一种小反刍兽疫病毒HN蛋白抗原表位肽H362及其确定、制备方法和应用与流程

本发明属于生物信息学和免疫学技术领域，具体涉及一种小反刍兽疫病毒hn蛋白抗原表位肽h362及其确定、制备方法和应用。

背景技术：

小反刍兽疫病毒(pprv)属于麻疹病毒属(morbillivirus)，是引起山羊和绵羊等小反刍动物急性传染病的病原，该病特点是高发病率和高死亡率，被世界动物卫生组织(oie)列为法定报告动物传染病，我国将其列为i类动物疫病。最初的报道小反刍兽疫病毒仅感染山羊和绵羊，但近几年病毒种间传播的病例被不断报道，目前该病主要分布于非洲和亚洲，正威胁欧洲。

目前，该病的主要预防手段是弱毒疫苗免疫，但是该疫苗存在热稳定性和毒力反强等问题，并且不利于小反刍兽疫的全球消灭计划。hn是镶嵌在pprv囊膜上的糖蛋白，构成病毒粒子表面的纤突。hn蛋白能够与淋巴细胞上的slam受体相互作用介导病毒入侵，因此hn蛋白的决定宿主嗜性。另外，因受体slam是主要部分与淋巴细胞等免疫细胞上，可能是小反刍兽疫病毒导致机体免疫抑制的主要原因。小反刍兽疫病毒能引起机体强烈的细胞免疫和体液免疫应答，而hn蛋白则是主要的保护性抗原。hn蛋白是疫苗设计和检测方法建立的重要靶标。因此，hn蛋白的抗原表位图谱绘制和抗体制备具有重大意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种小反刍兽疫病毒hn蛋白抗原表位肽。

本发明的另一目的在于提供该小反刍兽疫病毒hn蛋白抗原表位肽h362在小反刍兽疫病毒表位疫苗抗原和诊断试剂抗原制备中的应用。

本发明的另一目的在于提供该小反刍兽疫病毒hn蛋白抗原表位的确定、制备方法。

本发明采用的技术方案为：一种小反刍兽疫病毒hn蛋白抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列为h362:³⁶²eanwvvpstdvrdl³⁷⁵。

一种小反刍兽疫病毒hn蛋白抗原表位的确定、制备方法，所述方法包括如下步骤：

计算模拟：

步骤一，用分子模拟软件构建虚拟hn蛋白头部3d结构：利用discoverystudiov4.5对这两个目标蛋白——野毒株pprvhn和疫苗株pprvhn蛋白进行同源模建；其中pprvhw，genbank登录号为fj905304；pprvhv，genbank登录号：x74443；

步骤二，搜索模板：搜索pdb数据库(www.pdb.org)，寻找通过实验解析出的同源蛋白的结构，选择序列一致性在30％以上，并且比对序列较长的蛋白结构作为模板结构，进行后续的计算；

步骤三，调整序列比对：选取模板蛋白之后，从pdb数据库中获得蛋白的空间坐标，将得到的模板蛋白序列与目标蛋白进行比对；

步骤四，建模：将比对结果提交服务器，根据模板蛋白的空间坐标和序列的相似性推测结构，从而计算得到目标蛋白结构，即每次模建生成至少5个不同的目标蛋白结构，要求pdftotalenergy较低的同时选择dopescore最低的模型进行后续计算；

步骤五，优化：采用charmm力场，先进行steepestdecent优化5000步，再进行conjugategradient优化2000步；

步骤六，评估结构：采用拉氏构象图分析方法评估蛋白结构的合理性，若位于不许可区的非甘氨酸/脯氨酸所占比例不超过5％，则说明模拟的蛋白结构是合理的，可以进行后续的计算分析；

基于免疫信息学的预测：

步骤一，pprv-hn蛋白b细胞抗原表位预测：将pprvhn蛋白的氨基酸序列用iedb、immunomedicinegroup和bepipred免疫信息学分析软件进行分析，综合分析预测其b细胞抗原表位；

步骤二，抗原表位的合成：将软件预测的抗原表位氨基酸序列送genescript公司用多肽合成仪合成，合成后用高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，hplc)分析多肽合成的纯度及氨基酸的正确性；

