专利名称：一株降解甲烷气体的甲基细菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株甲基细菌。
背景技术：
甲烷是重要的温室气体之一，在大气中甲烷的浓度远低于二氧化碳，但其具有高效的单分子增温潜势，热吸收效应是二氧化碳的21倍，是温室气体减排的主要目标之一。 甲烷是厌氧环境中有机物质降解过程的终端产物，天然来源的甲烷源于厌氧土壤系统(天然湿地、水域淤泥等)，人类活动引起的甲烷排放主要来源于人工稻田湿地、天然气开发、垃圾填埋场、煤炭开采、养殖场粪便等。在自然环境中甲烷的生物降解由甲烷氧化细菌完成， 厌氧环境下生成的甲烷在途经水体或土壤时，被栖身于其间的甲烷氧化细菌氧化。因此，甲烷氧化细菌对自然环境下甲烷排放有重要影响，而利用技术手段，科学地使用甲烷氧化细菌对控制甲烷排放有重要意义。
发明内容
本发明提供一株甲基细菌(MethylcAacter sp.)菌株，可高效降解甲烷气体，为使用生物手段控制甲烷排放提供了重要基础。本发明降解甲烷气体的甲基细菌为甲基细菌(MethylcAacter sp. )Metl8，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年1月4日，保藏号为CGMCC No. 5692 ；本发明甲基细菌 Metl8为革兰氏阴性菌，短杆状，细胞大小为(0. 23 μ m 0. 3 μ m) X (0. 65 μ m 0. 76 μ m)， 无芽孢，无鞭毛；在MNMS培养基上培养10d，菌落直径l_2mm较小，透明圆形，边缘整齐，表面光滑。本发明甲基细菌MetlS可在提供气态甲烷的MNMS培养基上生长，最适生长温度为 28-320C，最适生长环境pH为6. 8。本发明的甲基细菌(Methylobacter sp. )Metl8通过16S rDNA序列比对分析，与甲基细菌属(MethylcAacter sp.)的亲缘关系最为接近，保守区相似性为99%。通过结合菌体形态特征、生长条件确定甲基细菌Metl8为甲基细菌属(MethylcAacter sp.)的一株新菌株，命名为甲基细菌Metl8。本发明甲基细菌MetlS能够高效降解甲烷气体，甲基细菌MetlS在甲烷气体浓度为30%的培养瓶中，培养9天对甲烷气体的降解率达到55%，培养15天对甲烷气体的降解率达到89%。本发明的甲基细菌(Methylobacter sp. )Metl8，属于甲基细菌属(Methylobacter sp.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年1月4日，保藏号为CGMCC No. 5692。
图1为甲基细菌Metl8和相近菌株的16S rDNA序列进行同源性比对构建的系统发育树图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式降解甲烷气体的甲基细菌为甲基细菌 (Methylobacter sp. ) Met 18，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年1月4日，保藏号为 CGMCCNo. 5692。本实施方式甲基细菌(MethylcAacter sp. )Metl8为革兰氏阴性菌，短杆状，细胞大小为(0. 23μπι 0. 3μ ) X (0. 65μπι 0. 76 μ m)，无芽孢，无鞭毛；在MNMS培养基上
培养10d，菌落直径l_2mm较小，透明圆形，边缘整齐，表面光滑。本实施方式甲基细菌Met 18可在提供气态甲烷的MNMS培养基上生长，最适生长温度为^_32°C，最适生长环境pH为6.8。
具体实施方式
二 本实施方式甲基细菌(Methylobacter sp. )Metl8由2010年8 月份采集于黑龙江省汤原县水稻田中稻谷植株根部0 15cm的泥土中筛选得到。筛选按以下步骤进行称取已晾干、粉碎好的泥土样品10. 0g，装入加有玻璃珠和无菌水的三角瓶中，浸泡30min后，在180r/min的振荡器上振荡30mim，然后静止，取悬浊液在10000r/min 离心10 15min，静止备用。用2. 5ml医用注射器取Iml上清液加入到100ml MNMS培养基中，再通入100ml甲烷气体，每隔2-3d加一次甲烷气体，每次50-100ml。摇床培养120r/ min 培养9-15天，以发酵液浑浊，为第一次富集培养完成。再从第一次富集培养液中取Iml进行第二次富集培养，方法同上。连续富集培养不少于3次。