专利名称：一种从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法
技术领域：
本发明涉及蛋白纯化技术，具体的说是一种从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法。
背景技术：
木质纤维素是世界上最丰富、最廉价的可再生资源，包括甘蔗渣、秸杆、玉米芯等。降解为单糖，发酵生产燃料乙醇被看做是对其最有效的利用方式之一。降低燃料乙醇的生产成本成为其发展的核心部分。到目前为止，许多策略都已经开发出来，其中以纤维素酶等为中心，旨在研发高效地木质纤维素糖化催化剂无疑是最有效的策略之一。随着技术的进步，越来越多参与木质纤维素降解的基因及相对应的水解酶，被分离和纯化出来。其中来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的多糖水解酶系复杂而完整,能够高效地降解木质纤维素为单糖。分离、纯化其中的各种组分，是研究其酶学性质，研发高效酶制剂的基础和前提。遗憾的是，关于这些酶组份的分离纯化，大都需要复杂的层析步骤或者只能分离其中的一类组份，如纤维素酶、β -木糖苷酶等，这不能满足协同性等，尤其是纤维素酶与木聚糖酶间协同性研究的需要。
发明内容
本发明的目在于提供一种从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法。为实现上述目的本发明 采用的技术方案为:一种从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法，将里氏木霉粗酶制剂溶解于20mMTris-HCl,pH7.0 缓冲液中，以 0.5M NaCl 在 0.8-1.2mL/min 的流速下，使用 Mono Q 5/50GL阴离子交换柱进行梯度分离，根据紫外吸收峰分别收集11.5-65.5min，70.5-75.7min,75.7-81.0min, 81.0-102.5min对应的洗脱组份，即为多糖水解酶，并分别将上述收集组分
进一步的纯化，将根据紫外吸收峰收集11.5-65.5min组分冻干后，溶于0.5_lmL超纯水中，以0.9-1.lmL/min的流速,使用凝胶过滤柱Superdex 75pg层析,收集51.5-55.5min对应的洗脱组份，即为外切葡聚糖酶II (CBH II);收集58.5-63.5min对应的洗脱组份，即为内切葡聚糖酶II (EG II)；将根据紫外吸收峰收集70.5-75.7min组分冻干后，溶于0.5_lmL超纯水中，以0.9-1.lmL/min的流速,使用凝胶过滤柱Superdex 75pg层析,收集47.5-51.0min对应的洗脱组份，即为木聚糖酶；收集53.0-61.5min对应的洗脱组份，即为内切葡聚糖酶I (EG I)；将根据紫外吸收峰收集75.7-81.0min冻干后，溶于0.5-lmL超纯水中，以
0.9-1.lmL/min的流速,使用凝胶过滤柱Superdex 200pg层析,收集68.5-74.5min对应的洗脱组份，即为木糖苷酶；收集77.0-82.5min对应的洗脱组份，即为β -葡萄糖苷酶(BGL)；将根据紫外吸收峰收集81.0-102.5min冻干后，溶于0.5-lmL超纯水中，以0.9-1.lmL/min的流速,使用凝胶过滤柱Superdex 75pg层析,收集52.5-62.5min对应的洗脱组份，即为外切葡聚糖酶I (CBH I)。将所述Mono Q 5/50GL阴离子交换柱以0.8_L 2mL/min的流速，使用20mMTris-HCl, pH7.0缓冲液预平衡，待用。将所述凝胶过滤柱Superdex 75pg和凝胶过滤柱Superdex 200pg，以0.9-1.lmL/min的流速，使用TBS预平衡，待用。所述TBS为50mMTris-HCl pH 7.5,150mM NaCl。所述将里氏木霉粗酶制剂为将里氏木霉培养于以I %水葫芦为唯一碳源的培养基中，而后采用饱和硫酸铵沉淀收集20% -60%饱和度得到沉淀，待用。所述I %水葫芦为唯一碳源的培养基成分=Mandel培养基中添加I %的水葫芦作为唯一碳源。本发明所具有的优点:本发明从粗酶混合物中分离多种单一酶组份方法简便，且得到较多水解酶组份，所纯化得到的七种单一酶组份均保持有活性