单克隆抗体的制备：

步骤一，免疫动物：具有反应原性目的抗原rpprv-hn-f免疫6-8周龄雌性balb/c小鼠，颈背部皮下四点注射，免疫蛋白样品量为50μg/只，免疫体积200μl/只；首次免疫用等体积弗氏完全佐剂乳化，二次免疫和三次免疫用等体积弗氏不完全佐剂佐剂乳化；每隔14天免疫一次，三次免疫14天后小鼠断尾采血检测血清中的抗体，待抗体效价高1：10000后方可进行四免，四免不用佐剂，腹腔注射；

步骤二，细胞融合：小鼠抗体效价高于1:10000，第四次免疫小鼠，三天后制备小鼠脾淋巴细胞；小鼠麻醉后，去眼球采取小鼠外周血，用于分离血清，无菌摘取小鼠脾脏并研磨；将sp2/0细胞与小鼠脾脏细胞混合约1:5-1:10的比例混匀，800rpm离心4分钟弃上清，将细胞再次混匀，离心管放入40℃的去离子水中，在1分钟内均匀加入1ml聚乙二醇细胞融合剂，在5秒内加入1ml1640细胞培养液，并且再加入15ml1640细胞培养液，90秒由慢至快，终止融合反应；室温孵育10分钟，800rmp离心4分钟弃上清；用含有小鼠腹腔细胞的1640/20％fbs/hat培养基悬浮融合的细胞铺于96孔板中，37℃，5％co2环境培养；

步骤三，杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化：融合细胞培养14天后对阳性细胞株进行筛选，将rpprv-hn-f蛋白包被酶标板用间接elisa法检测细胞培养液；选择间接elisa法检测阳性孔，再用间接免疫荧光检测与小反刍兽疫病毒的反应原性；选取免疫荧光检测阳性孔进行亚克隆；用终点稀释法获取阳性单克隆细胞株；将免疫荧光检测阳性孔用1640培养液悬浮移入1.5ml离心管中，细胞计数板对阳性细胞孔内的细胞计数，将细胞的浓度调整到0.5-2个/μl，再用1460/20％fbs/ht细胞培养液将细胞稀释到1个/100μl，铺于96孔细胞培养板中，每孔100μl1460/20％fbs/ht细胞培养液；最后，在加入含有小鼠腹腔细胞的1460/20％fbs/ht培养液100ml；14天后，用同样的方法筛选阳性细胞株，如无阳性单克隆细胞株，继续对阳性孔进行亚克隆直到获得阳性单克隆细胞株；采用有限稀释法筛选分泌预定特异性单克隆抗体的细胞；采用间接elisa和免疫荧光筛选产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞；最后对所需的阳性杂交瘤细胞进行克隆扩增；

