专利名称：一种抗菌蛋白has1编码基因的克隆、表达及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物产生的对植物病原菌存在抑菌活性的新抗菌蛋白，更具体地说，涉及一种来源于微生物的新抗菌蛋白的鉴定和应用。本发明是建立在生防菌株HAS对甘蔗黑穗病菌具有很好抑制作用的基础之上。
背景技术：
甘鹿黑穗病是由scitaminea Sydow.引起的一种真菌病害,属担子菌纲黑粉菌属。该病害最早是在1877年南非纳塔尔发现，随后在东半球的亚洲和非洲的大部分国家均有报道。1940年在美洲阿根廷发生，随后西半球也发生该病害。20世纪70-90年代，夏威夷、弗罗里达、摩洛哥、澳大利亚等国家、地区也相继有该病害发生的报道。中国于1932年在广州发现该病害，之后各地也都出现该病。特别是近年来，随着蔗种无性繁殖栽培技术的推广，蔗种频繁引进调运，蔗田长期连作同一品种以及宿根蔗年限的逐渐延长，造成甘蔗黑穗病在我国广西、云南、广东、福建、海南等省蔗区发生日趋严重，造成的损失多达10-30%,严重的宿根蔗几乎绝收。甘蔗黑穗病危害严重，但对其的防治效果不理想。生物防治因对环境友好和易于使用而在其它作物病害上已部分地发挥作用，但用于甘蔗黑穗病病害的防治一直停滞不前。国内外也有利用微生物对甘蔗黑穗病菌孢子进行作用的报道。国外，Sinha和Singh报道四种真菌應 moniliforme [Gibberella fujikuroi] var. subglutinans,Aspergillus ni ger, A. flavus and Penici 11 iums^·)对甘鹿黑穗病的黑鞭的产生和对冬孢子萌发的抑制作用。国内，广西大学廖咏梅等采集甘蔗苗期、生长期的甘蔗土壤、健株及病株的种蔗、叶、茎、芽、根和土壤中分离筛选到一些对黑穗病菌有抑制作用的菌株，并利用相关基因序列设计特异性引物，探讨得到相关抑制因子的基因。但未见用生物防治措施有效控制黑穗病的系统报道。迄今为止，尚未见到利用微生物及其生防制剂成功用于防治甘蔗黑穗病的相关报导。
发明内容
本发明目的在于提供一种抗菌蛋白编码基因HASl基因序列及其在防治甘蔗黑穗病方面的应用。为实现上述目的，本发明采取如下技术方案
一种抗菌蛋白编码基因HASl基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如
下
长度750bp
类型核酸 链型双链 形态线性
分子类型基因组DNA序列描述
ATGGCGAAACCACTATCAAAGGGGGGAATTTTGATGAAAAAAGTATTGATTGCAGGTGCAGTAGGAACAGCA
GTTCTTTTCGGAACCCTTTCATCAGGTATACCAGGCTTACCAGCGGCAGACGCTCAAGTCGCAAAAGCAGCATCCCA
GCTGCCTAACGGAATCGGCGGCCGTGCCTACCTGAACAGTACGGGCGCCGTTTTTACAGCTAAAATCACGCTTCCTG
AAACTGTCAAAAATAACGACTCGGTCTCTACTCCCTATATTTATTCAGGCTTTAGGGCATCAAGCGGAACTGAAGCC
GATATCGGGCTTCAGTACAGCAAACAATACAACGTCTGGAAGCCCCTCATGAAGGTTGGGTCCAAAAATGAAGAAAC
GTACATCGAAGGAAAAGATAAATTCACATACAATAAAGGCTTCCGCCCTGGAAGCACAGTCCAAATGACAATCTATA
AAAATTTAAGCGGCAATACGCGCATGACCCTTTGGGGAACGAACAATGACGGCTACACCGGAAGGATTATCACAGAA
ATTCAAGGAACCAACATCGGCACGATTTCAAAATGGAAAACCCTTGCTACCGCGGCTGTTTCGTATGAAAGCCAGCG
TGATGCGATCAAAGCAACCTTTTCGACATCTTTTAACAACATCACAATCGACAATAAAGCCGTCACTCCTGTGGTAG
ATACACAGGATTTCGCAAAGGTTTCAGTTGCAGGAAATAACGTTACGATCTCTGTTAATAAAo所述的抗菌蛋白编码基因HASl基因序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，具体如下
