专利名称：小反刍兽疫疫苗株病毒荧光rt-pcr检测用引物和探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及荧光RT-PCR检测用引物和探针，更具体地说，涉及一种小反刍兽疫疫苗株病毒荧光RT-PCR检测用弓I物和探针。
背景技术：
小反会兽疫(peste des petits ruminants, PPR)又称小反会兽假性牛痕,是由副黏病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒引起的急性、烈性传染病。小反刍兽疫临床以突然发热、口炎、腹泻和肺炎为特征，主要感染山羊、绵羊及一些野生小反刍动物，对羊，尤其是
山羊危害严重。小反刍兽疫于1942年在西非科特迪瓦首次发现，随后证实该病存在于非洲的尼日利亚、塞内加尔和加纳。近年来该病呈蔓延的趋势，并且越来越明显，由西非、中非和东非向东扩散，目前已经传播到西亚和南亚地区，且有上升趋势。2007年7月，我国西藏自治区阿里地区发生该病，已鉴定为小反刍兽疫病毒IV系。由于发生疫情的西藏阿里地区交通不便、对外交流少，限制了疫区的进一步扩大。但是之前我国从未发生过小反刍兽疫，易感动物的发病率和死亡率都很高，一旦该病传入内地，经济损失将是非常巨大的。目前，在西藏防控该病主要采取活疫苗免疫接种的防控措施，辅以一定的抗体监测手段。为了有效防控该病，监测病原的工作显得异常重要，然而免疫防控中使用的活毒疫苗使得目前的病毒核酸检测方法实效不大，实际工作中迫切需要鉴别疫苗株和野毒株的核酸检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对上述小反刍兽疫疫苗株病毒检测困难的问题，提供一种小反刍兽疫疫苗株病毒荧光RT-PCR检测用引物和探针。本发明解决上述技术问题采用的技术方案是，提供一种小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR检测的引物序列，所述引物序列包括由上游引物PPrV-YMl和下游引物 PPrV-YM2 组成的引物对，其序列分别为 AGGCAGCAAGCCGCAGA 和 TCCGGTGGTGTCGGAT GTGT，或者所述引物序列包括由上游引物的互补序列TCCGTCGTTCGGCGTCT和下游引物的互补序列 AGGCCACCACAGCCTACACA 组成的弓 I 物对。在本发明所述的小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR检测的引物序列，中所述的引物序列包括由上游引物PPrV-YMl位置向3’端方向延伸10个碱基、向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列及互补序列。在本发明所述的小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR检测的引物序列中，所述引物序列包括由下游引物位置向3’端方向延伸10个碱基区、向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列及互补序列。本发明还提供一种小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR检测的探针序列，所述的探针PPrV-YMp序列为CCTGTTTACCGCTGGCGTCTCCG，或其互补序列
3GGACAAATGGCGACCGCAGAGGC。在本发明所述的小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR检测的探针序列中，所述的探针序列包括由探针PPrV-YMp向3’端方向延伸10个碱基区和向5’端方向延伸10 个碱基区域范围内得到的探针序列及互补序列。本发明的小反刍兽疫疫苗株病毒荧光RT-PCR检测用引物和探针，可应用于荧光 RT-PCR检测，充分结合PCR技术的高效扩增型、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，具有结果可靠和准确灵敏、操作简单、省时省力、降低检测成本，提高检查效率等优点，特别适合大规模样品的快速检测以及紧急疫情的快速诊断。本发明可解决小反刍兽疫疫苗株和野毒株鉴别检测的难题，从而可以使动物防疫部门及口岸动植物检疫部门有针对性的防控该病，准确掌握疫病的发展趋势。
图I为小反刍兽疫疫苗株实时荧光RT-PCR引物和探针浓度筛选结果图。图2为小反刍兽疫疫苗株实时荧光RT-PCR方法的特异性试验检测曲线图。图3为小反刍兽疫疫苗株实时荧光RT-PCR方法的灵敏度试验检测曲线图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明通过对我国西藏地区使用的小反刍兽疫活疫苗毒株进行全基因组序列测定，并将其与美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)建立的DNA序列数据库中公布的西藏分离株病毒基因组序列进行比对分析，选取核酸差异较明显的区段进行引物和探针的设计与合成，探针的5’端标记FAM荧光报告基团。本发明的用于检测小反刍兽疫疫苗株病毒核酸的荧光RT-PCR检测用引物序列包括由上游引物PPrV-YMl和下游引物PPrV-YM2组成的引物对，其序列分别为 AGGCAGCAAGCCGCAGA和TCCGGTGGTGTCGGATGTGT。