步骤四，单克隆抗体亚型与效价测定：

按照单克隆抗体亚型检测试剂盒的说明书检测亚型；

加样：将阳性单克隆细胞株细胞上清加入酶标板样品孔中，每孔50μl，无需孵育；

加酶标抗体：将羊抗鼠1×igm+igg-hrp稀释液加入酶标板样品孔中，每孔50μl，混匀；

孵育：加盖封板膜，室温孵育1个小时；

洗涤：去除液体，用pbst洗涤3次，每次2分钟，甩干；

显色：将配好的显色液加入样品孔，每孔100μl；

孵育：将加好显色液的酶标板置于避光环境，室温20分钟；

终止：加入终止液，每孔100μl；

读取：读取od450或者眼观，颜色最深或者od值最高的即为相应的亚型；

结果：10e3单克隆抗体的亚型为igg2b；

用间接elisa方法对阳性单克隆细胞株细胞上清进行抗体效价测定，以sp2/0细胞上清作为阴性对照，临界值为阴性对照+2sd，效价为1:800；

步骤五，单克隆抗体批量制备

对获得的阳性单克隆细胞株进行扩大培养，收集细胞和培养基，将细胞以腹腔注射的方式注入到成年母鼠腹腔培养，约7天后收集小鼠的腹腔液。

表位的鉴定：

预测的表位经过生物合成，鉴定符合实验要求，使用氨基化酶标板作为固相载体的间接elisa方法进行；

稀释：将合成并冻干的表位肽用高压过的去离子水稀释成1μg/μl；

表位肽包被：将稀释好的表位肽包被在氨基化酶标板上，每孔50μl包被液，抗原的含量为5μg，4℃过夜；

洗板：将酶标孔里的液体尽可能甩尽，然后每孔加入约250μlpbst，静置3分钟，重复三次，最后将酶标板在纱布上拍干；

封闭：向酶标孔中加入1×封闭液150μl，37℃温箱孵育1.5小时后，将酶标孔里的封闭液尽可能甩尽，最后将酶标板在纱布上拍干后备用；

孵育一抗：用封闭液将单克隆抗体按1:500稀释，加入酶标板每孔50μl，放置37℃温箱中孵育1小时；

洗板：同上步洗板；

孵育二抗：用封闭液将hrp标记抗鼠igg二抗按1:5000稀释，加入酶标板每孔50μl，放置37℃温箱中孵育1小时；

洗板：同上步洗板；

显色：每孔加入50μltmb显色液，避光37℃孵育15分钟；

终止：每孔加入50μl终止液，终止显色；

读取：用终点法在波长450nm处对酶标板进行检测，读取od450nm吸光度值。

本发明的有益效果：

在veroe6细胞接种小反刍兽疫病毒，检测单克隆抗体与小反刍兽疫病毒的反应原性以及抗体的特异性。结果显示，单克隆抗体10e3(图1左侧部分)与vero细胞中的小反刍兽疫病毒反应，表现较强的绿色荧光，不与vero细胞反应没有荧光(图1右侧部分)；sp2/0细胞培养基不与vero细胞中的小反刍兽疫病毒反应(图1中间部分)，没有荧光。表明，单克隆抗体小反刍兽疫病毒的特异性抗体。用western-blotting方法对获得的单克隆抗体10e3进行了基于原核表达纯化rpprv-hn-f蛋白的特异性检测，空载体表达菌作为阴性对照，结果显示rpprv-hn-f蛋白泳道出现单一条带，而空载体表达菌泳道没有条带(图2)，表明单克隆抗体与rpprv-hn-f蛋白具有良好的反应原性，并且不与空载体表达菌反应。利用discoverystudiov4.5预测了小反刍兽疫病毒nigeria75/1毒株hn蛋白的头部结构(图3)，结合免疫信息学预测hn蛋白的b细胞表位，确定候选表位h362(图3蓝色部分)，人工合成高纯度短肽。应用氨基化酶标板检测了候选表位与单克隆抗体10e3(图4)，确立了10e3对应的抗原表位h362。

附图说明

图1为荧光检测10e3单克隆抗体和rpprv-hn-f多克隆抗体与小反刍兽疫病毒的反应原性与特异性；

图2为10e3单克隆抗体与rpprv-hn-f蛋白的反应原性；

图3为候选表位h362在pprv-hn结构上的位置；

图4为单克隆抗体10e3间接elisa检测hn蛋白抗原表位h362反应原性。

具体实施方式

本发明所述的一种小反刍兽疫病毒hn蛋白抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列为h362:³⁶²eanwvvpstdvrdl³⁷⁵。

本发明抗原表位的确定、制备方法，方法包括如下步骤：

计算模拟：

步骤一，用分子模拟软件构建虚拟hn蛋白头部3d结构：利用discoverystudiov4.5对这两个目标蛋白——野毒株pprvhn和疫苗株pprvhn蛋白进行同源模建；其中pprvhw，genbank登录号为fj905304；pprvhv，genbank登录号：x74443；

步骤二，搜索模板：搜索pdb数据库(www.pdb.org)，寻找通过实验解析出的同源蛋白的结构，选择序列一致性在30％以上，并且比对序列较长的蛋白结构作为模板结构，进行后续的计算；