图1为本发明实施例提供的纯化七种来自里氏木霉的多糖水解酶的具体流程图。图2为本发明实施例提供的经阴离子交换层析后得到的洗脱图谱。图3为本发明实施例提供的经凝胶过滤层析后得到的洗脱图谱。本发明的目的、优点将结合实施例，参照附图、表进一步说明。
具体实施例方式本发明给出详细具体的分离纯化方法参见流程见图1。实施例1 从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法:1.粗酶制剂:将里氏木霉培养于以1%水葫芦为唯一碳源的培养基中，在30°C下培养7天后，使用硫酸铵沉淀上清中的纤维素酶，并收集20-60%饱和度沉淀的组份，经除盐、冻干后为粗酶制剂，待用。以I %水葫芦为唯一碳源的培养基为尿素，0.3g/L ； (NH4)2SO4,
1.4g/L ；KH2P04, 2g/L ；CaCl2,0.3g/L ；MgS04.7H20，0.3g/L ;蛋白胨，0.75g/L ;酵母提取物，0.25g/L ；FeS04.7H20, 5mg/L ；MnSO4.4H20,1.6mg/L ；ZnSO4.7H20,1.4mg/L ；CoCl2.7H20,20mg/L ;吐温 80,0.1% (v/v);水葫芦，10g/L。2.阴离子交换层析。将上述粗酶制剂溶于A液(A液为20mM Tris-HCl, pH7.0)中，使溶解于A液的粗酶制剂浓度大约为2mg/mL，使用0.45 μ M的滤器过滤,待用；室温下，以lmL/min的流速，将粗酶制上样于A液预平衡的Mono Q 5/50GL柱中，使用A液，以lmL/min的流速洗脱直至没有紫外吸收后为止，然后使用0.5M NaCl进行梯度洗脱。根据紫外吸收峰和出现的时间，分别收集11.5-65.5min,70.5-75.7min,75.7-81.0min,81.0-102.5min对应的洗脱组份，即为多糖水解酶，并分别指定为样品1、2、3和4，。置于-80°C冰箱30min后，转移至真空冷冻干燥机中，干燥24h(参见图2)。室温下，样品I溶于ImL超纯水中，然后以lmL/min流速上样于TBS (50mM Tris-HClpH 7.5,150mM NaCl)预平衡的凝胶过滤柱Superdex 75pg。收集51.5-55.5min对应的洗脱组份，即为外切葡聚糖酶II (CBH II);收集58.5-63.5min对应的洗脱组份，即为内切葡聚糖酶II (EG II)(参见图3A)；
室温下，样品2溶于ImL超纯水中，然后以lmL/min流速上样于TBS (50mM Tris-HClpH 7.5,150mM NaCl)预平衡的凝胶过滤柱Superdex 75pg。收集47.5-51.0min对应的洗脱组份，即为木聚糖酶；收集53.0-61.5min对应的洗脱组份，即为内切葡聚糖酶I (EG I)(参见图3B)；室温下，样品3溶于ImL超纯水中，然后以lmL/min流速上样于TBS (50mM Tris-HClpH 7.5,150mM NaCl)预平衡的凝胶过滤柱Superdex 200pg。收集68.5-74.5min对应的洗脱组份，即为木糖苷酶；收集77.0-82.5min对应的洗脱组份，即为β -葡萄糖苷酶(BGL)(参见图 3C)；室温下，样品4溶于ImL超纯水中，然后以lmL/min流速上样于TBS(50mM Tris-HClpH 7.5,150mM NaCl)预平衡的凝胶过滤柱Superdex 75pg。收集52.5-62.5min对应的洗脱组份，即为外切葡聚糖酶I (CBH I)(参见图3D)。将上述纯化后的七种纤维素水解酶降解不同的底物，通过DNS检测生成的还原糖浓度或405nm处吸收检测生成产物对硝基苯酚的浓度表征各组份活性(参见表I)，表明每一组份，均保持其多糖水解活性。表I
权利要求
1.一种从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法，其特征在于:将里氏木霉粗酶制剂溶解于20mM Tris-HCl, ρΗ7.0缓冲液中，以0.5Μ NaCl在0.8-1.2mL/min的流速下，使用Mono Q 5/50GL阴离子交换柱进行梯度分离，根据紫外吸收峰分别收集11.5-65.5min,70.5-75.7min, 75.7-81.0min，81.0-102.5min对应的洗脱组份，即为多糖水解酶，并分别将上述收集组分进一步的纯化， 将根据紫外吸收峰收集11.5-65.5min组分冻干后，溶于0.5_lmL超纯水中，以0.9-1.lmL/min的流速,使用凝胶过滤柱Superdex 