上述的引物对也可采用由上游引物的互补序列TCCGTCGTTCGGCGTCT和下游引物的互补序列AGGCCACCACAGCCTACACA组成的引物对代替，或者由上游引物位置向3’端方向延伸10个碱基、下游引物位置向3’端方向延伸10个喊基区域范围内得到的引物序列及互补序列等。本发明的用于检测小反刍兽疫疫苗株病毒核酸的荧光RT-PCR检测的探针序列包括探针PPrV-YMp序列为CCTGTTTACCGCTGGCGTCTCCG及互补序列为 GGACAAATGGCGACCGCAGAGGC，或该探针向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及互补序列。引物和探针设计一种用于实时荧光RT-PCR检测小反刍兽疫疫苗株的特异性引物和探针，其主要特点是上下游长度分别为17bp和19bp的核苷酸，探针长度为23bp的核苷酸，并在5’端标记上FAM荧光基因，3’端标记上TAMARA淬灭基团，最优引物、探针序列如下
PPrV-YMl :5，-AGGCAGCAAGCCGCAGA-3，PPrV-YM2 :5’ -TCCGGTGGTGTCGGATGTGT-3’PPrV-YMp :5’ -CCTGTTTACCGCTGGCGTCTCCG-3’将上述引物、探针序列优化组合后，建立检测小反刍兽疫疫苗株病毒的实时荧光 RT-PCR检测方法。小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR检测方法采用以下步骤(I)制备待测模板。小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR检测方法中的待测模板的制备可采用商品化RNA提取试剂盒或Trizol核酸抽提试剂的提取方法提取各种来源样品中小反刍兽疫病毒的基因组RNA。(2)反应体系的建立，参照AgPath-ID one-step RT-PCR Kit的说明书配制，采用 25 μ L反应体系，利用系列梯度方阵测定筛选法确定最佳的引物浓度和探针浓度。(3)反应程序的建立，确定最佳的退火温度。(4)选择仪器的检测通道。(5)上机检测。反应体系的建立和优化利用灭活的小反刍兽疫疫苗株病毒作为待检样品，利用商品化RNA提取试剂盒或 Trizol核酸抽提试剂的提取方法提取病毒基因组RNA，分装后置_20°C保存备用。(I)引物浓度的优化。在反应体系中其他条件相同的情况下，将引物浓度分别从 O. I μ M/L倍比稀释至O. 8 μ M/L，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物浓度终浓度为 O. 4yM/L (图 I)。(2)探针浓度的优化。在反应体系中其他条件相同的情况下，将探针浓度分别从
O.I μ M/L倍比稀释至O. 8 μ M/L,通过试验结果的分析比较，确定最佳探针浓度终浓度为
O.2yM/L (图 I)。通过对引物和探针浓度的优化，最后确定采用的实时荧光PCR反应体系为25 μ L， 包括 12.5yL 2Xreal time PCR Buffer(包含有 dNTPs，Mg2+等)，I μ L25Xenzyme mix, 浓度分别为O. 4 μ M/L和0. 2 μ M/L的引物和探针，5 μ L模板，用水补足至25 μ L。根据检测样品来源的不同，可适当调整模板用量。RT-PCR反应程序的建立50°C反转录30min，94°C 5min终止反转录反应；95°C 15s变性反应，在58-60°C之间选择退火扩增反应温度并维持45s，重复40个循环，根据使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。最后确定最佳退火温度为60°C。仪器检测通道的选择进行RT-PCR设置反应荧光信号时，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。程序设置好后，点击运行， 进行PCR反应，反应结束后保存文件，打开分析软件，分析实验结果，给出△ Rn (第η个循环时的荧光增加值)与循环数图像。实施例I(I)待测模板的制备方法一、采用商品化RNA提取试剂盒按照说明书方法进行。
方法二、用Trizol核酸抽提试剂的提取方法a.取小反会兽疫病毒的细胞培养液，灭活后，12000;rpm尚心去除大分子杂质。将 100 μ L上清液加入I. 5ml离心管中，再向其中加入300 μ L的Trizol组织抽提液，于振荡器上充分振荡。然后12000rpm离心15min，将上清移至I. 5ml的离心管中；b.向上清中加入400 μ L预冷的异丙醇，在振荡器上充分振荡后，12000rpm离心 IOmin,以便获得RNA沉淀；c.小心倒掉上清，加入600 μ L 75%乙醇，用手上下颠倒数次洗涤。(注意不能剧烈振荡，防止RNA的断裂和RNA沉淀溶解后难以重新沉淀)；d. 12000rpm离心IOmin,缓慢吸弃上清，室温干燥约25min,待乙醇完全挥发后加 25 μ L DEPC水溶解，_20°C保存备用。(2)小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR反应的扩增条件根据已经优化的反应体系来加样，将加好样的PCR管放在荧光PCR仪中，设置相应荧光收集条件后进行扩增，反应程序如下50°C 30min,94°C 5min ；95°C 15s,60°C 45s，重复 40个循环。