步骤三，调整序列比对：选取模板蛋白之后，从pdb数据库中获得蛋白的空间坐标，将得到的模板蛋白序列与目标蛋白进行比对；

步骤四，建模：将比对结果提交服务器，根据模板蛋白的空间坐标和序列的相似性推测结构，从而计算得到目标蛋白结构，即每次模建生成至少5个不同的目标蛋白结构，要求pdftotalenergy较低的同时选择dopescore最低的模型进行后续计算；

步骤五，优化：采用charmm力场，先进行steepestdecent优化5000步，再进行conjugategradient优化2000步；

步骤六，评估结构：采用拉氏构象图分析方法评估蛋白结构的合理性，若位于不许可区的非甘氨酸/脯氨酸所占比例不超过5％，则说明模拟的蛋白结构是合理的，可以进行后续的计算分析；

基于免疫信息学的预测：

步骤一，pprv-hn蛋白b细胞抗原表位预测：将pprvhn蛋白的氨基酸序列用iedb、immunomedicinegroup和bepipred免疫信息学分析软件进行分析，综合分析预测其b细胞抗原表位；

步骤二，抗原表位的合成：将软件预测的抗原表位氨基酸序列送genescript公司用多肽合成仪合成，合成后用高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，hplc)分析多肽合成的纯度及氨基酸的正确性；

单克隆抗体的制备：

步骤一，免疫动物：具有反应原性目的抗原rpprv-hn-f免疫6-8周龄雌性balb/c小鼠，颈背部皮下四点注射，免疫蛋白样品量为50μg/只，免疫体积200μl/只；首次免疫用等体积弗氏完全佐剂乳化，二次免疫和三次免疫用等体积弗氏不完全佐剂佐剂乳化；每隔14天免疫一次，三次免疫14天后小鼠断尾采血检测血清中的抗体，待抗体效价高1：10000后方可进行四免，四免不用佐剂，腹腔注射；

步骤二，细胞融合：小鼠抗体效价高于1:10000，第四次免疫小鼠，三天后制备小鼠脾淋巴细胞；小鼠麻醉后，去眼球采取小鼠外周血，用于分离血清，无菌摘取小鼠脾脏并研磨；将sp2/0细胞与小鼠脾脏细胞混合约1:5-1:10的比例混匀，800rpm离心4分钟弃上清，将细胞再次混匀，离心管放入40℃的去离子水中，在1分钟内均匀加入1ml聚乙二醇细胞融合剂，在5秒内加入1ml1640细胞培养液，并且再加入15ml1640细胞培养液，90秒由慢至快，终止融合反应；室温孵育10分钟，800rmp离心4分钟弃上清；用含有小鼠腹腔细胞的1640/20％fbs/hat培养基悬浮融合的细胞铺于96孔板中，37℃，5％co2环境培养；

步骤三，杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化：融合细胞培养14天后对阳性细胞株进行筛选，将rpprv-hn-f蛋白包被酶标板用间接elisa法检测细胞培养液；选择间接elisa法检测阳性孔，再用间接免疫荧光检测与小反刍兽疫病毒的反应原性；选取免疫荧光检测阳性孔进行亚克隆；用终点稀释法获取阳性单克隆细胞株；将免疫荧光检测阳性孔用1640培养液悬浮移入1.5ml离心管中，细胞计数板对阳性细胞孔内的细胞计数，将细胞的浓度调整到0.5-2个/μl，再用1460/20％fbs/ht细胞培养液将细胞稀释到1个/100μl，铺于96孔细胞培养板中，每孔100μl1460/20％fbs/ht细胞培养液；最后，在加入含有小鼠腹腔细胞的1460/20％fbs/ht培养液100ml；14天后，用同样的方法筛选阳性细胞株，如无阳性单克隆细胞株，继续对阳性孔进行亚克隆直到获得阳性单克隆细胞株；采用有限稀释法筛选分泌预定特异性单克隆抗体的细胞；采用间接elisa和免疫荧光筛选产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞；最后对所需的阳性杂交瘤细胞进行克隆扩增；