75pg层析,收集51.5-55.5min对应的洗脱组份，即为外切葡聚糖酶II (CBH II);收集58.5-63.5min对应的洗脱组份，即为内切葡聚糖酶II (EG II)； 将根据紫外吸收峰收集70.5-75.7min组分冻干后，溶于0.5_lmL超纯水中，以0.9-1.lmL/min的流速,使用凝胶过滤柱Superdex 75pg层析,收集47.5-51.0min对应的洗脱组份，即为木聚糖酶；收集53.0-61.5min对应的洗脱组份，即为内切葡聚糖酶I (EG I)； 将根据紫外吸收峰收集75.7-81.0min冻干后，溶于0.5-lmL超纯水中，以0.9-1.1mL/min的流速,使用凝胶过滤柱Superdex 200pg层析,收集68.5-74.5min对应的洗脱组份，即为β -木糖苷酶；收集TL 0-82.5min对应的洗脱组份，即为β _葡萄糖苷酶(BGL)； 将根据紫外吸收峰收集81.0-102.5min冻干后，溶于0.5_lmL超纯水中，以0.9-1.1mL/min的流速,使用凝胶过滤柱Superdex 75pg层析,收集52.5-62.5min对应的洗脱组份，即为外切葡聚糖酶I (CBH I)。
2.按权利要求1所述的从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法，其特征在于:将所述Mono Q 5/50GL 阴 离子交换柱以 0.8-1.2mL/min 的流速，使用 20mM Tris-HCl, pH7.0 缓冲液预平衡，待用。
3.按权利要求1所述的从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法，其特征在于:将所述凝胶过滤柱Superdex 75pg和凝胶过滤柱Superdex 200pg,以0.9-1.lmL/min的流速,使用TBS预平衡，待用。
4.按权利要求3所述的从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法，其特征在于:所述TBS为 50mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl。
5.按权利要求1所述的从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法，其特征在于:所述将里氏木霉粗酶制剂为将 里氏木霉培养于以1%水葫芦为唯一碳源的培养基中，而后采用饱和硫酸铵沉淀收集20% -60%饱和度得到沉淀，待用。
6.按权利要求5所述的从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法，其特征在于:所述1%水葫芦为唯一碳源的培养基成分=Mandel培养基中添加I %的水葫芦作为唯一碳源。
全文摘要
本发明涉及蛋白纯化技术，具体的说是一种从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法。将里氏木霉粗酶制剂溶解于20mM Tris-HCl，pH7.0缓冲液中，以0.5M NaCl在0.8-1.2mL/min的流速下进行Mono QTM5/50GL阴离子交换柱梯度洗脱，在线紫外监测蛋白，根据紫外吸收峰分别收集11.5-65.5min，70.5-75.7min，75.7-81.0min，81.0-102.5min对应的洗脱组份，即为多糖水解酶；所述多糖水解酶进一步的纯化得到外切葡聚糖酶II(CBH II)、内切葡聚糖酶II(EG II)、木聚糖酶、内切葡聚糖酶I(EG I)、β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酶(BGL)和外切葡聚糖酶I(CBH I)。本发明从粗酶混合物中分离多种单一酶组份方法简便，且得到较多水解酶组份，所纯化得到的七种单一酶组份均保持有活性。
文档编号C12N9/42GK103255117SQ20121005275
公开日2013年8月21日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年2月15日
发明者刘爱骅, 祁环, 梁波, 白罚利 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所