长度250 类型氨基酸 链型单链 形态线性 分子类型蛋白 序列描述
MAKPLSKGGILMKKVLIAGAVGTAVLFGTLSSGIPGLPAADAQVAKAASQLPNGIGGRAYLNSTGAVFTAKITLPETVKNNDSVSTPYIYSGFRASSGTEADIGLQYSKQYNVWKPLMKVGSKNEETYIEGKDKFTYNKGFRPGSTVQMTIYKNLSGNTRMTLWGTNNDGYTGRIITEIQGTNIGTISKWKTLATAAVSYESQRDAIKATFSTSFNNITIDNKAVTPVVDTQDFAKVSVAGNNVTISVNK。一种原核表达载体，它含有上述抗菌蛋白编码基因HASl的基因序列。所述抗菌蛋白编码基因HASl基因序列在防治甘蔗黑穗病方面的应用，及在转基因作物育种中的应用。本发明在研究微生物对甘蔗黑穗病进行生物防治时，成功分离到一株对甘蔗黑穗病菌有较好抑制作用和防治效果的生防菌株，命名为枯草芽孢杆菌(Mcillus sub tills )HAS，已于2012年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号；保藏编号=CGMCC NO. 6590。本发明所提供的枯草芽孢杆菌HAS菌株，分离自我国海南省蔗区的甘蔗根际土壤，经形态学、培养性状、常规生理生化和16S rDNA序列鉴定，该菌株为枯草芽孢杆菌心subti I is)的一个新菌株，命名为枯草芽孢杆菌UaciJAz1Ssubtilis)WkS0本发明所提供的枯草芽孢杆菌(ifeci77i/5· subtilis)WkS的基本生物学特性为革兰氏阳性短杆菌，菌体大小约O. 7 O. 9X1. 8 2. 4 Mm之间，产生芽孢，芽孢中生，圆形，周生鞭毛、具运动性。在LB培养基上初期菌落浅白色，圆形，表面湿润，脓状，难挑起；后期菌落淡黄色，边缘不整，表面褶皱，挑起褶皱带起脓状丝。本发明通过对生防菌株HAS抑菌机理进行研究，成功分离到一种抗菌蛋白，并通过其氨基酸测序结果推到出其核苷酸序列，进行特异性表达引物的设计，获得了其全长基因编码序列。通过原核表达证明该编码基因表达的蛋白存在生物活性，通过网上比对，该编码基因序列同枯草芽孢杆菌基因组序列同源性达99%，是一个没有注释功能的编码基因序列，因此暂把该编码基因命名为HASl，新的抗菌蛋白命名为抗菌蛋白HASl。对于甘蔗黑穗病的防治，到目前为止还没有一种有效的防治措施，抗病育种被认为是一种最为有效的方法，但由于抗原材料的缺乏，进展缓慢。本发明的技术方案一是发现了一个新的抗菌蛋白，二是可以为今后的抗病育种提供一个新的抗原材料。
图1为抗菌蛋白HASl编码基因HASl的PCR扩增，图中M为Marker，1、2、3为PCR扩增产物；
图2为原核表达载体pET32a-HASl结构 图3为编码序列的网上比对结果，其结果表明该序列为枯草芽孢杆菌基因组序列的一部分，但没有注释功能，即是一个未知功能的序列；
图4为抗菌蛋白HASl编码基因HASl的原核表达，泳道I和2为空白载体；泳道3为Marker ;泳道4、5、6、7、8、9、10分别为加入IPTG诱导2、3、4、5、6、7、8h后的表达结果；
图5为表达产物对甘蔗黑穗病菌的抑制活性，左为原始表达载体表达后的产物(用作对照)，右为构建有HASl基因序列的表达载体表达广物；由图可看出在右侧的表达广物周围有一明显抑制甘蔗黑穗病菌的抑菌圈，而左侧的对照组没有，这充分说明该表达产物具有抑制甘蔗黑穗病菌的能力，具有生物抑菌活性；
图6为HASl蛋白的网上同已知毒蛋白的比对结果，其结果表明，HASl蛋白与已知的毒蛋白没有相似性，可以不经改造直接使用的蛋白；
图7为HASl蛋白同网上有致敏性蛋白的比对结果，结果表明该蛋白同致敏性蛋白的相似性为0，该蛋白没有致敏性；
图8为HASl蛋白同网上有抗营养因子的蛋白的比对结果，结果表明该蛋白没有抗营养因子的特性。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。实施例11、植物病原真菌拮抗菌的筛选及其鉴定