(3)小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR检测结果在25μ L反应体系中，利用针对小反刍兽疫疫苗株病毒的特异性引物和探针进行实时荧光RT-PCR，检测含有小反刍兽疫疫苗株病毒基因组RNA的阳性样品，结果可以得到特异性的荧光曲线。以上试验结果表明，本发明设计的引物和探针特异性良好，并建立了小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR检测方法。实施例2小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR方法的特异性试验在25 μ L反应体系中，同时加入口蹄疫病毒(FMDV)、水泡性口炎病毒(VSV)、蓝舌病病毒(BTV)和小反刍兽疫野毒株的核酸作为模板，运用本发明的特异性引物和探针进行实时荧光RT-PCR检测，结果只有小反刍兽疫疫苗株有特异性扩增曲线，而FMDV、VSV、BTV和 PPRV野毒株的核酸均无扩增曲线，证实本发明针对PPRV疫苗株病毒的引物和探针具有良好的特异性(图2)。实施例3小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR方法的灵敏度试验在25 μ L反应体系中，将小反刍兽疫疫苗株病毒提取核酸测定浓度后，作8个10 倍系列稀释，进行实时荧光RT-PCR检测，得到稀释梯度系列扩增曲线(图3)，结果发现其可以检测的最低稀释度为10_5，相当于浓度为I. 38pg/ μ L的RNA。利用本发明进行检测，操作简便快速，一般可在3小时左右完成，而且可以在检测过程中实时检测结果，不需要进行扩增产物的电泳观察，避免了扩增产物之间的污染以及电泳观察时EB对环境的污染。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
权利要求
1.一种小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR检测的引物序列，其特征在于所述弓I物序列包括由上游弓I物PPrV-YMl和下游弓I物PPrV-YM2组成的弓I物对，其序列分别为 AGGCAGCAAGCCGCAGA和TCCGGTGGTGTCGGATGTGT，或者所述引物序列包括由上游引物的互补序列TCCGTCGTTCGGCGTCT和下游引物的互补序列AGGCCACCACAGCCTACACA组成的引物对。
2.根据权利要求I所述的小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR检测的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物PPrV-YMl位置向3’端方向延伸10个碱基、向 5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列及互补序列。
3.根据权利要求I或2所述的小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR检测的引物序列，其特征在于所述引物序列包括由下游引物位置向3’端方向延伸10个碱基区、向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列及互补序列。
4.一种小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR检测的探针序列，其特征在于所述的探针PPrV-YMp序列为CCTGTTTACCGCTGGCGTCTCCG，或其互补序列 GGACAAATGGCGACCGCAGAGGC。
5.根据权利要求4所述的小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR检测的探针序列，其特征在于所述的探针序列包括由探针PPrV-YMp向3’端方向延伸10个碱基区和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及互补序列。
全文摘要
本发明提供了一种小反刍兽疫疫苗株病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和探针序列，所述引物序列包括由上游引物PPrV-YM1和下游引物PPrV-YM2组成的引物对，其序列分别为AGGCAGCAAGCCGCAGA和TCCGGTGGTG TCGGATGTGT，或者所述引物序列包括由上游引物的互补序列TCCGTCGTTCGGCGTCT和下游引物的互补序列AGGCCACCACAGCCTACACA组成的引物对。探针PPrV-YMp序列为CCTGTTTACCGCTGGCGTCTCCG，或其互补序列GGACAAATGGCGACCGCAGAGGC。本发明具有结果可靠和准确灵敏、操作简单、省时省力、降低检测成本，提高检查效率等优点，特别适合大规模样品的快速检测以及紧急疫情的快速诊断。
文档编号C12Q1/68GK102586483SQ20121005168
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者吕建强, 孙洁, 廖立珊, 张彩虹, 曹琛福, 曾少灵, 杨俊兴, 花群义, 阮周曦, 陶虹 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心