 9， YT89-240; 10， FN27; 11，Brazil45; 12，ColOOl; 13，CP85-1308; 14，GN95-108; 15，FN95-0403; 16，HoCP92-648; 17，CP89-1509; 18，MT92-649; 19，HoCP93_750; 20，CP72-1210; 21， HoCP91-555; 22， LCP85-384。图2为使用甘蔗SCAR-F和SCAR-R检测引物鉴定23个甘蔗品种抗黑穗病性的SCAR-PCR扩增图谱。其中各泳道中，M代表分子量标准，S代表对应甘蔗品种人工接种田间抗性鉴定为感黑穗病，R代表对应甘蔗品种人工接种田间抗性鉴定为抗黑穗病； 23-45 代表 23 个品种，具体为 23，CP88-1726; 24，GT93-103; 25，R0C16; 26，R0C22; 27， RB72-454; 28， FN94-0744; 29， FR93-435; 30, GT94-119; 31， FR93-344; 32， MT86-2121; 33， HoCP93_746; 34， MEX105; 35， R0C27; 36， GT90-95; 37， R0C10; 38， R0C25; 39， R0C20; 40， R0C24; 41， FN91-4621; 42， YT96-244; 43， FN02-3924; 44， Q170; 45, FN91-3623。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的阐述。实施例I 一种利用SCAR标记鉴定甘蔗抗黑穗病性的方法一种利用SCAR标记鉴定甘蔗抗黑穗病性的方法，包括以下步骤
I、基因组DNA的提取
(1)取5克待检测甘蔗植株的嫩叶，置研钵，加入液氮迅速磨粹成粉末，并在解冻前转入50 ml的离心管中；
(2)加入15ml,65 °C预热的SDS提取液，混匀后在65 1水浴保温40 min ；
(3)加8 ml 3 mol/L KAC 混匀后，冰浴 30 min ；
(4)25000 g，4 °C离心，20 min ;收集上清液，并加入12 ml于4°C预冷的异丙醇；
(5)-20°C放置30 min后，钩出漂浮在液面的DNA，置于一干净的I. 5 ml离心管中，晾干后加入750 μ I TE ;加等体积的平衡饱和酚，摇匀，12000 g，4 °C离心，10 min ；
(6)转移上清至另一干净的I.5 ml离心管中，加等体积的氯仿，12000 g，4 °C，离心10 min后移出上层水相；
(7)在水相中加2倍体积的无水乙醇，12000g，4 °C离心10 min，留沉淀，用体积浓度为70%的乙醇清洗2次，并晾干；
(8)加灭菌后的TE溶液200μ I溶解后，置-20 °C冰箱中保存备用。2、SCAR-PCR标记的检测建立
SCAR-PCR扩增体系为总体积25 μ 1，内含2. 5 μ I 10XPCR缓冲液，2. 5 μ I 25 mmol/ L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP，10 mmol/L 的检测引物 SCAR-F 和 SCAR-R 各 I. 0 μ I, I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-50 ng 基因组 DNA，ddH20 补足到 25 μ I。
SCAR-PCR扩增程序如下94 °C 4 min ；94 °C I min, 58 °C I min, 72 °C 2 min, 30 个循环；72 °C 10 min。所述专用检测弓I物SCAR-F和SCAR-R，是采用RAPD-PCR技术，经过大量的筛选试验，获得了感黑穗病甘蔗的特异DNA片段，以此片段的DNA序列为基础，设计甘蔗抗黑穗病性鉴定的检测引物。所述检测弓I物SCAR-F和SCAR-R的具体内容为
SCAR-F 5/ -CTTTGTTTCCCGTAGTGTCTTGT-3',
SCAR-R :5’-ATAGCCTGCCTTCTCTCCTTT-3’。3、SCAR-PCR扩增产物的检测
具体的检测方法为，取SCAR-PCR扩增产物10 μ ，加5 μ I含有溴酚蓝的上样缓冲液， 混匀后点样于含有0. 5 μ g/ml溴化乙锭的I. 5 %琼脂糖凝胶上，于0. 5 X TBE缓冲液中，10 V/cm恒定电压下电泳1.5 h，结束后在凝胶成像系统上成像并进行凝胶分析。SCAR-PCR产物的检测结果采用检测弓I物SCAR-F和SCAR-R对甘蔗进行SCAR-PCR 扩增，结果如图I、图2所示，只有感黑穗病甘蔗出现分子量为331 bp的DNA条带，而抗黑穗病甘鹿不出现331 bp的DNA条带。本发明采用的主要试剂如下(所有化学试剂均为分析纯)
1、SDS提取液NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 I. 44 g、KH2 PO4 0. 24 g、SDS 2 g、甘油 50 ml,灭菌去离子I L, pH值7· 4 ;
2、TE溶液10 mmol/L Tris HCl, I mmol/L EDTA ；
3、上样缓冲液0.1%溴酚蓝，40%蔗糖；4、0.5 X TBE 缓冲液44. 5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3,1 mmol/L EDTA ；
5、PCR扩增试剂购自大连宝生物公司；
本发明所使用的仪器主要如下
1、PCR扩增仪德国Eppendorf5331 PCR扩增仪；
2、电泳仪北京六一仪器厂DYCZ-20ADNA序列分析电泳仪；
3、离心机德国Eppendorf5810/5810R多功能台式离心机；
4、凝胶成像系统美国BIO-RADGel Doc 2000凝胶成像系统。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
1. 一种利用SCAR标记鉴定甘蔗抗黑穗病性的方法，包括基因组DNA的提取、SCAR-PCR 标记的检测体系建立和SCAR-PCR产物的检测，其特征在于SCAR-PCR标记的检测使用的检测引物是甘蔗SCAR-F和SCAR-R，其中SCAR-F 是 5' -CTTTGTTTCCCGTAGTGTCTTGT-3'，SCAR-R 是 5’-ATAGCCTGCCTTCTCTCCTTT-3’ ；(2)SCAR-PCR标记的检测建立SCAR-PCR扩增体系为总体积25 μ I，内含2. 5 μ I 10XPCR 缓冲液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 mmol/L 的检测引物 SCAR-F 和 SCAR-R 各 I. 0 μ I, I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-50 ng 基因组 DNA， ddH20 补足到 25 μ I ； SCAR-PCR扩增程序如下94 °C 4 min ；94 °C I min，58 °C I min, 72 °C 2 min，30个循环；72 °C 10 min ;所述 10XPCR缓冲液组成成分为 100 mmol/L pH8. 5 Tris-HCl，500 mmol/L KCl 和 15 mmol/L MgCl2 ；(3)SCAR-PCR产物的检测电泳检测的SCAR-PCR扩增图谱中，在分子量为331bp的位置出现DNA条带,为甘鹿感黑穗病的标志；在分子量为331 bp的位置未出现DNA条带,为甘蔗抗黑穗病标志。
全文摘要
一种利用SCAR标记鉴定甘蔗抗黑穗病性的方法，包括基因组DNA的提取、SCAR-PCR标记的检测体系建立和SCAR-PCR产物的检测。本发明的利用SCAR标记鉴定甘蔗抗黑穗病性的方法，具有灵敏度高，所需要的DNA用量少的特点；与常规的人工接种田间抗性鉴定相比，具有操作简便、检测时间短、准确性高、容易判断、重复性好和不受环境条件影响等优点。为甘蔗种质资源的评价和新品种的审定工作，提供了简便有效的抗黑穗病性鉴定体系，对科研和生产具有重要的意义。
文档编号C12Q1/68GK102586440SQ20121005154
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者徐景升, 许莉萍, 阙友雄, 陈如凯 申请人:福建农林大学