菌株筛选称取5克根际土壤(我国海南省临高县甘蔗黑穗病发生严重的地块中甘蔗植株的根际土壤)，放入有IOOml无菌水的三角瓶中，在摇床上剧烈振荡30min后，静置15min。取Iml稀释至10_4、10_5、10_6浓度梯度，从各浓度梯度悬浮液中取O. 1ml，用无菌涂棒涂于LB培养基(配方为每升含有蛋白胨10g， 酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂粉12g，pH7.0 7. 2)平板上，30°C恒温培养箱倒置培养，连续观察3天，挑取菌落形态不同的菌株再次划线纯化保存备用。在倒好的PDA平板表面涂布甘蔗黑穗病菌冬孢子，在超净工作台内晾干后，用无菌牙签点接筛选纯化后的菌株进行对峙培养，筛选抑菌作用最强(抑菌活性最强)的菌株，结果得到一株对甘蔗黑穗病菌有很强拮抗作用的菌株，将该菌株命名为枯草芽孢杆菌(feci77心HAS，其已于2012年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号=CGMCCNo. 6590。菌株HAS的基本生物学特性革兰氏阳性短杆菌，菌体大小约O. 7 O. 9 X1. 8 2.4 Mffl之间，产生芽孢，芽孢中生，圆形，周生鞭毛、具运动性。在LB培养基上初期菌落浅白色，圆形，表面湿润，脓状，难挑起；后期菌落淡黄色，边缘不整，表面褶皱，挑起褶皱带起脓状丝。菌株16S rDNA保守序列的测定将筛选得到的菌株(枯草芽孢杆菌UaciJAz1S仰办HAS)的基因组DNA为模板，以细菌16S rDNA序列通用引物P0、P6作为引物，PCR扩增出约1. 5kb左右的产物片段，测序结果表明扩增出的序列长度为1518个碱基；将该序列通过互联网比对(http: / /www. ncb1. nlm. nih. gov/blast/B last, cgi),扩增的片段序列与枯草芽孢杆菌的16S rDNA部分序列的同源性达98%以上，确定该菌株归属为枯草芽抱杆菌(也<^77心subtilis、。2、菌株HAS抑菌功能蛋白的分离
将菌株HAS在LB培养基平板上活化，然后接种于LB液体培养基中，在37°C恒温振荡培养箱中170rpm下培养36h，除菌体，在上清液中加入硫酸铵至硫酸铵饱和度80%，4°C冰箱内静置过夜后离心收集蛋白，用O. OlM PBS (磷酸缓冲液，pH7. O)溶解蛋白后将蛋白液分为两份，一份直接用来做抑菌试验，另一份100°C水浴30分钟后离心除去变性蛋白，做抑菌实验并进行PAGE电泳，结果经100°C水浴30分钟后的那份蛋白液同不经处理的蛋白液具有基本相同的抑菌作用，PAGE电泳后得到单一条带的蛋白带，将该蛋白带切下来后送去测序，得到一个同源性为58%的氨基酸序列，同时推导出其核苷酸序列。
3、抗菌蛋白HASl编码基因的克隆 通过网上比对，设计引物如下
HASF 5’ -TAAGGATCCATGGCGAAACCACTATCAAAG-3’
HASR: 5’ -GGAGAGCTCTTATTTATTAACAGAGATCG-3’
以菌株HAS基因组DNA为模板，扩增菌株HAS的抗菌蛋白HASl编码基因片段。预期扩增片段大小为750bp左右。PCR反应体系25 μ L，内含IOXbuffer (含1. 5 mmol/L Mg2+) 2. 5μ L, dNTPs(2. 5 mmol/L each) 2 μ L、HASF (10 μ mol/L) I μ L、HASR (10 μ mol/L)lyL、Taq 酶(5 U/μ L) 0· 15 μ L、模板 DNA IyUddH2O 17. 35 μ L。PCR 反应程序为94°C3min，94°C lmin,53°C 50s，72°C lmin，30 个循环，最后 72°C下延伸 lOmin。所得到的 PCR产物在1. 0%的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测，将得到的纯化PCR产物克隆到pMD-19T载体中，转入大肠杆菌DH5ci，挑阳性克隆并送上海生工生物有限公司测序。对测序结果序列进行分析，得到了抗菌蛋白HASl编码基因的全长序列，为一个750bp长片段的完整ORF阅读框，编码249个氨基酸，结果见图1和2。将该序列用BLAST 软件在线分析(http://www. ncb1. nlm. nih. gov/blast/Blast.cgi)进行同源性测定，以确定该编码序列的同源序列，同时寻找其有关序列的相关信息，比对结果见图3。经过比较其有关序列信息，该基因序列为枯草芽孢杆菌全基因组序列的一部分，同时该有关序列的信息表明，该基因是一段没有被注释功能的基因，表明该编码基因表达的产物可能是一个未注释功能的新的抗菌蛋白。4、抗菌蛋白HASl编码基因的原核表达及功能验证