富集培育后经MNMS固体培养基涂布分离培养，得到甲基细菌MetlS。MNMS培养基由1. 0g/L的磷酸二氢钾、2. 9g/L的十二水磷酸氢二钠、0. 32g/L的七水硫酸镁、3. 0g/L的硫酸二铵、IOmL微量元素溶液和990mL蒸馏水组成，pH值为6. 8。其中微量元素溶液组成(mg/L)如下0. 287mg/L七水硫酸锌、0. 223mg/L七水硫酸锰、0. 062mg/ L硼酸，0. 048mg/L 二水钼酸钠、0. 048mg/L六水三氯化钴、0. 083mg/L碘化钾、3. 5mg/L 二水氯化钙和蒸馏水组成。MNMS固体培养基由1. 0g/L的磷酸二氢钾、2. 9g/L的十二水磷酸氢二钠、0. 32g/ L的七水硫酸镁、3. 0g/L的硫酸二铵、IOmL微量元素溶液和990mL蒸馏水组成，pH值为 6. 8。其中微量元素溶液组成(mg/L)如下0. 287mg/L七水硫酸锌、0. 223mg/L七水硫酸锰、0. 062mg/L硼酸，0. 048mg/L 二水钼酸钠、0. 048mg/L六水三氯化钴、0. 083mg/L碘化钾、 3. 5mg/L 二水氯化钙、琼脂和蒸馏水组成，其中琼脂的质量浓度为2%。对筛选得到的甲基细菌MetlS进行分子鉴定，按以下步骤进行提取菌株的总 DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒(购自于大连宝生物工程有限公司)回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化，筛选阳性克隆子菌落，经扩大培养后委托上海生工生物技术有限公司测序。甲基细菌(Methylobacter sp. )Metl8 的 16SrDNA 序列长度为 1498bp，其序列如SEQ ID NO :1所示，测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，然后用软件构建系统发育树(如图1所示)，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与甲基细菌属(MethylcAacter sp.)的亲缘关系最为接近，保守区相似性为99%。通过结合菌体形态特征、生长条件确定甲基细菌Metl8为甲基细菌属(MethylcAacter sp.)的一株新菌株，命名为甲基细菌Metl8。对本实施方式甲基细菌MetlS降解甲烷气体的降解率进行测定，具体方法如下用2.5ml医用注射器取106cfu/ml的菌悬液lml，转入已加入100ml MNMS培养基的医用点滴塑料瓶中，用50ml医用注射器加入IOOml甲烷气体，每隔2_3天加一次甲烷气体，每次50-100ml。培养9-15天，以发酵液浑浊，为菌液制备完成。向培养瓶中充入定量甲烷气体，使得培养瓶中甲烷气体浓度范围在30%左右，摇床培养120r/min ^°C，培养 9天降解率达到55%，培养15天降解率达到89%。利用气相色谱检测培养瓶中甲烷气体浓度变化。气相色谱条件柱温80°C，检测器温度120°C，气化室温度120°C，载气氮气流量 70ml/min，燃气氢气流量75ml/min，助燃气空气流量900-1000ml/min，色谱柱5% DNP+5% 有机肥土。
权利要求
1. 一株降解甲烷气体的甲基细菌，其特征在于降解甲烷气体的甲基细菌为甲基细菌 (Methylobacter sp. )Metl8，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年1月4日，保藏号为CGMCC No.5692。
全文摘要
一株降解甲烷气体的甲基细菌，它涉及一株甲基细菌。本发明提供一株甲基细菌菌株，可高效降解甲烷气体，为使用生物手段控制甲烷排放提供了重要基础。本发明降解甲烷气体的甲基细菌为甲基细菌Met18，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年1月4日，保藏号为CGMCC No.5692。本发明甲基细菌Met18能够高效降解甲烷气体，甲基细菌Met18在甲烷气体浓度为30％的培养瓶中，培养9天对甲烷气体的降解率达到55％，培养15天对甲烷气体的降解率达到89％。
文档编号C12R1/01GK102533620SQ20121005155
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者吴皓琼, 曹亚彬, 殷博, 牛彦波, 甄涛, 郭立姝 申请人:黑龙江省科学院微生物研究所