步骤四，单克隆抗体亚型与效价测定：

按照单克隆抗体亚型检测试剂盒的说明书检测亚型；

加样：将阳性单克隆细胞株细胞上清加入酶标板样品孔中，每孔50μl，无需孵育；

加酶标抗体：将羊抗鼠1×igm+igg-hrp稀释液加入酶标板样品孔中，每孔50μl，混匀；

孵育：加盖封板膜，室温孵育1个小时；

洗涤：去除液体，用pbst洗涤3次，每次2分钟，甩干；

显色：将配好的显色液加入样品孔，每孔100μl；

孵育：将加好显色液的酶标板置于避光环境，室温20分钟；

终止：加入终止液，每孔100μl；

读取：读取od450或者眼观，颜色最深或者od值最高的即为相应的亚型；

结果：10e3单克隆抗体的亚型为igg2b；

用间接elisa方法对阳性单克隆细胞株细胞上清进行抗体效价测定，以sp2/0细胞上清作为阴性对照，临界值为阴性对照+2sd，效价为1:800；

步骤五，单克隆抗体批量制备

对获得的阳性单克隆细胞株进行扩大培养，收集细胞和培养基，将细胞以腹腔注射的方式注入到成年母鼠腹腔培养，约7天后收集小鼠的腹腔液。

表位的鉴定：

预测的表位经过生物合成，鉴定符合实验要求，使用氨基化酶标板作为固相载体的间接elisa方法进行；

稀释：将合成并冻干的表位肽用高压过的去离子水稀释成1μg/μl；

表位肽包被：将稀释好的表位肽包被在氨基化酶标板上，每孔50μl包被液，抗原的含量为5μg，4℃过夜；

洗板：将酶标孔里的液体尽可能甩尽，然后每孔加入约250μlpbst，静置3分钟，重复三次，最后将酶标板在纱布上拍干；

封闭：向酶标孔中加入1×封闭液150μl，37℃温箱孵育1.5小时后，将酶标孔里的封闭液尽可能甩尽，最后将酶标板在纱布上拍干后备用；

孵育一抗：用封闭液将单克隆抗体按1:500稀释，加入酶标板每孔50μl，放置37℃温箱中孵育1小时；

洗板：同上步洗板；

孵育二抗：用封闭液将hrp标记抗鼠igg二抗按1:5000稀释，加入酶标板每孔50μl，放置37℃温箱中孵育1小时；

洗板：同上步洗板；

显色：每孔加入50μltmb显色液，避光37℃孵育15分钟；

终止：每孔加入50μl终止液，终止显色；

读取：用终点法在波长450nm处对酶标板进行检测，读取od450nm吸光度值。

由图1可以明显看到，在veroe6细胞接种小反刍兽疫病毒，检测单克隆抗体10e3与小反刍兽疫病毒的反应原性以及抗体的特异性，结果显示，单克隆抗体10e3与vero细胞中的小反刍兽疫病毒反应，表现较强的绿色荧光(图1左侧部分)，不与vero细胞反应没有荧光(图1右侧部分)；sp2/0细胞培养基不与vero细胞中的小反刍兽疫病毒反应，没有荧光(图1中间部分)。表明，单克隆抗体小反刍兽疫病毒的特异性抗体。

由图2可以明显看到，10e3单克隆抗体与rpprv-hn-f蛋白具有良好的反应原性和特异性。

1：rpprv-hn-f蛋白泳道出现单一的条带，并且与预期的一致，说明单克隆抗体具有较好的反应原性；2：空载体宿主菌裂解物泳道没有出现条带，说明单克隆抗体具有良好的特异性。

由图3可以明显看到，图中蓝色部分是抗原表位h362，从3d结构中可以明显看出该表位位于抗原的表面较为突出的地方，这是该表位对应的抗体具有良好反应原性的重要原因。

由图4可以明显看到，用间接elisa方法检测抗原表位h362反应原性，单克隆抗体组检测的od450值极其显著与sp2/0细胞培养基组检测的od450值(p<0.00001)，表明该表位与单克隆抗体具有良好的反应原性。

经过以上方案鉴定的表位肽h362，为小反刍兽疫病毒表位疫苗抗原和诊断试剂抗原制备的研发提供了理论基础，对小反刍兽疫病毒的防治具有重大意义。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。