提取阳性克隆质粒PMD19-T/HAS1，经及丽Y I和5^ I双酶切后电泳回收小片段，将实验室保存的原核表达载体pET32a质粒同样经及丽Y I和fee I双酶切后电泳回收大片段，使用连接试剂盒将得到的小片段和大片段进行连接、转化入大肠杆菌表达细胞BL2KDE3)，挑取阳性菌落，摇菌提取质粒进行酶切验证，将证实为阳性克隆的菌落接种于装有200ml新鲜无菌的LB液体培养基(内含Amp+50 μ mol/mL和IPTGO. 01 μ mol/mL)的三角瓶中进行扩大培养，在37°C恒温摇床上170rpm振荡培养8小时后离心除去菌体，加硫酸铵至80%饱和度，静置过夜后12000rpm离心收集蛋白，用2ml0. Olmol/L磷酸缓冲液(pH7. O)充分溶解，同时以转入表达载体pET32a的大肠杆菌表达细胞BL21 (DE3)的菌落的培养基收集蛋白为对照，在混有甘蔗黑穗病菌孢子的固体LB平板上，放置两个灭菌的牛津杯，分别加入上述收集到的两种蛋白液各100 μ L，在28°C恒温培养箱中培养72小时，做抑制甘蔗黑穗病菌的对峙培养试验。结果表明，加入抗菌蛋白HASl编码基因的原核表达产物的牛津杯周围出现明显的抑制圈，表明该蛋白液对甘蔗黑穗病菌有抑制活性，而对照组没有，这充分表明了抗菌蛋白的生物抑菌活性，结果见图4和5。5、抗菌蛋白HASl的毒理学分析
以OECD文件为参考，以抗菌蛋白HASl蛋白为目标，在NCBI中检索已知毒蛋白与其氨基酸相似性进行比较，其结果见图6。从图中可知，抗菌蛋白HASl为一个新的抗菌蛋白，其编码基因与已知的毒蛋白相似性极低，具有毒性的可能性极小。根据http://ambl. lsc. pku. edu. cn的资料，对抗菌蛋白HASl的致敏性进行评估，结果也没有发现与致敏序列相似的序列(No Signigicant Similarity was found)(http://ambl. lsc. pku. edu. cn),(见图 7)。
同样以OE⑶文件为参考，以抗菌蛋白HASl为目标，在NCBI中检索已知抗营养因子与其氨基酸相似性进行比较，其结果见图8。从图中可知，新的抗菌蛋白HASl编码的基因序列同已知的抗营养因子无相似性。综上分析可知，抗菌蛋白HASl为无毒、无过敏性、无抗营养因子的新型抗菌蛋白，因此其可以作为一种新的抗原材料用在转基因作物的育种上。
权利要求
1.一种抗菌蛋白编码基因HASl基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的抗菌蛋白编码基因HASl基因序列，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
3.一种原核表达载体，它含有权利I所述抗菌蛋白编码基因HASl的基因序列。
4.权利要求1所述抗菌蛋白编码基因HASl基因序列在防治甘蔗黑穗病方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗菌蛋白编码基因HAS1基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。该序列是以生防菌株HAS为研究对象，经过对其抑菌机理的研究得到的，然后以菌株HAS的基因组DNA为模板，并用特异性表达引物进行PCR法扩增得到其编码基因的全表达序列，随后构建了原核表达载体进行表达，并以甘蔗黑穗病菌为靶标进行了表达产物抑菌实验，结果表明其表达产物同样具有抗甘蔗黑穗病菌的能力，通过网上比对表明该抗菌蛋白是一种新的抗菌蛋白，编码该抗菌蛋白的基因序列可为今后的抗病育种提供新材料。
文档编号A01N47/44GK103031309SQ201210553669
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者熊国如, 伍苏然, 赵更峰, 冯翠莲, 张树珍 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所